Summary
우리는 애기 장대 씨앗에서 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA)를 조립하는 절차를 제시한다. SCBA는 유전자와 체외에서 탐색 할 수있는 강력한 도구가 될 수 있도록 표시 방식 휴면 종자의 빛 신호에 대한 응답으로 배유 컨트롤 종자 발아. SCBA는 배유가 배아의 성장에 영향을 미칠 것으로 의심되는 모든 상황에서 적용 할 수있는 원리입니다.
Abstract
애기 장대의 배유는 성숙한 배아를 둘러싸고 휴면 종자의 발아 또는 (FR)까지 붉은 빛 펄스에 의해 조사 nondormant 씨의 방지에 필수적인 역할을하는 하나의 세포 층으로 구성되어 있습니다. 더 배유에 의해 가해지는 발아 억압적인 활동의 기초가되는 분자 유전 학적 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해, "종피 침구"분석 (SCBA)를 고안했다. SCBA 물리적 씨앗 코트의 기본 레이어에 태아의 성장을 확인할 수 있도록 해줍니다 씨앗에서 씨앗 코트와 배아를 분리하는 절개 절차입니다. 현저하게, SCBA 종자 휴면 종자 발아의 FR 의존 제어의 맥락에서 종피의 발아 억압 활동을 재구성한다. SCBA는 휴면 nondormant 및 유전자 변형 종자 코트와 배아 재료, 발아를 제어하는 유전자 경로의 조합 사용이 가능하며 특히 영업 이익 때문에배유 및 배아 erating 해부 할 수 있습니다. 여기서 세부 SCBA 조립 절차를 우리.
Introduction
애기 성숙한 종자, 종피가 종피, 산모 원 죽은 조직의 외부 층과, 배유, 직접 한 배아를 둘러싸고 살아있는 조직의 단일 셀 층으로 구성된다. 배유 및 배아는 별도의 수정 이벤트에서 파생 된 : 배아는 하나의 임산부와 한 아버지의 게놈 2 배체 조직 반면 배유는 임산부와 한 아버지의 게놈 2 개 배체 조직이다.
전통적 배유에 할당 된 주 기능은 영양 조직의 점이다. 그러나, 배유 또한 종자 발아를 제어하기위한 중심적인 역할을하는 것이 점차 명백 해지고있다. 이 개념은, 수면의 경우 새로 생성 된 씨앗에 의해 전시 특성 첫 번째 명백하게되었다. 휴면 종자 발아 유리한 조건의 존재에도 불구하고 발아하지 못한다. 씨앗은 숙성 기간 후 자신의 수면을 잃고 nondorman가유리한 발아 조건에 노출되었을 때 t, 즉, 그들은 발아합니다. 이 모델 식물 애기 장대를 포함한 많은 식물 종에서, 종피는 절대적으로 종피 제거 배아의 성장과 3,4 녹색화를 트리거 이후 휴면 종자의 발아를 방지하기 위해 필요합니다. 애기 장대에서 Bethke는 외. 발아 배유 5를 둘러싼 배젖을 유지하면서 종피를 제거한 후 남아 억압 된 것을 관찰했다. 이러한 관측은 강하게 배유 배아에 억압적인 활동을 발휘 종피 내에서 조직이라고 지적했다. 그러나, 시드 코트 제거 실험 반드시 종피 제공 발아 억압 활동의 본질을 명확히 않으며 구현 유전자를 식별하는 데 도움이되지 않는다.
우리는 최근에 씨앗 코트와 태아가 물리적으로 분리하지만 가까운 proxi에 보관 종피 침구 분석 (SCBA)를 도입Science AG로서는 배유 제공 억압 발아 활성은 6 유지되도록. SCBA는 휴면 nondormant 및 유전자 변형 종자 코트와 배아 재료의 조합 사용할 수 있습니다. 그 결과, 발아 구체적 배유 및 배아에서 동작을 제어하는 유전자 경로는 해부 될 수있다. SCBA는 배유 6의 성장을 억제하기 위해 배아으로 식물 호르몬 아브 산 (ABA)를 출시 것을 보여주기 위해 수면 상태의 맥락에서 사용되었다. 또한 우리는 수면을 촉진하는 신호 배유에서 작동 경로와 배아 조직을 식별 할 SCBA를 사용할 수 있습니다.
