Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

أنثرالين كما مصفوفة لمصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين التصوير على تحويل فورييه ايون السيكلوترون الرنين مطياف الكتلة

Published: November 26, 2013 doi: 10.3791/50733
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Summary

أنثرالين (DT؛ 1،8 ثنائي هيدروكسي-9 ،10-dihydroanthracen-9-واحد) قد سبق وذكرت في شكل مصفوفة MALDI للتصوير الأنسجة من الجزيئات الصغيرة؛ البروتوكولات لاستخدام DT للتصوير MALDI من الدهون الذاتية على يتم توفير سطح أقسام الأنسجة التي كتبها إيجابية أيون MALDI-MS على دقة عالية جدا رباعي-FTICR الصك هنا.

Abstract

الطيف الكتلي التصوير (MSI) يحدد توطين وتوزيع الأنماط المكانية من المركبات على سطح قسم الأنسجة، وذلك أساسا باستخدام MALDI (مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين) القائم على التقنيات التحليلية. وهناك حاجة إلى مصفوفات جديدة للمشاريع الصغيرة جزيء MSI، والتي يمكن تحسين تحليل منخفضة الوزن الجزيئي (MW) مركبات،. وينبغي توفير هذه المصفوفات زيادة إشارات تحليلها، بينما تتناقص إشارات خلفية MALDI. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الأدوات عالية جدا دقة، مثل تحويل فورييه ايون سيكلوترون صدى (FTICR) الطيف الشامل، لديه القدرة على حل الحليلة إشارات من إشارات المصفوفة، وهذا يمكن التغلب على العديد من المشاكل المرتبطة جزئيا مع الخلفية مصدرها MALDI المصفوفة. الانخفاض في شدة مجموعات مصفوفة متبدل الاستقرار من قبل FTICR MS يمكن أيضا أن يساعد على التغلب على بعض التدخلات المرتبطة قمم مصفوفة على غيرها من الصكوك. عالية الدقةصكوك مثل الطيف الشامل FTICR هي مفيدة لأنها يمكن أن تنتج أنماط توزيع العديد من المركبات في وقت واحد في حين لا يزال توفير الثقة في هويات الكيميائية. أنثرالين (DT؛ 1،8 ثنائي هيدروكسي-9 ،10-dihydroanthracen-9-واحد) قد سبق وذكرت في شكل مصفوفة MALDI للتصوير الأنسجة. في هذا العمل، على هجين رباعي عالية جدا دقة وقدمت FTICR أداة بروتوكول لاستخدام DT لMALDI التصوير الدهون الذاتية من أسطح أقسام الأنسجة الثديية، من خلال إيجابية أيون MALDI إلى MS.

Introduction

الطيف الكتلي التصوير (MSI) هو تقنية تحليلية لتحديد توطين وتوزيع الأنماط المكانية من المركبات على سطح قسم الأنسجة 1،2. وقد استخدمت مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) MSI لتحليل الببتيدات والبروتينات لأكثر من عقد من الزمان، وكانت هناك تحسينات كبيرة في طرق تحضير العينة، حساسية الكشف، القرار المكانية، استنساخ ومعالجة البيانات 3،4. من خلال الجمع بين المعلومات من أقسام ملطخة تشريحيا والتجارب MSI، الأطباء قادرون على ربط توزيع مركبات معينة مع ميزات مثيرة للاهتمام pathophysiologically 5.

كما تم استجواب أنماط توزيع جزيئات صغيرة، بما في ذلك الأدوية الخارجية ونواتج تفاعلاتها 6،7 8-10 بواسطة MALDI MS-الأنسجة التصوير 11. الدهون هي ربما الأكثر دراسة القانون المدني على نطاق واسعSS من المركبات مع التصوير MALDI، سواء في MS 12-17 و MS / MS 18 وسائط. وقد تم استخدام MALDI MSI للتصوير جزيء صغير محدودة بسبب عدة عوامل: 1) المصفوفات MALDI هم أنفسهم جزيئات صغيرة (عادة م / ض <500)، والتي تولد إشارات أيون فيرة. هذه الإشارات وفيرة يمكن قمع التأين من analytes الصغيرة جزيء وتتداخل مع 19،20 الكشف عنها. الخالية من المذيبات مصفوفة طلاء 21، مصفوفة التسامي 22، ومصفوفة precoated MALDI MS 23، من بين أمور أخرى، وضعت لتحسين MSI جزيئات صغيرة.

المصفوفات الجديدة التي يمكن أن تحسن تحليل مركبات منخفضة ميغاواط ذات أهمية كبيرة في جزيء صغير MSI. وينبغي توفير هذه المصفوفات زيادة إشارات الحليلة مع إشارات مصفوفة انخفضت. في وضع إيجابي أيون، 2،5-dihydroxybenzoic حمض (DHB) وα-سيانو-4-hydroxycinnamic حمض (CHCA) هي التي تستخدم عادة اثنين من المصفوفات MALDI MS لMSI 24 22،25. وقد استخدمت 9-Aminoacridine لMSI من analytes بروتيتش في وضع إيجابي أيون 26 والنيوكليوتيدات والدهون الفوسفاتية في سلبية ايون وضع 26-29. تم العثور على 2-Mercaptobenzothiazole لإعطاء الكشف MALDI كفاءة من الدهون 30، واستخدمت لتصوير الدماغ الماوس gangliosides 31. قرار عالية جدا من تحويل فورييه ايون سيكلوترون صدى (FTICR) الطيف الشامل يمكن أن يخفف إلى حد ما حل هذه المشكلة عن طريق إشارات من إشارات الحليلة مصفوفة 32. ميزة أخرى لاستخدام FTICR-MS هو أن كثافة من كتل مصفوفة متبدل الاستقرار هي احمرارالطبعة 33، مما يقلل أيضا هذه التدخلات 27.

استخدام أنثرالين (DT؛ 1،8 ثنائي هيدروكسي-9 ،10-dihydroanthracen-9-واحد) في شكل مصفوفة MALDI للتصوير الأنسجة قد سبق وذكرت 34. في هذا العمل الحالية، يتم توفير بروتوكول مفصلة لاستخدام DT لMSI الدهون الذاتية على أسطح أقسام الأنسجة عدسة الأبقار، في وضع إيجابي أيون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الأنسجة باجتزاء

