Summary
Nós apresentamos o procedimento para montar um ensaio da cama tegumento (SCBA) de Arabidopsis thaliana sementes. O ARA foi demonstrado ser uma ferramenta poderosa para explorar geneticamente e in vitro como a germinação de sementes de controlo do endosperma de sementes de dormentes e em resposta a sinais de luz. O SCBA é, em princípio, aplicável em qualquer situação em que se suspeita que o endosperma para influenciar o crescimento embrionário.
Abstract
O endosperma de Arabidopsis consiste de uma única camada celular em torno do embrião maduro e desempenha um papel essencial para prevenir a germinação de sementes dormentes ou que de sementes nondormant irradiados por um pulso de luz vermelho longínquo (FR). A fim de obter mais conhecimentos sobre os mecanismos genéticos moleculares subjacentes à atividade repressiva germinação exercida pelo endosperma, um ensaio de "semente da cama casaco" (ARA) foi inventado. O SCBA é um procedimento de dissecção separando fisicamente casacos de sementes e embriões de sementes, o que permite monitorar o crescimento de embriões em uma camada subjacente de tegumento. Notavelmente, o SCBA reconstitui a germinação atividades repressivas do tegumento da semente no contexto da dormência de sementes e controle de FR-dependente de germinação das sementes. Uma vez que o equipamento autônomo permite o uso combinatória de tegumento dormente, normais e sob geneticamente modificado e materiais embrionárias, os caminhos genéticos que controlam a germinação e, especificamente, operating no endosperma e embrião pode ser dissecado. Aqui detalhamos o procedimento para montar um autônomo.
Introduction
Na Arabidopsis, as sementes maduras, o revestimento de semente é composto do testa, a camada externa do tecido morto de origem materna, e o endosperma, uma camada única de células de tecido vivo, que rodeia o embrião 1. O endosperma e o embrião são derivadas de eventos de fertilização separadas: o endosperma é um tecido com duas triplóides materno e um genoma paterno enquanto que o embrião é um tecido com um diplóide materno e um genoma paterno 2.
A principal função tradicionalmente designado para o endosperma é a de um tecido nutritivo. No entanto, torna-se cada vez mais evidente que o endosperma também desempenha um papel central para controlar a germinação das sementes. Esta noção tornou-se aparente pela primeira no caso de dormência, uma característica exibida por sementes produzidos recentemente. Sementes dormentes não germinam apesar da presença de condições de germinação favoráveis. Sementes perdem sua dormência depois de um período de maturação e se tornar nondormant, ou seja, elas vão germinar quando expostos a condições favoráveis de germinação. Em muitas espécies de plantas, incluindo a planta modelo Arabidopsis, o tegumento é absolutamente necessário para impedir a germinação de sementes dormentes desde remoção do tegumento desencadeia o crescimento embrionário e greening 3,4. Na Arabidopsis, Bethke et al. Observou-se que a germinação permaneceu reprimida após a remoção do tegumento, mantendo o endosperma envolvente do endosperma 5. Estas observações indicaram nitidamente que o endosperma é o tecido no interior do revestimento de semente de exercer uma actividade repressiva sobre o embrião. No entanto, as experiências de remoção do tegumento não necessariamente ajudar a esclarecer a natureza da atividade repressiva germinação fornecido pelo tegumento nem identificar os genes que a implementam.
Recentemente, lançou um ensaio semente cama casaco (ARA), onde casacos de sementes e embriões são separados fisicamente, mas manteve em estreita proxidade, de modo que a actividade repressora germinação fornecida pelo endosperma é mantido 6. O SCBA permite o uso combinatória de tegumento dormente, nondormant e geneticamente modificada e materiais embrionárias. Como resultado, as vias genéticas que controlam a germinação e operando especificamente no endosperma e no embrião pode ser dissecado. O ARA foi utilizado no contexto de dormência para mostrar que o endosperma liberta o ácido abscísico fitohormona (ABA) em direcção ao embrião para reprimir o crescimento 6. Além disso, podemos usar a ARA para identificar as vias de sinalização que operam no endosperma e nos tecidos embrionários para promover a dormência.