발아를 제어하는 배유의 역할은 더욱 작게 레드 (FR) 광의 펄스에 노출 nondormant 씨의 경우를 고려하여 강화 하였다. 초기 시드 imbibition에 FR 광 펄스는 발아 7,8을 억제하는 것으로 알려져있다. 종자 코트는 씨앗에서 FR 빛의 펄스를 제거 할 때강하게 배유도 nondormant 씨 (9)의 발아를 억제 할 수있는 제안, 발아를 억제 할 수 없습니다. 현저하게, SCBA는 발아의 FR-의존적 억제를 요점을 되풀이하는 데 사용할 수 있습니다. 이 종자 발아의 FR 의존 억제는 또한 배유 9 ABA 자료를 포함하는 과정입니다 것을 보여주기 위해 허용했다. 또한, SCBA는 배유 및 광 신호 9,10에 응답 nondormant 종자 발아를 제어하는 배아에서 동작 다른 광 신호 전달 경로를 식별 허용.
SCBA 종자 발아의 제어의 맥락에서 배유의 기능을 탐구 확실한 기술 할 수에 따라서 나타난다. 또한 발아를 제어하기 위해 의심되는 유전자가 배유, 배아 또는 두 조직에서 작동 여부를 시험 관내에서 평가하는 강력한 도구입니다. 여기에 디테일이 SCBA를 조립하는 데 필요한 여러 단계를 우리는.
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Protocol
SCBA가 조립되면, 배아의 성장은 며칠에 걸쳐 모니터링된다. 따라서 SCBA의 시드 절개 과정과 조립하기 전에, 하나는 배아 성장 종피 물질의 효과의 적절한 평가를 방지 할 수있는 미래의 오염을 피하기 위하여 종자를 살균 할 필요가있다.
1. 종자 소독
- 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 성숙하고 건조 애기 씨의 50 μl를 넣고 70 % 에탄올 용액을 제조.
- 종자를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에 70 % 에탄올 용액 1 ㎖를 추가하고 vortexer를 1,200 rpm에서 10 분 동안 실온에서 흔들.
- 3 초 동안 원심 분리기의 microcentrifuge 관은 4,000 XG에서 튜브의 바닥에 씨앗을 집중한다.
- 정중 microcentrifuge 관의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 이용하여 70 % 에탄올 용액을 대기음.
- t에 멸균 증류수 1 ㎖를 추가 그는 microcentrifuge 관은 여전히 씨앗을 포함.
- 1,200 rpm에서 10 분 동안 상온에서 흔들어.
- 3 초 동안 원심 분리기의 microcentrifuge 관은 4,000 XG에서 튜브의 바닥에 씨앗을 집중한다. 조심스럽게 튜브의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 사용하여 물에 뜨는 기음.
- 아직도 씨앗을 포함하는 microcentrifuge 관에 멸균 증류수 1 ㎖를 추가합니다. 물의 흐름을 균일하게 튜브 안에 씨앗을 일시 중단되었는지 확인합니다. 여기서의 목표는 씨앗의 무결성을 보존하도록 상기 흔들림이다.
- 씨앗은 30 초 동안 계속 튜브를 남겨 튜브의 바닥에 중력에 의해 아래로 정착하자. 조심스럽게 튜브의 하단에 씨앗을 떠나기 진공 흡인 팁을 사용하여 물에 뜨는 기음.
- 1.9 - 1.8 단계를 네 번 반복합니다. 전체 살균하는 데 약 30 분 소요됩니다.
2. 씨 도금
"ontent> 모든 후속 단계는 멸균 조건을 보존하기 위해 층류 캐비닛 내부에서 수행된다.- (N-모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES-KOH - 페트리 접시 플레이트 2.5 mM의 2에서 8.6 g / L 무라 시게 및 스쿡 배지를 함유하는 용액을 오토 클레이브에 의해 제조 발아 배지 30 ㎖를 함유하는 (100mm 직경, 20mm의 높이)를 준비 , 산도 5.7) 및 0.8 g / L 한천. 이 솔루션은 페트리 접시 접시에 붓는 전에 50 ° C의 물을 욕조에 진정하자.