  1. فلاش تجميد العينات المسألة، مرة واحدة تحصد، وذلك باستخدام النيتروجين السائل، وشحنها على الثلج الجاف (إذا كنت بحاجة الشحن)، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء الأنسجة. (إذا تم استخدام العينات التجارية، وضمان أن يتم إعداد العينات في هذه الطريقة.)
  2. قطع الأجهزة إلى حجم معقول لتتناسب مع الهدف MALDI. تقليم قبالة أي الأجزاء غير المرغوب فيها من الجهاز. لهذه الدراسة وصفها هنا، والأرتيميا Decapsulated العدسات العجل البقري باستخدام الإجراء الموضح سابقا 35 قبل باجتزاء الأنسجة.
  3. إزالة الأجهزة كلها من الفريزر -80 درجة مئوية واصلاحها في الصعود إلى المرحلة المبردة قطع الأنسجة. لإصلاح عدسة العجل البقري، ومكان واحد أو اثنين قطرات من الماء على مراحل قطع الأنسجة من ناظم البرد. وضع العدسة بسرعة في الماء قبل أن يتصلب. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) مركبات يمكن استخدامها لإصلاح الأنسجة على خشبة المسرح القطع. إذا تم استخدام مركبات أكتوبر، مصغرةوينبغي تطبيق القانون النموذجي للتحكيم كمية من أكتوبر وينبغي توخي الحذر لضمان أن المقاطع قطع الأنسجة لن تكون ملوثة مركبات أكتوبر والتي يمكن أن تتداخل مع التأين والكشف عن التحاليل 5،36،37.
  4. تسمح درجة الحرارة داخل ناظم البرد لكي تتوازن إلى -18 درجة مئوية. درجات الحرارة الأكثر برودة أو دفئا يمكن استخدامها ليونة الأنسجة أو أصعب، على التوالي. ثم قطع الأنسجة استوائيا في 20 ميكرون شرائح سميكة. استخدام 10-15 ميكرون شرائح سميكة بالنسبة لمعظم الأنسجة، ولكن بسبب الطبيعة الهشة للأنسجة عدسة البقري، واستخدمت 20 ميكرون شرائح سميكة. لأنسجة عدسة الأبقار، تجاهل أقسام الأنسجة الأولى والوحيدة استخدام شرائح التي هي قريبة أو في الطائرة الاستوائية.
  5. إذا تم تصويرها على أنسجة عدسة العين، واستخدام 1.5 ميكرولتر من حمض الفورميك (98٪ في الطهارة، LC-MS الصف) لprewet سطح أكسيد الإنديوم والقصدير (ايتو) المغلفة شريحة زجاجية.
  6. نقل بعناية أقسام الأنسجة لسطح ايتو المشاركالزجاج ated شريحة مجهرية داخل ناظم البرد. وقسم الأنسجة ذوبان الجليد بسرعة وسوف تصبح الملصقة بإحكام على سطح الشريحة. عادة، أقسام الأنسجة المتعددة ويمكن تركيبه في الصعود إلى نفس الشريحة المغلفة ايتو في هذا السبيل.
  7. يجفد الشريحة لمدة 15 دقيقة قبل MALDI تطبيق المصفوفة.
  8. لاختبار المصفوفة، حل المصفوفات الفردية في المذيبات المناسبة. بقعة يدويا 1 ميكرولتر من كل حل مصفوفة على قسم الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بقعة صغيرة جزيء المعايرة القياسية على الأنسجة للتحقق من حساسية MALDI.
  9. إضافة ثلاثة علامات التدريس إلى شريحة زجاجية مغلفة ايتو عن طريق الكتابة على سطح نونكوندوكتيفي من شريحة زجاجية ايتو المغلفة مع قلم التصحيح السوائل. تأخذ الصورة البصرية من الشريحة الأنسجة باستخدام الماسحة الضوئية المسطحة وحفظه في شكل مناسب مثل شجار أو JPG.

2. طلاء مصفوفة

2.1. الآلي ماتريكس طلاء

  1. ا ف بحلول رقائق المصفوفة، والتي تحتوي على أسيتونتريل أو مختلطة الأسيتونيتريل / المياه، المذيبات، تلقائيا إلى أسطح أقسام الأنسجة باستخدام بروكر ImagePrep أو بخاخ مصفوفة إلكترونية مماثلة.
  2. تغطية حواف السطح الأمامي للشريحة زجاجية ايتو المغلفة مع الشريط بحيث المصفوفة لا معطف حواف الشريحة. وهذا يضمن أن علامات التدريس على سطح العكس يمكن استخدامها لمحاذاة الشريحة الأنسجة. لا تغطي حواف الشريحة مع مصفوفة أنها تستخدم كنقاط اتصال للحفاظ على التوصيل الكهربائي للشريحة ايتو المغلفة.
  3. معطف شريحة زجاجية باستخدام عشرين دورات طلاء مصفوفة (رذاذ 2 ثانية، 30 ثانية، الحضانة، و 60 ثانية وقت التجفيف لكل دورة).

2.2. دليل طلاء ماتريكس

  1. إذا المذيبات العضوية (مثل الكلوروفورم وخلات الإيثيل) التي تتعارض مع مواد تصنيع بخاخ مصفوفة الإلكترونية ل requiالحمراء، واستخدام بخاخ البخاخة هوائيا بمساعدة لتطبيق المصفوفة. إضافة حل مصفوفة على استعداد لخزان المذيب من بندقية البخاخة وتطبيق تدفق لطيف من غاز النيتروجين المضغوط لرئيس الرذاذ.
  2. تغطية حواف السطح الأمامي من الشرائح الزجاجية المغلفة مع ايتو الشريط بحيث المصفوفة لا معطف حواف الشريحة. وهذا يضمن أن علامات التدريس على سطح العكس يمكن استخدامها لمحاذاة الشريحة الأنسجة. لا تغطي حواف الشريحة مع مصفوفة أنها تستخدم كنقاط اتصال للحفاظ على التوصيل الكهربائي للشريحة ايتو المغلفة.
  3. بعد أن لوحظ بخاخ مستقرة وعلى ما يرام، رش مصفوفة يدويا بحيث تماما المعاطف قسم الأنسجة. تطبيق الحد الأدنى من الحل المطلوب لمصفوفة بالكاد تبلل السطح خلال كل دورة لمنع الممكن عدم تمركز تحليلها. بشكل عام، استخدم ما يقرب من 10 دورات من رذاذ مصفوفة لمعطف قسم الأنسجة، وعدد من الدورات هوتعتمد على نوع الأنسجة وتكوين مصفوفة.