O papel do endosperma para controlar a germinação foi reforçada por considerar o caso das sementes nondormant expostas a um pulso de longe vermelho (FR) de luz. Cedo após a embebição das sementes um pulso de luz FR é conhecido por inibir a germinação 7,8. Quando tegumento foram removidos a partir de sementes de um pulso de luz FRfoi incapaz de inibir a germinação, sugerindo fortemente que o endosperma também pode reprimir a germinação das sementes nondormant 9. Notavelmente, o ARA também poderia ser usado para recapitular dependente da FR inibição da germinação. Isto permitiu demonstrar que a inibição dependente da FR de germinação das sementes é também um processo que envolve a libertação a partir do endosperma do ABA 9. Além disso, o ARA permitiu identificar as diferentes vias de sinalização luminosa que operam no endosperma e no embrião para controlar a germinação das sementes nondormant em resposta a sinais de luz 9,10.
O ARA, por conseguinte, parece ser uma técnica de confiança para explorar a função do endosperma no âmbito do controlo de germinação de sementes. É também uma ferramenta poderosa para avaliar in vitro se os genes suspeitos de controlar a germinação operar no endosperma, o embrião ou de ambos os tecidos. Aqui detalhamos os vários passos necessários para montar um autônomo.
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Protocol
Uma vez que o ARA está montado, o crescimento dos embriões é monitorizado ao longo de vários dias. Portanto, antes do procedimento de dissecção sementes e montagem do equipamento autônomo, é preciso esterilizar as sementes, para evitar contaminações futuras que poderiam impedir a adequada avaliação do efeito do material de revestimento da semente no crescimento embrionário.
1. Esterilização Semente
- Despeje 50-60 ul de sementes de Arabidopsis maduros e secos num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e se preparar uma solução de etanol a 70%.
- Adicionar 1 ml de solução de etanol a 70% para o tubo de microcentrífuga contendo as sementes e agitar à temperatura ambiente durante 10 min a 1.200 rpm num agitador.
- Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrar as sementes no fundo do tubo.
- Aspirar a solução de etanol a 70%, utilizando uma ponta de sucção a vácuo deixando cuidadosamente as sementes no fundo do tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 1 ml de água destilada estéril para t ele tubo de microcentrífuga contendo ainda as sementes.
- Agita-se à temperatura ambiente durante 10 min a 1200 rpm.
- Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrar as sementes no fundo do tubo. Aspirar o sobrenadante de água utilizando uma ponta de sucção a vácuo deixando cuidadosamente as sementes no fundo do tubo.
- Adicionar 1 ml de água destilada, água estéril para o tubo de microcentrífuga contendo ainda as sementes. Certifique-se de que o fluxo de água de forma homogénea suspende as sementes no interior do tubo. O objectivo aqui é o de evitar a agitação adicional de modo a preservar a integridade das sementes.
- Deixe as sementes assentar por gravidade no fundo do tubo, deixando o tubo ainda durante 30 segundos. Aspirar o sobrenadante de água utilizando uma ponta de sucção a vácuo deixando cuidadosamente as sementes no fundo do tubo.
- Repita quatro vezes os passos de 1,8-1,9. Em geral, o procedimento de esterilização leva cerca de 30 minutos.
2. Semente chapeamento
ONTEÚDO "> Todas as etapas subseqüentes são realizadas dentro de uma câmara de fluxo laminar para preservar condições estéreis.- Prepara-se uma placa de Petri (100 mm de diâmetro, 20 mm de altura) contendo 30 ml de meio de germinação preparado por autoclavagem de uma solução contendo 4,3 g / L de meio de Murashige e Skoog a 2,5 mM de 2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES-KOH , pH 5,7) e 0,8 g / L de agar. Deixar a solução arrefecer num banho de água a 50 ° C antes de coloca-lo na placa de Petri.