- 씨앗이 들어있는 튜브에 멸균 증류수 200 μl를 추가합니다. 씨앗을 재현 탁하고 1 ㎖ 팁과 표준 피펫을 이용하여 발아 매체의 표면에 그들을 전송.
- 진공 흡인 팁을 이용하여 발아 매체의 표면에 씨앗을 둘러싼 물을 제거한다.
- 추가 건조를 위해 2 시간 동안 층류 캐비닛 내부의 뚜껑없이 씨앗을 포함하는 페트리 접시를 남겨주세요. 뚜껑을 페트리 접시를 닫고이 층류에서 서있게약 4 시간이 종자 소독 절차 (단계 1.2)의 개시 이후 통과되도록 약 90 분 동안 캐비닛 흐름.
3. 종자 해부
다음 단계는 층류 후드 캐비닛 내부에 배치 실체 작업 필요로. 뒤몽의 포셉 # 5립니다 (즉, 무딘) 팁을 크게 씨앗의 처리 (그림 1A)을 용이하게한다.
- 발아 배지 30 ㎖를 포함하는 새로운 배양 접시 접시를 준비합니다. 매체에 두 개의 병렬 직사각형 멸균 왓트 3MM 논문 (; 그림 1B, 1 단계 1.5 cm × 1.0 cm)의 표면에 장소. 와트 만 3MM 종이는 오토 클레이브 멸균된다.
- 멸균 포셉 (그림 1B, 2 단계)를 사용하여 와트 만 3MM 논문에 씨앗을 전송합니다.
- 부드럽게 절단 집게의 병렬 뭉툭한 팁을 (사용하여 종자를 눌러 와트 만 3MM 종이에 대한 개별 씨앗을 잡고
- (12.7 mm하기 x 예 : U100 인슐린 주사기 + 1 ML의 주사기, 0.33 mm (29 G)) 주사기 바늘을 사용하여 종자의 종피 (종피와 배유를) 잘라 (그림 1B, 4 단계). 애기 장대 종자의 모양은 타원형이며 그것은 자엽 (즉 멀리 급진적 끝에서) 작은 뿌리에 가입하는 장소에 가능한 한 가까운 긴 반 주축을 따라 종피를 절단하는 것이 좋습니다. 이는 절개 과정의 다음 단계에서 배아의 안전 방출을 돕는다.
- 절단 집게 (그림 1B, 5 단계)의 병렬 무딘 팁을 사용하여 와트 만 3MM 종이에 씨앗을 밀어 넣습니다. 이 단계는 3.4 단계 (그림 1B, 6 단계)에서 만든 구멍을 통해 종피 밖으로 배아를 해제합니다. 그것은 자엽의 끝이 작은 뿌리의 끝 부분에 가까운있는 씨앗 (즉, 멀리 FR의 강요를 적용하는 것이 좋습니다톰 개방).
4. 조립 종피 침구 분석 (SCBA)
종자 코트와 배아의 수의 적절한 선택을위한 설명을 참조하십시오.
- 발아 배지 30 ㎖를 포함하는 새로운 배양 접시 접시를 준비합니다. 매체의 표면에 놓으 나일론 메쉬의 멸균 사각형 조각 (3.5 cm x 5.0 cm) (그림 2, 1 단계).
- 손상을 피하기 위하여, 태아와 시드 코트 부드럽게 주사기 바늘 (도 2, 단계 2)를 사용하여 밀어 포셉 금속 가장자리의 표면으로 이동 될 수있다. 이식란과 나일론 메쉬 (그림 2, 3 단계)에 씨앗 코트.
- 씨앗 코트 최대한 근접하여 (그림 2, 4 단계)에 있는지 확인하고 무딘 집게와 바늘을 사용하여 종자 코트의 원형 단일 층을 조립합니다. 가능한 한 많이 노출하는 시도에 의해 생성 종피 개구위쪽 바늘. 이 단계는 체계적으로 테스트되지 않았습니다. 배아의 성장을 억제하는 확산 성 물질이 직접적으로 멀리에서 배아를 향해 확산 아닌 것으로 예상되기 때문에 그러나, SCBA의 효율을 높일 수있다.