3. MALDI MS

  1. إعداد محلول المعايرة الشامل عن طريق تمييع "ES ضبط ميكس" حل القياسية بعامل 1:200 في 60:40 الأيزوبروبانول: المياه (التي تحتوي على حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الخليط النهائي).
  2. إدخال 2 ميكرولتر / دقيقة من المخفف "ES ضبط ميكس" الحل في وضع مزدوج التأين electrospray (ESI) / MALDI مصدر أيون على مطياف الكتلة FTICR، من الجانب ESI.
  3. تعمل الأداة FTICR في وضع ESI إيجابية أيون، مع الكشف عن النطاق العريض وحجم الحصول على البيانات من 1،024 كيلو بايت / ثانية. المعلمات ESI النموذجية هي الجهد electrospray الشعرية، 3،900 V؛ رش الجهد الدرع، 3،600 V؛ الغاز البخاخات (N 2) التدفق، 2 لتر / دقيقة؛ الغاز الجاف (N 2) تدفق ودرجة الحرارة، 4 لتر ​​/ دقيقة و 200 درجة مئوية؛ المصفاة 1 الجهد، 15 V، وقت الرحلة (TOF)، 0.009 ثانية؛ الغاز الاصطدام (ع) التدفق، 0.4 لتر / ثانية؛ مصدر أيون تراكم الوقت، 0.1 ثانية؛والخلية الاصطدام أيون تراكم الوقت، 0.2 ثانية. ضبط المعلمات العملية FTICR من أجل تحقيق أقصى قدر من الحساسية التحليلية على نطاق شامل من م / ض 200 إلى 1،400، مع الحفاظ جيدة الوقت المجال خالية من الاستقراء تسوس (ااا) الإشارات. عادة، المعلمات العملية ICR هي الجهد الصاحب، 8 V؛ الصاحب تعويض الجهد، 8 V؛ الإثارة والتضخيم من 10؛ الإثارة الوقت النبض، 0،01-،015 ثانية؛ أمام فخ لوحة الجهد، 1.5 V؛ الفخ مرة أخرى لوحة الجهد، 1.6 V و محلل مدخل الجهد، -4 خامسا بعد أن تم تحديد على مجموعة من المعلمات FTICR العملية، الحصول على أطياف الشامل ESI ومعايرة الصك باستخدام الجماهير إشارة من المركبات القياسية في "ES ضبط ميكس" الحل.
  4. لضبط أداة لعملية MALDI، ويحل العديد من مأخوذة 1 ميكرولتر من تيرفينادين المختلطة والحل القياسية ريزيربين في حل مصفوفة بتركيز من 1 ميكرومتر لكل منهما، وبقعة هذه الحلول مباشرة على واحدة من TISSUأقسام البريد (أي قسم الأنسجة اختبار) الذي تم تركيبه على شريحة ايتو المغلفة. وضع الشريحة ايتو المغلفة في محول الشريحة الأنسجة (أي الهدف MALDI الخاصة) وتحميل محول من الجانب MALDI في ESI / MALDI مصدر أيون مزدوج. تحسين معايير التشغيل MALDI مناسبة لقوة الليزر وعدد من الطلقات ليزر لMALDI تراكم إشارة لكل المسح الشامل، الخ نموذجي المعلمات العملية MALDI هي: طلقات ليزر، و 50، و لوحة الجهد MALDI من 300 V.
  5. بعد ضبط ومعايرة، وتحقيق الاستفادة المثلى من أداة للتجارب MALDI-MSI، محاذاة الموقع الفعلي للقسم الأنسجة ليمكن تصوير مع الصورة البصرية المسجلة في إطار البرنامج التصوير. استخدام علامات "تصحيح السائل" الثلاثة، التي تم طرحها سابقا على الجانب الآخر من سطح الشريحة ايتو المغلفة (الخطوة 1.9)، لهذا التوافق باستخدام أسلوب التثليث ثلاث نقاط.
  6. إجراء ESI والقانون النموذجي للتحكيم في وقت واحدعملية DI بحيث يكون لكل الطيف الكتلي يحتوي على قمم الشامل مرجع "ES ضبط ميكس" حل لاقتناء آخر معايرة الكتلة الداخلية. وهذا يؤدي إلى قياس كتلة أدق خلال MALDI MS. للقيام بذلك، أولا تخفيف إشارة ESI من خلال خفض الجهد الشعري حتى تهيمن على إشارات MALDI أطياف بينما الإشارات calibrant ESI لا تزال مرتفعة بما يكفي للمعايرة الكتلة الداخلية.
  7. المقبل، وإنشاء وسيلة rastering الآلي لأشعة الليزر. تحديد مناطق الأنسجة ليمكن تصوير وتعيين المناسب النقطية الليزر الخطوة الحجم. لاحظ أن أحجام أصغر خطوة النقطية توفير أعلى الصور القرار الأنسجة، ولكن تحتاج إلى فترة أطول كثيرا الطيفي الشامل اكتساب الوقت ومساحة أكبر لتخزين البيانات. عدد الصورة بكسل تعتمد على خطوط المسح بالليزر خطوة لإعداد حجم وحجم الأنسجة. لعدسة الأبقار النموذجية التي لديها حجم الأنسجة 1 سم 2، وعادة ما تتكون صورة الأنسجة من كاليفورنيا.

4. تحليل البيانات

  1. معايرة الأطياف الشامل MALDI باستخدام المعايرة الداخلية للمقارنة الأولية واختيار قمم للMS / MS. دي النظير وحدد قمم نظير أحادي كما هو موضح سابقا باستخدام VBA النصي مخصصة 38.
  2. تصدير الناتجة قوائم الذروة نظير أحادي وإدخال القيم م / ض قياس في 39 METLIN و / أو قواعد البيانات metabolome HMDB 40 لمطابقة الشامل مع الإدخالات المكتبة. النظر في (M + H) + (M + نا) +، و (M + K) + الأيونات خلال البحث في قواعد البيانات، مع وجود خطأ الشامل المسموح به ± 1 جزء في المليون.
  3. توليد الصور MALDI لجميع الكيانات الدهون الكشف عبر قسم الأنسجة بأكملها باستخدام ايماجالبرمجيات الإلكترونية التحليل، مع عرض مرشح كتلة من 1 جزء في المليون في ذروة قمة.
  4. مرة واحدة تم إنشاؤها الصور لجميع القيم م / ض التي تطابق إدخالات قاعدة البيانات، وتوليد الصور لجميع القمم الأخرى كذلك للبحث عن أنماط التوزيع الفريدة التي يمكن التحقيق في وقت لاحق.

5. تأكيد الهويات من الدهون تصوير

  1. تأكيد الهويات من الدهون وفرة عالية، والتي لها أيونات جزء السمة التي يمكن الكشف عنها باستخدام أداة FTICR (على سبيل المثال 184.073 لالفوسفورية)، من خلال MALDI-MS/MS. أداء MALDI-MS/MS باستخدام الناجم عن الاصطدام تفارق (CID) مباشرة على الأنسجة.
  2. لتلك الأنواع من المادة الدهنية التي لا يمكن التأكد مباشرة من قبل MALDI-MS/MS، استخدم نظام UPLC جانب لمطياف الكتلة Q-TOF 34.
    1. تشريح مأخوذة تحتوي على 10 ملغ من ~ الأنسجة من المنطقة حيث كان مترجم الأنواع من الفائدة يدويا. وضع هذه الأنسجة في مأخوذة 2مل أنابيب الطرد المركزي.
    2. التجانس كل قسامة الأنسجة في 250 ميكرولتر من المياه، وذلك باستخدام طاحونة خلاط مع اثنين من 5 ملم كرات معدنية الفولاذ المقاوم للصدأ.
    3. إضافة 1 مل من محلول الكلوروفورم الميثانول (1:3، ت / ت)، ودوامة الأنابيب. المقبل، الطرد المركزي أنابيب باستخدام microcentrifuge في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    4. جمع supernatants وتجفيفها في دوار المكثف السرعة فراغ.
    5. حل المخلفات في 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول 30:70: الماء. حقن قسامة 10 ميكرولتر على العمود UPLC للانفصال باستخدام شطف التدرج.
    6. استخدام الظروف الكروماتوغرافي لLC-MS/MS الدهون على الخط، التي تم نشرها سابقا 34.
    7. توليد استخراج أيون الحالية (XIC) الاستشرابية باستخدام قيم م / ض النظرية، مع نافذة ± 50 جزء في المليون في جميع أنحاء الجماهير النظرية.
    8. إذا هي مركبات أصيلة لتلك الدهون المتاحة، تتناسب مع أوقات الإبقاء على مركبات أصيلة مع تلك CORREsponding قمم XIC من عينات الأنسجة. إذا المركبات هي نفسها، يجب الأوقات الاحتفاظ والأطياف MS / MS المباراة.
  3. لو مركب الحجية هو متوفر، استخدام نمط تفتيت الدهون الكشف عن لمطابقة معيار MS / MS الطيف من قاعدة بيانات metabolome مثل METLIN أو HMDB. استخدام دي نوفو الشامل التفسير الطيفي لتحديد هيكل ممكن للدهون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يجب أن عينات الأنسجة التي يتم مقطوع وذوبان الجليد التي شنت على الشرائح الزجاجية ايتو المغلفة تكون سليمة، ودون تمزق مرئية. بالنسبة للعديد من الأنسجة، والأنسجة ذوبان الجليد المباشر على تركيب شريحة الزجاج المطلي ايتو هو مقبول. بالنسبة لبعض أنسجة معينة مثل عدسة الأبقار، غالبا ما ينظر تمزيق واسعة من الأنسجة عند استخدام ذوبان الجليد المباشر تركيب (الشكل 1A). Precoating من شريحة زجاجية ايتو مع الايثانول أو حمض الفورميك (الشكل 1B) يساعد على الحفاظ على سلامة أقسام الأنسجة الأنسجة أثناء التركيب.