- Adicionar 200 mL de água destilada estéril para o tubo contendo as sementes. Ressuspender as sementes e transferi-los na superfície do meio de germinação usando uma pipeta de padrão com uma ponta de 1 ml.
- Remover a água em torno das sementes na superfície do meio de germinação usando uma ponta de sucção a vácuo.
- Deixe a placa de Petri contendo as sementes, sem a tampa dentro da câmara de fluxo laminar para 2 horas para posterior secagem. Feche a placa de Petri com a tampa e deixe repousar sob a laminarfluir gabinete por cerca de 90 min para que cerca de 4 horas se passaram desde o início do processo de esterilização de sementes (passo 1.2).
3. Dissecção Semente
Os seguintes passos necessitam de trabalhar com um estereomicroscópio colocado no interior do armário de câmara de fluxo laminar. Uma pinça Dumont # 5 com pontas truncadas (isto é, sem corte) facilita grandemente o manuseamento das sementes (Figura 1A).
- Prepara-se uma nova placa de Petri contendo 30 ml de meio de germinação. Lugar na superfície do meio de duas estéreis papéis Whatman 3MM justapostas rectangulares (1.5 cm x 1,0 cm; Figura 1B, passo 1). Whatman 3MM papel é esterilizada em autoclave.
- Transferência de sementes nos papéis Whatman 3MM usando uma pinça estéril (Figura 1B, Passo 2).
- Segure uma semente indivíduo contra o papel Whatman 3MM, pressionando suavemente a semente usando as pontas sem corte justapostas dos fórceps truncadas (
- Cortar o revestimento de semente (testa e do endosperma) da semente, utilizando uma agulha de seringa (por exemplo, insulina U100 + seringa seringa de 1 ml, 0,33 mm (29 L) x 12,7 mm) (Figura 1B, passo 4). A forma de sementes de Arabidopsis é elipsoidal e recomenda-se para cortar a casca da semente ao longo das mais longas semi-eixo principais o mais próximo possível do local onde os cotilédones são unidas à radícula (ou seja, longe da ponta radical). Isto ajuda a libertação segura do embrião na fase seguinte do processo de esvaziamento.
- Empurre a semente contra o papel Whatman 3MM usando as pontas sem corte justapostas dos fórceps truncadas (Figura 1B, passo 5). Este passo liberta o embrião para o revestimento da semente através da abertura criada na etapa 3,4 (Figura 1B, passo 6). Recomenda-se aplicar a pressão sobre a semente em que a ponta dos cotilédones são em mais próximo da ponta da radícula (isto é, distância from a abertura).
4. Assembleia da tegumento Cama Assay (SCBA)
Veja a discussão para a escolha adequada do número de demãos de sementes e embriões.
- Prepara-se uma nova placa de Petri contendo 30 ml de meio de germinação. Lugar na superfície do meio de uma peça rectangular estéril (3.5 cm x 5,0 cm) de malha de nylon (Figura 2, passo 1).
- Para evitar danos, os embriões e os revestimentos de sementes podem ser transferidos para a superfície das bordas metálicas da pinça por suavemente empurrando-os utilizando a agulha da seringa (Figura 2, passo 2). Transferência de embriões e casacos de sementes sobre a malha de nylon (Figura 2, Passo 3).
- Montar uma camada circular e único de tegumento usando a pinça embotados e da agulha certificando-se de que o tegumento das sementes estão em proximidade, tanto mais perto possível (Figura 2, passo 4). Tente expor tanto quanto possível a abertura do revestimento de semente gerado pelaagulha para cima. Este passo não foi sistematicamente testada. No entanto, ele pode aumentar a eficiência da ARA desde são esperados substâncias difusíveis que inibem o crescimento do embrião de se difundir para fora directamente para o embrião em vez de fora a partir dele.