- 4.3 단계에서 조립 종피 침대의 중앙에 원형의 단일 층 (그림 2, 5 단계)로 배아를 놓습니다. 배아 최대한 근접하게되어 있는지 확인합니다.
- 20 ~ 21 ℃에서 연속 광 (40 μmol / ㎡의 EC)에서 SCBAs을 품어 FR 펄스, 발아 체포 일반 조명 아래 SCBA 조립 한 바와 같이 FR 펄스 (9)을 적용하고 어둠 속에서 배양 접시를두고하는 데 사용되는 경우.
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Representative Results
이전 작업은 GA를 합성 할 수없는 돌연변이 종자 씨앗 (11, 12)에서 높은 ABA 축적의 결과로 발아 할 수 없음을 보여 주었다. 그것의 제거가 배아의 성장 (13)을 트리거하기 때문에, 발아 할 수없는이 씨 외투가 필요합니다. 이 강력 GA를 합성 할 수없는 종자의 배유가 배아의 성장을 차단하는 ABA를 발표합니다 지적했다. 따라서 우리는 GA와 ABA를 합성 할 수없는 씨앗 코트와 달리 SCBA에서 배아의 성장을 차단하는 GA를 합성 할 씨앗 코트가없는 것으로 예상된다. 여기에 우리가 사용 GA1-21 (솔크 삽입 라인 Salk_109115) GA 생합성 14 GA1에서 (SALK_109115 삽입 라인 (필수적이다 ENT-copalyl 인산 합성 효소를 코딩하는 GA1 유전자 (가입시 AT4G02780을) 중단 T-DNA 삽입을 들고 돌연변이 종자 골 생태형)는 솔크 신호 데이터베이스 (15) (에서 참조 http://signal.salk. 에듀 /).
이전 결과 13 일치, GA1-21 돌연변이 종자는 종자 imbibition 후 80 시간 (그림 3, 패널 1) 발아 할 수 없습니다. ABA (그림 3, 패널 3) 매체에 존재하지 않는 반면 이전 결과 13 더 일관성에서, 종피 제거는 GA1-21 배아 성장 (그림 3, 패널 2)가 발생.
그림 3의 패널 4 종 imbibition 후 80 시간을 촬영하고 80 GA1-21 씨 코트의 침대에 GA1-21 배아와 SCBA을 표시했다. 우리의 가설과 일치, GA1-21 돌연변이 종자 코트 GA1-21 태아의 성장을 차단.
이전 작업은 휴면 종자의 종피가 흡수 된에서 ABA의 축적을 촉진 GA-응답 DELLA 인자 RGL2의 구성 적 표현의 결과로 배아으로 ABA를 합성 해제 것으로 나타났다씨앗 6,11. GA 합성이 차단 된 조건에서 DELLA 인자 RGL2는 구조적으로 누적 ABA 축적 (11)를 추진하고 있습니다. RGL2의 부재와 GA1-21 씨 코트에서 ABA 합성 따라서 SCBA에 GA1-21 태아의 성장을 허용 할 것으로 예상된다. 우리가 코딩하는 유전자 Xanthosin 탈수소 효소 (AT1G52340)의 점 돌연변이 및 rgl2-14 T-DNA 삽입 선 (Salk_027654의 결과로서 ABA 합성 결실 aba2-1 돌연변이 체 대립 유전자 (골 생태형)를 사용이 가설을 시험하기 위하여, 코르 생태형) 16.
그림 1. 종자 해부 절차. A)도 종자 해부 용 절단 집게를 만드는 방법을 설명. 집게 가위 나 집게를 사용하여 절단 할 수 있습니다. 집게는 나란히 절단 팁 수오을 닫을 때. LD 커버 씨앗의 크기에 대한 표면 B) 1 단계 : 가로 직사각형 멸균 왓트 3MM 논문으로 두면이 MS 고체 배지를 포함하는 페트리 접시 접시에 배치됩니다. 2 단계 : 종자 4 시간 imbibition 후 와트 만 종이의 표면에 전사된다. 3 단계 : 해부 과정은 절단 집게를 사용 왓트 만 종이에 씨앗을 들고가 필요합니다. 단계 4 : 주사기 바늘 같이 종피를 절단하는 데 사용된다. 5 단계와 6 단계는 : 폐쇄 포셉 나란히 팁은 부드럽게 컷의 사이트를 통해 종자 코트의 배아를 밀어하는 데 사용됩니다.