كل من اختيار مصفوفة واختيار المذيب من العوامل الهامة التي تؤثر على نوعية أطياف MALDI. عندما يتم الحصول على الطيف المناسبة MALDI MS من قسم الأنسجة، والطيف الكتلي هو عادة كثيفة مع إشارات الدهون داخل نطاق الكشف الشامل (الشكل 2A). وينبغي اختيار مصفوفة ومذيب بحيث لديهم أقطابونط الحجم: 14.399999618530273px؛ خط الطول: 28px؛ "> على غرار التحاليل من الفائدة، لأن عملية MALDI يتطلب حلا المرحلة الصلبة من الحليلة في بلورات المصفوفة عموما أفضل شدة إشارة الحليلة تأتي من استخدام المصفوفات MALDI مع درجات الذوبان مماثلة لتلك التي من التحاليل المطلوبة 41،42. الشكل 2A يظهر مثال على الطيف المنتجة مع مذيب كفاءة مصفوفة (70٪ ACN مع 0.01٪ TFA)، والشكل 2B يظهر سوء اختيار مصفوفة و المذيبات (70٪ MeOH مع 0.01٪ TFA) لأنثرالين.

واحدة من الفوائد المترتبة على وضع مزدوج التأين electrospray (ESI) / المصدر أيون MALDI هو أنه يتيح إضافة إشارات calibrant ESI حين الحصول على أطياف MALDI في وقت واحد دون التدخل في عملية الاجتثاث. هذه الإشارات calibrant ESI تسمح للمعايرة الكتلة الداخلية لتوفير دقة عالية الشامل مع الخطأ كتلة <0.5 جزء في المليون 38. كماإشارة ESI من معيار "ES ضبط ميكس" الحل يمكن أن يكون أمر من حجم أقوى من إشارات MALDI من التحاليل من الأنسجة، ويجب أن تكون مخففة الإشارات calibrant ESI-مشتقة. وينبغي أن تكون إشارات مرئية Calibrant وكثافة كافية لمعايرة الأطياف، لكن لا ينبغي أن تسيطر على الأطياف.

مرة واحدة وقد تم الحصول على مجموعة من أطياف الشامل من تجربة MALDI-MSI، يمكن أن تتولد صورة لكل من أيونات الكشف، مع كل بكسل يمثل بقعة أشعة الليزر من سطح قسم الأنسجة. الجمع بين كل من وحدات البكسل الفردية مع شدة أيون مختلفة عبر قسم الأنسجة من تجربة MALDI MSI يعكس التأين من analytes المستهدفة داخل الأنسجة 1. وهذا يمكن، بدورها، تقديم معلومات عن تركيزات النسبية للالتحاليل في أجزاء مختلفة من قسم الأنسجة (الشكل 3B). يجب توخي الحذر في معالجةالبيانات منذ العديد من العوامل يمكن أن تؤثر على ما ينظر إليه وكيف يتم تفسير البيانات. في معظم التجارب، يتم تطبيع البيانات إلى المجموع الحالي ايون (TIC) داخل كل طائفة. دون هذا التطبيع، يمكن أن المناطق مع أفضل الحليلة مصفوفة التعاون تبلور (أي ما يسمى "النقاط الساخنة") تسبب إشارات أقوى للالتحاليل وهذا من شأنه أن تحرف البيانات من خلال توفير المعلومات التي قد لا يتماشى جيدا مع تركيزات النسبية الفعلية لل والتحاليل (أرقام 3C-3D).

يمكن أيضا تغيير إعداد الأنسجة بشكل كبير من الصورة التي يتم إنشاؤها. إذا كانت العينة "رطبة جدا" (أي تم تطبيق الكثير من المذيبات)، ثم التحاليل سوف delocalize على النسيج والكثير من المعلومات المكانية ستفقد (الشكل 3F). طريقة الحصول على البيانات المهم أيضا في الصورة النهائية التي تم الحصول عليها. كما التجارب MALDI على أقسام الأنسجة غير المعالجة هي بطبيعتها "القذرة & #34؛، حساسية الصك قد ينخفض ​​مع مرور الوقت. للتجارب قصيرة هذا الانخفاض قد لا تكون واضحة، ومع ذلك، يمكن أن يكون مشكلة للتجارب أطول أو عينات قذرة بشكل خاص. إذا تم الحصول على البيانات خطيا عبر العينة وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحيز المكانية كما سيتم تحليل مناطق معينة من قسم الأنسجة بعد حساسية الصك قد انخفضت. لذا، وذلك باستخدام بقع عشوائية لجميع عمليات الاستحواذ البيانات ويوصى. على الرغم من أن هذه الطريقة تستغرق وقتا أكثر، فإنه يساعد على إزالة أو تقليل هذا التحيز في البيانات.

كما هو مبين في ورقتنا السابقة 34، بالمقارنة مع CHCA وDHB، تمكين DT الكشف عن أنواع الدهون إضافية، في حين الكشف عن الدهون مع ما زال من الممكن الكشف عن CHCA وDBH.

الشكل 1 >
الشكل 1. نسيج التركيب والقطع. الصور الضوئية المقارنة اثنين البقري أقسام الأنسجة عدسة العجل (20 ميكرون سميكة)، دون prewetting حمض الفورميك (أ)، وحمض الفورميك مع prewetting (ب)، التي شنت على الشرائح الزجاجية ايتو المغلفة.