- Colocar os embriões como uma camada única circular no centro do leito de revestimento de semente montados no passo 4.3 (Figura 2, passo 5). Certifique-se de que os embriões estão em proximidade, tanto mais perto possível.
- Incubar as SCBAs sob luz contínua (40 mmol / m 2 s ec) a 20-21 ° C. No caso em que um impulso de RF é usado para prender a germinação, montar o ARA sob luz normal, aplica o impulso de RF, como descrito 9 e deixar uma placa de Petri em escuridão.
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Representative Results
Trabalhos anteriores mostraram que as sementes mutantes incapazes de sintetizar GA foram incapazes de germinar, como resultado da acumulação de alta ABA nas sementes 11,12. No entanto, a incapacidade de germinar requer a casca da semente, desde a sua remoção provoca embrionário 13 crescimento. Isto indica fortemente que o endosperma de sementes incapazes de sintetizar o GA está lançando ABA para bloquear o crescimento embrionário. Esperamos, portanto, o tegumento das sementes incapazes de sintetizar GA para bloquear o crescimento de embriões em um autônomo, ao contrário tegumento incapazes de sintetizar o GA e ABA. Aqui usamos GA1-21 (linha de inserção Salk Salk_109115) sementes mutantes portadores de uma inserção de T-DNA interrompendo o gene GA1 (adesão AT4G02780) que codifica ent-copalyl sintase difosfato, que é essencial para a biossíntese de GA 14 (SALK_109115 linha de inserção em GA1 (Col ecótipo) é referenciado na base de dados SALK sinal 15 ( http://signal.salk. Edu /).
Consistente com os resultados anteriores 13, GA1-21 sementes mutantes não conseguiu germinar 80 horas após embebição das sementes (Figura 3, Painel 1). Em contraste e mais consistente com os resultados anteriores 13, a remoção do revestimento de semente desencadeada GA1-21 o crescimento do embrião (figura 3, painel 2), a menos que ABA estava presente no meio (Figura 3, painel 3).
Painel 4 na Figura 3 foi tomada 80 horas após a embebição das sementes e mostra um autônomo com GA1-21 embriões em uma cama de 80 GA1-21 tegumento. De acordo com nossa hipótese, GA1-21 tegumento mutantes bloqueou o crescimento do GA1-21 embriões.
Trabalhos anteriores mostraram que, em sementes dormentes tegumento sintetiza e libera ABA para o embrião como resultado da expressão constitutiva da GA-resposta fator DELLA RGL2, que promove o acúmulo de ABA em embebidassementes 6,11. Em condições em que a síntese de GA é bloqueado o fator RGL2 DELLA constitutivamente acumula e promove a acumulação ABA 11. Portanto, é esperado Ausência de RGL2 e síntese ABA em GA1-21 tegumento para permitir o crescimento de GA1-21 embriões em um autônomo. Para testar esta hipótese utilizou-se o alelo aba2-1 mutante (ecótipo Col), deficiente na síntese de AAB, como resultado de uma mutação pontual no gene que codifica a desidrogenase Xanthosin (AT1G52340) e a linha de inserção rgl2-14 de T-DNA (Salk_027654, Col ecótipo) 16.
Figura 1. Processo para a dissecção de sementes. A) Diagrama descrevendo como fazer fórceps truncados para dissecção semente. Fórceps pode ser truncado com uma tesoura ou torquês. Quando a pinça está fechado o justapostos dicas truncadas shou. cobertura ld uma superfície do tamanho de uma semente B) Passo 1: dois lado a lado retangulares estéreis papéis Whatman 3MM são colocados em uma placa de Petri contendo meio MS sólido. Passo 2: as sementes são transferidas para a superfície dos papéis Whatman 4 hr após embebição. Passo 3: O procedimento requer a dissecção segurando a semente contra o papel Whatman utilizando a pinça truncadas. Passo 4: A agulha da seringa é utilizada para cortar o revestimento de semente, como mostrado. Passos 5 e 6: As dicas justapostas dos fórceps fechados são usados para empurrar cuidadosamente o embrião fora do tegumento através do site do corte.