그림 2. . 씨 외투 침구 분석의 조립을위한 절차 1 단계 : 나일론 메쉬의 사각형 조각이 MS 고체 배지를 포함하는 페트리 접시 접시에 배치됩니다. 2 단계와 3 : 해부 배아 및 종자 코트 부드럽게합니다나일론 메쉬로 그들을 전송하기 전에 주사기 바늘을 사용하여 집게의 가장자리로 이동. 4 단계와 5 : 씨앗 코트의 원형 단일 층을 조립하고 조립 종피 침대의 중앙에 원형의 단일 층으로 배아를 폐기하십시오.
그림 3. GA를 합성 할 수없는 씨앗 소재로 대표적인 결과. GA를 합성 할 수없는 GA1 (GA1-21) 돌연변이 씨앗에서 해부 씨의 코트와 배아를 사용하여 종자 코트 침구 분석. 종자 imbibition 후 그림 80 시간에 설명 된대로 패널 식물 재료를 보여줍니다.
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Discussion
여기에 설명 된 씨앗 코트 침구 분석 (SCBA) 절차는 원칙적으로 애기 장대 종자 발아가 차단 (또는 지연)와 배젖이 체포를 구현하기 위해 의심되는 모든 상황에 적용 할 수있다. 후자 종피 (종피 및 배유)를 제거하고 배아 종피 둘러싸여 때 상대 속도 배아 성장이 진행이 관찰한다는 관찰에 의해 입증 될 수있다. 발아는 특정 환경 물리적 매개 변수 (예를 들면 물 전위 또는 가벼운 질) 또는 특정 유전 적 배경에서 (GA1 돌연변이와 같이 GA 합성의 예 부재, 그림 3 참조)에 대한 응답으로 차단 될 수 있습니다.
씨앗 코트와 SCBA에 사용되는 배아의 수에 관한 더 일반적인 규칙은 없습니다. 이것은 시드 배치 (및 특히 그것의 선도)에 따라 실험의 분류가 수행 될. 그것은 adjus하는 것이 중요합니다매일 시드 코트의 침대에 배아의 성장을 모니터링하여 각각의 특정한 경우에 대한 해부 물질의 양을 t. 높은 휴면 애기 장대 생태형를 사용하는 경우에는 일반적으로 몇 가지 씨앗 코트가 필요합니다. SCBAs 조립시 성공적으로 사용 된 종자 코트와 배아의 전형적인 양의는 아래에 표시된 :
휴면 종자 소재 6 SCBA :
사용 10 배아 20 씨 코트 : * 갓 (즉, 휴면) 카보 베르데 아일랜드 생태형 (CVI) 수확.
* 갓 수확 란츠 베르크 (LER) 씨 : 사용 10 배아 80 씨 코트.
지베렐린 (GA)의 생합성 (그림 3)의 부재에 SCBA :
* GA1 돌연변이 씨 (컬럼비아 - 골 - 생태형) : 사용 10 배아 80 씨 코트.
사용 10 배 : 10 μM의 paclobutrazol 발아 매체 (GA 생합성의 억제)와 * 와일드 타입 골 씨앗의 100 씨앗 코트. 매체는 페트리 접시에 쏟아져 전에 50 ° C로 냉각 될 때 Paclobutrazol를 추가합니다.
SCBA까지 빨간색 (FR) 등 9의 펄스 후 :
* 12 배아와 100 종의 코트를 사용합니다.
SCBA 기술의 유일한 제한은 배아를 살해하지 않으면 서 신속하게 해부 시드 자료를 준비 할 수 있도록 그것은 인내와 손재주를 필요로한다는 것입니다. 경험이 풍부한 연구원은 20 ~ 30 분 이내에 100 마리를 해부 할 수 있습니다. 그러나, 경험이 적은 사용자는 1 시간이 필요하고 배아의 손상을 예상 할 수 있습니다. 우리의 상식으로 종자 발아의 컨트롤의 배젖의 역할을 탐구하는 대안 기술은 지금까지 없다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 교부금에 의해 제네바의 국가에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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