الرقم 2
الشكل 2. . الشامل أطياف MALDI MS أطياف المكتسبة مباشرة من قسم الأنسجة: أ) مثالية المكتظة بالسكان الطيف الكتلي مع إشارات الدهون (70٪ ACN مع 0.01٪ TFA)؛ ب) الطيف الكتلي ولدت من قسم الأنسجة المغلفة مع سوء اختيار مذيب (70٪ MeOH مع 0.01٪ TFA). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

خيمة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 3
الرقم 3. الصور MALDI MSI MSI الممثل MALDI الصور: أ) قسم عدسة البقري الأنسجة؛ ب) صورة MSI من قسم الأنسجة نفسها؛ ج) تظهر صورة MSI أيون الخلفية؛ د) خريطة أيون nonnormalized من نفس أيون ه). قسم الأنسجة عدسة البقري؛ وو) خريطة أيون يظهر الحليلة إعادة تمركز ويرجع ذلك جزئيا إلى overwetting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أهم الاعتبارات لنجاح MALDI MSI هي: 1) إعداد الأنسجة؛ 2) اختيار مصفوفة، 3) تطبيق مصفوفة؛ و 4) تفسير البيانات وتحليلها. عندما يتم إعداد العينة والمصفوفة بشكل مناسب، هو الآلي والحصول على البيانات MS. تحليل البيانات من هذا النوع من التجربة هو تماما كثيفة العمالة.

إعداد الأنسجة المناسبة أمر بالغ الأهمية لنجاح التجارب MALDI MSI. مصدر الأنسجة والتعامل يمكن أن يكون لها تأثير كبير على التحليل النهائي. يجب أن تكون العينات وميض على الفور مجمدة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية، وأنها لا ينبغي أن تكون مخزنة لفترة طويلة من الزمن، حيث أن بعض نواتج الأيض يمكن أن تكون غير مستقرة حتى في -80 درجة مئوية.

بالنسبة للعديد من أنسجة الثدييات، وقد أوصت 10-15 ميكرومتر شرائح الأنسجة سميكة لMALDI MSI. في هذه التجارب، وقطعت العدسات العجل البقري استوائيا في 20 ميكرون سميكة و الأنسجةمن lices التالية عدسة نزع المحفظة باستخدام الإجراء الموضح سابقا 35. استخدمت أقسام الأنسجة عدسة العجل البقري سمكا لأنها وجدت صعوبة في المحافظة على سلامة الأنسجة قسم عدسة سواء أثناء قطع الأنسجة والأنسجة أثناء التركيب. العدسة هو نسيج متناظرة كرويا على طول طائرتها الاستوائية، لذلك شرائح الوحيدة التي كانت على مقربة من، أو في، جمعت الطائرة الاستوائية.

ويرجع ذلك إلى صعوبة في الحفاظ على سلامة الأنسجة أثناء قطع الأنسجة والمتصاعدة، prewetting باستخدام المذيبات مثل الإيثانول (للبروتينات والببتيدات 35) أو حمض الفورميك (لالدهون) يمكن استخدامها. وينبغي كما لاحظت أن، للبروتين الببتيد والتصوير، وغالبا ما يتم غسلها العينات مع المذيبات العضوية لإزالة الجزيئات الصغيرة بما في ذلك الدهون وأكت تستخدم لتركيب، ولكن ينبغي أن يتم ذلك خطوة الغسيل فقط مع المذيبات التي لا تذوب في التحاليل المصالح، وينبغي تجنبها للSMAتحليل جزيء ليرة لبنانية.

اختيار مصفوفة هو أيضا حاسمة لجميع التجارب MALDI، ومع ذلك، قد لا يكون أداء مصفوفة على الأنسجة نفس الأداء مصفوفة مع معيار النقاء. على سبيل المثال، في الحد الأدنى قوة الليزر، DT لدت إشارات خلفية وفرة المتعلقة DT-من البقع مصفوفة خالية من الأنسجة وخصصت هذه الإشارات كما الأوليغومرات DT وما يقابلها من الصوديوم والبوتاسيوم adducts بهم، ولكن على الأنسجة، وكثير من هذه الإشارات كانت لم يلحظ، مشيرا إلى أن اختبار المصفوفات مختلفة على عينة محددة من خيار قد يكون من المهم في اختيار المناسب لمصفوفة تحليل MALDI MSI معين. نادرا ما يستخدم لتحليل الدهون DT بسبب خلفية عالية ذكرت الناتجة عن مصفوفة، ولكن بالمقارنة مع DHB وCHCA عن التنميط وعلى أنسجة الدهون بواسطة MALDI-MS FTICR، أنتجت DT نتائج إيجابية. وبالتالي هذه المصفوفة يمكن أن تكون المصفوفة يمكن أن تكون مفيدة لMALDI التصوير الأنسجة باستخدام هذا الصك

كفاءة شارك في بلورة المصفوفة وتحليلها هو شرط أساسي لذات حساسية عالية تحليل MALDI-MS. وبالتالي ذوبان المرحلة الصلبة لتحليلها في المصفوفة المهم في عملية MALDI 41،42. وقد تم الإبلاغ عن المصفوفات MALDI مع درجات الذوبان مماثلة لتلك التي من التحاليل المطلوبة لإنتاج أقوى شدة إشارة الحليلة. لأن DT هو حمض ضعيف العضوية، فضلا عن مركب عضوي مسعور جدا، على أساس نظرية الكلاسيكية برونستيد-لوري حمض قاعدة تحييد 43 ونظرية القابلية للذوبان، فمن المتوقع لصالح تأين موجبة وأقل القطبية المركبات. في الواقع، وجدنا أن نسبة الدهون القطبية تهيمن المركبات المكتشفة في وضع إيجابي أيون عندما استخدمت DT مثل المصفوفة.

المذيبات المستخدمة لإعداد مصفوفة الحل أيضا أن تلعب دورا هاما في تحليل الأنسجة المباشر من قبل MALDI-MS. وقد تورط درجة الحموضة باعتبارهاعاملا مهما في فعالية مصفوفة، وTFA هي المضافات الشائعة المستخدمة مع CHCA وDHB. ومع ذلك، مع DT، وكان بالإضافة إلى ذلك من معدل حمض أو قاعدة أثر يذكر على البيانات الناتجة عن ذلك. بسبب للا مائية من DT والذوبان محدودة في المذيبات القطبية، فمن المستحسن المذيبات العضوية محبة للدهون. عند تحليل الدهون، وهي مزيج من كلوروفورم الميثانول (2:1، والخامس: ت) مع حمض الفورميك 1٪، وهو مذيب عضوي نموذجي لاستخراج الدهن، تم استخدامه. نحن افترض أن هذا يوفر أفضل شارك في بلورة الدهون مع DT. طبيعة محبة للدهون من المذيب ويمكن أيضا منع الانحلالية من المركبات الأخرى مثل البروتينات والأملاح، كما هو موضح في السابق سطح السائل استخراج مطياف الكتلة تحليل (LESA-MS) التجارب 44. وهذا من شأنه أن يؤدي إلى بلورة أفضل للمصفوفة والدهون مع عدد أقل من الملوثات. ينبغي لنظام المذيب الذي تم تحديده للتحليل تعظيم ذوبان المصفوفة وعشاقالتحاليل الحمراء (الدهون) مع التقليل من القابلية للذوبان من الملوثات غير المرغوب فيها (الأملاح والبروتينات / الببتيدات).