Figura 2. . Procedimento para a montagem do ensaio semente cama casaco Passo 1: um pedaço retangular de malha de nylon é colocado em uma placa de Petri contendo meio MS sólido. Passo 2 e 3: dissecado embriões e casacos de sementes são delicadamentemudou-se para as bordas da pinça com a agulha da seringa antes de transferi-los para a malha de nylon. Passo 4 e 5: Montar uma camada circular e único de tegumento e descartar os embriões como uma única camada circular no centro da cama tegumento montado.
Figura 3. Os resultados representativos com material semente incapaz de sintetizar GA. Tegumento ensaios cama usando casacos de sementes e embriões dissecados de GA1 sementes (GA1-21) mutante, incapaz de sintetizar GA. Os pains de material vegetal, tal como descrito na figura 80 horas após embebição das sementes.
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Discussion
Procedimento O ensaio da cama tegumento (SCBA) aqui descrito é, em princípio, aplicável a qualquer circunstância em que a germinação de sementes de Arabidopsis é bloqueado (ou atrasado) e onde o endosperma é suspeito de implementar esta prisão. Este último pode ser evidenciada através da remoção do revestimento de semente (testa e do endosperma) e observando-se que os rendimentos de crescimento mais rápidas embrionárias relativos à observada quando os embriões são rodeados pelo revestimento da semente. A germinação pode ser bloqueado em resposta a determinados parâmetros físicos ambientais (por exemplo, potencial de água ou de qualidade de luz) ou em fundos genéticos específicos (por exemplo, ausência de síntese de GA como em mutantes GA1, ver Figura 3).
Não existem regras gerais relativas ao número de demãos de sementes e embriões a serem usados para um autônomo. Isto depende do lote de sementes (e em particular a sua frescura) e do tipo de experiência para ser realizada. Portanto, é fundamental para adjust a quantidade de material dissecado para cada caso particular, através da monitorização do crescimento sobre os embriões na cama de revestimentos de sementes, numa base diária. No entanto, geralmente alguns revestimentos de sementes são necessários quando ecótipos de Arabidopsis altamente dormentes são usados. Abaixo estão os valores típicos de casacos de sementes e embriões que foram usados com sucesso ao montar SCBAs:
SCBA com material dormente semente 6:
* Recém-colhida (ou seja dormente) ecótipo (IVC) Cabo Verde Island: Use 10 embriões e 20 casacos de sementes.
* Recém-colhida Landsberg (Ler) Sementes: Use 10 embriões e 80 casacos de sementes.
ARA na ausência de giberelina (GA) biossíntese (Figura 3):
* Sementes GA1 mutantes (Colômbia - Col - ecótipos): Use 10 embriões e 80 casacos de sementes.
* Tipo selvagem Col sementes com 10 mM paclobutrazol (um inibidor da biossíntese de GA), no meio de germinação: Use 10 embriãos e 100 casacos de sementes. Adicionar paclobutrazol, quando o meio é arrefecido a 50 ° C antes de se verter em placa de Petri.
SCBA após um pulso de longe vermelho (FR) luz 9:
* Use 12 embriões e 100 casacos de sementes.
A única limitação da técnica ARA é que ele requer paciência e habilidade, de modo a reunir rapidamente o material de semente dissecados enquanto não matar os embriões. Um pesquisador experiente pode dissecar 100 sementes dentro de 20-30 min. No entanto, os usuários menos experientes podem precisar de 1 hora e esperar danos embrionário. Para o nosso conhecimento, há até agora nenhuma técnicas alternativas para explorar o papel do endosperma para o controle da germinação das sementes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por concessões do National Science Foundation suíço e pelo Estado de Genebra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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