يجب أن يكون طلاء المصفوفة على سطح الأنسجة متجانسة بقدر الإمكان. لتحقيق أقصى قدر من الدقة المكانية للصورة، يجب أن يكون حجم الكريستال صغيرة قدر الإمكان 45. باستخدام بخاخ مصفوفة الإلكترونية، ومصفوفة يمكن أن تكون مغلفة بشكل موحد وبتكاثر مع حجم الكريستال الصغيرة. هذا هو الأسلوب المفضل في مختبرنا. يفضل الكثير لتطبيق دليل كما أنه يقلل من حجم البقعة، والتجانس، والتكاثر. ومع ذلك، فإن العديد من المذيبات التي هي مفيدة لMSI جزيئات صغيرة غير متوافقة مع المواد المستخدمة في تصنيع بخاخ مصفوفة الآلي. على الرغم من أن لم تنفذ بعد في المختبر لدينا، وقد أوصى التسامي على أساس تطبيق مصفوفة لتحليل الدهون 22. يوفر هذا الأسلوب تحسين (أي تخفيض) حجم البقعة، والتجانس، وreproducibility وهذا ربما ينبغي أن يكون الأسلوب المفضل عند المصفوفة المحدد انيس لهذا الأسلوب.

لطلاء المصفوفات المحتوية على مذيبات يتنافى مع الرش الآلي مصفوفة (بما في ذلك الكلوروفورم)، وهي طريقة بديلة لمصفوفة الطلاء هو استخدام بندقية فرشاة الهواء. لهذه الحلول مصفوفة، استخدمنا بخاخ البخاخة بمساعدة هوائيا. على الرغم من استخدام فرشاة بندقية الهواء ليست الأسلوب الأمثل، قد يكون الطريقة الوحيدة التي يمكن استخدامها للمذيبات والمصفوفات التي تتنافى مع وسائل أخرى، ومع التدريب والخبرة، فإنه يمكن توليد موحدة جدا طلاء المصفوفة. عند تطبيق حل مصفوفة يدويا، يجب أن تطبق فقط على الحد الأدنى من السائل خلال كل دورة لبالكاد الرطب على سطح الأنسجة. الكثير من السائل يحتمل delocalize التحاليل بسبب المذيبات العضوية. هناك قضايا استنساخ مع التطبيق اليدوية والخبرة في طلاء الشريحة مع هذا الأسلوب طق أساسي للنجاح. نظرا لطبيعة اليدوي للفرشاة الهواء بندقية تطبيق مصفوفة، يجب توخي الحذر لضمان أن يتم طلاء موحد؛ طلاء غير متجانسة يمكن أن يؤدي إلى الانحراف البيانات، والذي هو ممثل للطلاء مصفوفة وليس التعريب تحليلها.

عند إجراء التجارب MALDI MSI، وعادة ما يستند تحديد الأولية للالتحاليل الكشف على metabolome البحث قاعدة بيانات للجماهير دقيقة تقاس التي عادة ما تكون متوفرة فقط عند استخدام أداة عالية الدقة 38. وESI / MALDI مصدر أيون مزدوج على مطياف الكتلة ابيكس-12-التيسير الكمي تسلا هجين رباعي-FTICR يسمح لإضافة إشارات ولدت ESI للاستخدام كما القمم calibrant الشامل الداخلية لكل الطيف الكتلي MALDI، دون التأثير على الامتزاز MALDI / عملية التأين. استخدام المعايرة الشامل الداخلي هو أمر حاسم لقياس دقة عالية الشامل في MALDI-FTICR. معايرة الخارجية لا يمكن أن تأخذ في الاعتبار الكاملآثار تهمة الفضاء داخل الخلية ICR 46-48. ضبط ومعايرة FTICR أمر حاسم للنجاح. على هذا النوع من صك معلمة تسمى "زمن الرحلة" (TOF)، وهو الوقت الذي يستغرقه لايون للسفر من الخلية الاصطدام إلى محلل (الخلية ICR) هي واحدة من أهم المعرفة من قبل المستخدم الإعدادات التي تؤثر على حساسية الكشف صك ​​FTICR. ضمن نطاق كتلة معينة (أي م / ض 200-1،400)، وهو أقل TOF تفضل الكشف عن أقل الأيونات م / ض وTOF أعلى تفضل الكشف عن أعلى أيونات م / ض. وبالتالي، للكشف عن حساسية عالية من أيونات كل من م / ض المنخفضة والعالية ضمن نطاق الكشف الشامل، قيمة TOF من 9 ميللي ثانية أمر مرغوب فيه.

لإجراء تجربة عملية، يجب أن يتم مفاضلة بين حجم معقول الحصول على البيانات، والقرار الجماعي، والوقت الذي يقضيه في الحصول على البيانات MS التصوير. لتجربة FTICR MS، حجم ملف البيانات المكتسبة وresoluti الشاملعلى تعتمد على حجم الحصول على البيانات من تحريض تسوس حرة (ااا) إشارة. وهناك ارتفاع حجم الحصول على البيانات يؤدي إلى القرار الجماعي العالي وحجم ملف بيانات أكبر. ومع ذلك، يؤدي إلى ارتفاع حجم الحصول على البيانات أيضا أبطأ معدل المسح MS. كما مفاضلة، فمن المستحسن أن حجم الحصول على البيانات من 1،024 كيلو بايت / ثانية استخدامها على FTICR. وانخفاض حجم الحصول على البيانات والقرار الجماعي أقل المقابلة لا تسمح فصل بعض الأنواع أيون إسوي الضغط.

يجب أيضا أن يتم اختيار الليزر النقطية خطوة حجم بحيث أنه صغير بما يكفي لتوفير بيكسل جيدة للصور MS من التحاليل من الفائدة، ولكن يمكن صغيرة جدا حجم الخطوة النقطية جعل ملفات البيانات لا يمكن السيطرة عليها النظر في ملف بيانات التصوير MS يتكون من آلاف MALDI أطياف الشامل. نظرا لحجم كبير نسبيا من العدسات البقري، كاليفورنيا. 1.2 -1.5 سم في القطر، واستخدمنا النقطية حجم خطوة من 250 ميكرون. باستخدام البيانات acqu 1،024 كيلو بايت / ثانية، كان لدينا عينة بيانات حجم isition و250 ميكرون النقطية خطوة حجم ما يقرب من 60 غيغابايت. خلال الحصول على البيانات، ينبغي استخدام تحليل بقعة عشوائية، حيث أن هذا يمنع التحيز القائم على الموقع بسبب التدريجي توهين الإشارة، ومع ذلك، بقعة عشوائية يتطلب وقتا أطول بكثير للحصول على البيانات.

لأن قواعد البيانات MALDI MSI حصلت على موقعنا على صك FTICR MS تشمل البيانات الشامل دقيقة، واستخراج م / ض يمكن البحث على قواعد البيانات metabolome مثل METLIN و / أو HMDB. باستخدام نافذة جزء في المليون ± 1 التخصيصات الأولية للعديد من الإشارات ايون لنواتج ذات ثقة عالية. ومع ذلك، لأن العديد من الأنواع لديها الصيغة الكيميائية نفسها، في كثير من الأحيان يجب أن يتم التأكيد على الهوية باستخدام وسائل بديلة. وبالتالي، والتجارب MS / MS، والمقارنة بين MS / MS الأطياف مع البيانات المنشورة سابقا يجب أن يتم تنفيذ لتحديد واثقة. يمكن في بعض الأحيان أطياف MALDI-MS/MS الحصول عليها مباشرة على الصك FTICR، ولكن لأماهنيويورك جزيئات الدهون، وفرة و / أو الكفاءة التأين غير كافية للحصول على بيانات MS / MS مفيدة، وهناك حاجة لتخصيب وتنقية قبل LC-MS/MS. في هذه التحليلات، فإن معظم الدهون الفوسفورية كانت احظ القطبية، وكما تم تكليف أجهزة الكمبيوتر، والمؤسسات العامة، والرسائل القصيرة، جهاز الأمن الوقائي، PGS، المناطق المحمية، والفوسفات سيراميد (CerPs)، وتشمل جزيئات الدهون الأخرى المحددة الدهون ستيرول، carnitines أسيل، وجلسريدات. استنادا إلى خصائص المذيبات ومصفوفة، وهذا أمر متوقع. وMS / MS الأطياف من أجهزة الكمبيوتر تحتوي على ذروة بارز في م / ض 184،073، التي نسبت إلى مجموعة القطبية رئيس PC، phosphocholine، فضلا عن معلومات هامة إضافية هيكليا، والتي يمكن أن تعطي هوية لا لبس فيها من الجزيئات. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام هذا الأسلوب، يتم الكشف عن الكثير من الدهون ستيرول، ولكن معظم لا يمكن تعيين بشكل لا لبس فيه إلى هويات فريدة من نوعها، حتى مع البيانات MS / MS. adducts البوتاسيوم قوية تسود عموما الأطياف، ولكن البروتونية وsodiateويمكن أيضا أن يتم الكشف عن adducts د.

لأن عملية MS MALDI قادرة على توفير المعلومات الوفرة النسبية على أساس الكفاءة التأين المحلية داخل كل بكسل فقط، يجب توخي الحذر عند تفسير البيانات MALDI MSI دون النظائر مستقرة المعايير الداخلية وصفت 49. وعلاوة على ذلك، على الثقة في نتائج التوطين، ويجب أن يتم تأكيد أي أنماط التوزيع الكشف عن استخدام طرق بديلة. ويوصى أداء LC-MS/MS على عينات الأنسجة تشريح للتأكيد.

استنادا إلى الجماهير دقيقة تقاس في الصيغ الشامل مجموعة كيميائية منخفضة يمكن أن تتولد لإعطاء م / ض؛ ضمن الخطأ الشامل 1 جزء في المليون، والسماح لعدد غير محدود من C، H، O، وN، وبحد أقصى 2 S و2 P كثير من الأحيان سوى تكوين عنصر واحد هو ممكن. ويمكن أيضا هذه م / ض يتم البحث ضد HMDB وقواعد البيانات METLIN، والتي قد تسفر عن المركبات المرشحة المحتملة. للأسف،على FTICR MS انخفاض الكتلة وقف انتاج المواد الانشطارية كاليفورنيا. 130 دا، والتي قد تجعل من الصعب لأداء MS / MS مباشرة. وبالتالي، غالبا ما يتطلب تأكيد باستخدام نظام آخر.

وتجرى Q-TOF التجارب LC-MS/MS عادة على عينات الأنسجة التي تم تشريح يدويا من مناطق معينة من الأنسجة من الفائدة. باستخدام طريقة استخراج الدهون وصفها، يمكن أن تتولد XICs للمركبات المستهدفة وMS / MS يمكن الحصول عليها للتأكيد. مطلوب إما المقارنة في مستوى أصيلة أو دي نوفو توضيح الهيكلية قبل أن يكون هناك احالة الكيميائية واثقة.

وقد استخدم الدايثرانول لاستكشاف أنماط توزيع الدهون في عدسة العجل البقري واختبارها أيضا على كبد الفئران، والقلب، وأنسجة الكلى 34. MALDI MSI يمكن أن تستخدم لتشخيص الحالات المرضية البشرية ويجري بالفعل استخدامه لتحليل مرضية 50. مع تطور أكثر قوة ور السريعechnologies لMALDI MSI، توطين المكاني للمركبات معينة قد تكون المعلومات مفيدة لالطبيب الشرعي. مرة واحدة في تحليلها يمكن تصويرها بشكل روتيني باستخدام أسلوب يستند إلى MSI MALDI، ويمكن استخدامه لأغراض التشخيص. في الواقع، يمكن أن يؤديها التصوير الأنسجة في محيط المستشفى، مع أداة تقع بالقرب من غرفة العمليات، حيث، كما ثبت بالفعل 51، ويمكن استخدامه لتحديد دقيق لهوامش الأورام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه الجينوم كندا وكولومبيا البريطانية الجينوم للتمويل منصة، والدعم. نشكر أيضا الدكتور كارول E. باركر لمراجعة نقدية للمساعدة مخطوطة والتحرير. شيلي أيضا بفضل كولومبيا البريطانية البروتيوميات الشبكة للحصول على الدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Liver Pel-Freez Biologicals 56023-2
Bovine Calf Lens Pel-Freez Biologicals 57114-2 Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT) Sigma-Aldrich 10608 MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) Sigma-Aldrich 70990 MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Sigma-Aldrich 85707 MALDI Matrix
Reserpine Sigma-Aldrich 83580
Terfenadine Sigma-Aldrich T9652
Formic Acid Sigma-Aldrich 14265
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 14266
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 320145
Trifluoroacetic Acid (TFA) Sigma-Aldrich 302031
Water Sigma-Aldrich 39253
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 34972
Isopropanol Sigma-Aldrich 34965
Chloroform Sigma-Aldrich 366927
Acetone Sigma-Aldrich 34850
Ethanol Commercial Alcohols 95%
ES Tuning Mix Agilent Technologies G2431A
ITO Coated Glass Slides Hudson Surface Technology PSI1207000 Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen Bic WOSQP11
Airbrush Sprayer Iwata Eclipse HP-CS
ImagePrep Bruker 249500-LS
MALDI adapter Bruker 235380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaurand, P., Stoeckli, M., Caprioli, R. M. Direct Profiling of Proteins in Biological Tissue Sections by MALDI Mass Spectrometry. Anal. Chem. 71, 5263-5270 (1999).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples. Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Amstalden van Hove, E. R., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
  4. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of Tissue Specimens by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry in Biological and Clinical Research. Chem. Rev. Feb 11, (2013).
  5. Walch, A., Rauser, S., Deininger, S. -O., Höfler, H. MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis: a new frontier for molecular histology. Histochem. Cell Biol. 130, 421-434 (2008).
  6. Hsieh, Y., et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry for direct measurement of clozapine in rat brain tissue. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 965-972 (2006).
  7. Trim, P. J., et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization-ion mobility separation-mass spectrometry imaging of vinblastine in whole body tissue sections. Anal. Chem. 80, 8628-8634 (2008).
  8. Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 6448-6456 (2006).
  9. Atkinson, S. J., Loadman, P. M., Sutton, C., Patterson, L. H., Clench, M. R. Examination of the distribution of the bioreductive drug AQ4N and its active metabolite AQ4 in solid tumours by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 1271-1276 (2007).
  10. Drexler, D. M., et al. Utility of imaging mass spectrometry (IMS) by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) on an ion trap mass spectrometer in the analysis of drugs and metabolites in biological tissues. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 279-288 (2007).
  11. Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J. Proteomics. 75, 4999-5013 (2012).
  12. Sugiura, Y., Setou, M. Imaging Mass Spectrometry for Visualization of Drug and Endogenous Metabolite Distribution: Toward In Situ Pharmacometabolomes. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 31-43 (2009).
  13. Garrett, T. J., Yost, R. A. Analysis of intact tissue by intermediate-pressure MALDI on a linear ion trap mass spectrometer. Anal. Chem. 78, 2465-2469 (2006).
  14. Woods, A. S., Jackson, S. N. Brain tissue lipidomics: direct probing using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. AAPS J. 8, 391-395 (2006).
  15. Cha, S., Yeung, E. S. Colloidal graphite-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and MSn of small molecules. 1. Imaging of cerebrosides directly from rat brain tissue. Anal. Chem. 79, 2373-2385 (2007).
  16. Burnum, K. E., et al. Spatial and temporal alterations of phospholipids determined by mass spectrometry during mouse embryo implantation. J. Lipid Res. 50, 2290-2298 (2009).
  17. Veloso, A., et al. Anatomical distribution of lipids in human brain cortex by imaging mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 329-338 (2011).
  18. Tanaka, H., et al. Distribution of phospholipid molecular species in autogenous access grafts for hemodialysis analyzed using imaging mass spectrometry. Anal. Bioanalyt. Chem. 400, 1873-1880 (2011).
  19. Lou, X., van Dongen, J. L., Vekemans, J. A., Meijer, E. W. Matrix suppression and analyte suppression effects of quaternary ammonium salts in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: an investigation of suppression mechanism. Rapid Comm. Mass Spectrom. 23, 3077-3082 (2009).
  20. Knochenmuss, R., Karbach, V., Wiesli, U., Breuker, K., Zenobi, R. The matrix suppression effect in matrix-assisted laser desorption/ionization: application to negative ions and further characteristics. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 529-534 (1998).
  21. Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
  22. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a Method of Matrix Application for Mass Spectrometric Imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 1646-1652 (2007).
  23. Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
  24. Fuchs, B., Süss, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Prog. Lipid Res. 49, 450-475 (2010).
  25. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
  26. Vermillion-Salsbury, R. L., Hercules, D. M. 9-Aminoacridine as a matrix for negative mode matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 1575-1581 (2002).
  27. Hu, C., et al. Analytical strategies in lipidomics and applications in disease biomarker discovery. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, 2836-2846 (2009).
  28. Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Anal. Chem. 82, 9789-9796 (2010).
  29. Cerruti, C. D., Benabdellah, F., Laprevote, O., Touboul, D., Brunelle, A. MALDI Imaging and Structural Analysis of Rat Brain Lipid Negative Ions with 9-Aminoacridine Matrix. Anal. Chem. 84, 2164-2171 (2012).
  30. Astigarraga, E., et al. Profiling and Imaging of Lipids on Brain and Liver Tissue by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Using 2-Mercaptobenzothiazole as a Matrix. Anal. Chem. 80, 9105-9114 (2008).
  31. Whitehead, S. N., et al. Imaging mass spectrometry detection of gangliosides species in the mouse brain following transient focal cerebral ischemia and long-term recovery. PloS one. 6, e20808 (2011).
  32. Cornett, D. S., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal. Chem. 80, 5648-5653 (2008).
  33. Deininger, S. O., et al. Normalization in MALDI-TOF imaging datasets of proteins: practical considerations. Anal. Bioanalyt. Chem. 401, 167-181 (2011).
  34. Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a MALDI matrix for tissue imaging of lipids by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 8391-8398 (2012).
  35. Han, J., Schey, K. L. MALDI Tissue Imaging of Ocular Lens α-Crystallin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2990-2996 (2006).
  36. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
  37. Chen, Y., et al. Imaging MALDI mass spectrometry of sphingolipids using an oscillating capillary nebulizer matrix application system. Meth. Mol. Biology. 656, 131-146 (2010).
  38. Han, J., et al. Towards high throughput metabolomics using ultrahigh field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
  39. Smith, C. A., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).
  40. Wishart, D. S., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37, D603-D610 (2009).
  41. Hoteling, A. J., Erb, W. J., Tyson, R. J., Owens, K. G. Exploring the importance of the relative solubility of matrix and analyte in MALDI sample preparation using HPLC. Anal. Chem. 76, 5157-5164 (2004).
  42. Hoteling, A. J., Mourey, T. H., Owens, K. G. Importance of solubility in the sample preparation of poly(ethylene terephthalate. for MALDI TOFMS. Anal. Chem. 77, 750-756 (2005).
  43. Shroff, R., Rulísek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
  44. Eikel, D., et al. Liquid extraction surface analysis mass spectrometry (LESA-MS) as a novel profiling tool for drug distribution and metabolism analysis: the terfenadine example. Rapid Comm. Mass Spectrom. 25, 3587-3596 (2011).
  45. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Appl. Surf. Sci. 127 - 129, 226-234 (1998).
  46. O'Connor, P. B., Costello, C. E. Internal Calibration on Adjacent Samples (InCAS) with Fourier Transform Mass Spectrometry. Anal. Chem. 72, 5881-5885 (2000).
  47. Jing, L., Amster, I. J. An improved calibration method for the matrix-assisted laser desorption/ionization-Fourier transform ion cyclotron resononance analysis of 15N-metabolically- labeled proteome digests using a mass difference approach. Eur. J. Mass Spectrom. 18, 269-277 (2012).
  48. Zhang, L. -K., Rempel, D., Pramanik, B. N., Gross, M. L. Accurate mass measurements by Fourier transform mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 24, 286-309 (2005).
  49. Clemis, E. J., et al. Quantitation of spatially-localized proteins in tissue samples using MALDI-MRM imaging. Anal. Chem. 84, 3514-3522 (2012).
  50. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat. Rev. Cancer. 10, 639-646 (2010).
  51. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J. Proteome Res. 9, 2182-2190 (2010).

Tags

بروتوكول الأساسية، العدد 81، والعين، والتصوير الجزيئي، وتقنية الكيمياء والتحليل وقياس الطيف الكتلي، مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI)، جنبا إلى جنب مطياف الكتلة، الدهون، والتصوير الأنسجة، عدسة الأبقار، أنثرالين، مصفوفة، FTICR (تحويل فورييه ايون سيكلوترون الرنين)
أنثرالين كما مصفوفة لمصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين التصوير على تحويل فورييه ايون السيكلوترون الرنين مطياف الكتلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H.… More

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer. J. Vis. Exp. (81), e50733, doi:10.3791/50733 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter