Summary
A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.
Abstract
Guts da maioria dos insetos são habitadas por comunidades complexas de bactérias não patogênicas simbióticas. Dentro dessas comunidades microbianas é possível identificar comensais ou bactérias mutualistas espécie. Os últimos, têm sido observados para servir várias funções ao inseto, ou seja, ajudar na reprodução de insetos 1, aumentando a resposta imune 2, produção de feromônio 3, bem como a nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais 4, entre outros.
Devido à importância dessas associações, foram feitos muitos esforços para caracterizar as comunidades de baixo para os membros individuais. No entanto, a maioria desses esforços foram ou baseados em métodos de cultivo ou contado com a geração de fragmentos de genes 16S rRNA que foram seqüenciados para a identificação final. Infelizmente, estas abordagens apenas identificadas as espécies de bactérias presentes no intestino e, desde que não informatião sobre a actividade metabólica dos microrganismos.
Para caracterizar a espécie de bactérias metabolicamente activas no intestino de um insecto, que utilizado isótopo estável sondagem (SIP) in vivo utilizando 13 C-glucose como um substrato universal. Esta é uma técnica de cultura livre de promissor que permite a ligação de Filogenias microbianas para a sua actividade metabólica específica. Isto é possível por rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como o ADN e ARN 5. A incorporação de 13 C isótopos para DNA aumenta a densidade do ADN marcado em comparação com a não marcado (12 C) uma. No final, o ADN de 13 C-rotulado ou RNA é separado por ultracentrifugação de gradiente de densidade a partir de 12-C sem rótulo semelhante um 6. A análise molecular subsequente dos isotopómeros ácidos nucleicos separados proporciona a ligação entre a actividade metabólica e a identidade das espécies.
Aqui, apresentamos o protocolo usado para caracterizar as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto generalista (nosso sistema modelo), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). A análise filogenética do DNA foi feito utilizando pyrosequencing, o que permitiu alta resolução e precisão na identificação do intestino do insecto comunidade bacteriana. Como substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizada nas experiências. O substrato foi alimentado aos insectos por meio de uma dieta artificial.
Introduction
Associações simbióticas Insect-bacterianos são conhecidos por um grande número de espécies de insetos 7. Nestas associações simbióticas, microrganismos desempenham um papel importante no crescimento e desenvolvimento de insectos. Os micróbios têm sido mostrados para contribuir para a reprodução de insectos 1, feromona biossíntese 3, nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais, 4, e a digestão de alimentos inacessível ao hospedeiro. Apesar da grande variedade de associações gut-bacteriana, muito menos se sabe sobre o papel funcional que desempenham em favor do inseto. Só no caso de as térmitas, a digestão simbiótica de lignocelulose realizada por procariotas, protozoários e fungos, tem sido amplamente estudada 8,9. Em contraste com isso, pouco se sabe sobre a associação simbiótica presente no intestino dos insetos generalistas, ou seja, o curuquerê, Spodoptera littoralis. Além disso, devido à sua mudança freqüente de plantas hospedeiras, em geralist insetos e seus intestino comunidades bacterianas associadas estão permanentemente expostos a novos desafios vinculados a seus hábitos alimentares consumir plantas com uma infinidade de fitoquímicos. Ao lado desta, o ambiente do intestino em lepidópteros, representa por si só um ambiente hostil para o crescimento de bactérias por causa do elevado pH do intestino 10. Particularmente, no caso de S. littoralis, que varia de 10,5 no intestino anterior, ca. 9 no intestino médio para um pH de cerca de 7 no intestino posterior 11. Por outro lado, a comunidade bacteriana associada com o intestino de S. littoralis é simples. Tang, Freitak, et al. 12 relataram um máximo de 36 filotipos pertencentes a um total de 7 espécies de bactérias diferentes, como os únicos membros da comunidade bacteriana associada a esse inseto. Além disso, qualquer processo de criação complicado é necessário para o crescimento dos insectos no laboratório. Além disso, este e o curto ciclo de vida do insecto facilitar multi-gestudos enerational, transformando esta espécie em um sistema modelo ideal para o estudo de interações gut-micróbio.
Com o advento das tecnologias de seqüenciamento baseadas na PCR, o número de estudos que tratam de intestino biota de vários organismos (ou seja, os seres humanos, insetos, ou organismos marinhos) tem aumentado. Além disso, os resultados são independentes do isolamento e cultivo das bactérias intestinais abrigado como no passado. Quase 99% das bactérias não são cultiváveis e a simulação das condições ambientais prevalecentes no intestino é difícil 12. Usando PCR, os fragmentos de genes de rRNA 16S (um gene marcador filogenético amplamente utilizado entre as bactérias) pode ser amplificado de forma selectiva um molde de ADN mista de comunidades bacterianas do intestino, sequenciados, e clonado. Com essas informações, o usuário é capaz de identificar as espécies de bactérias depois de recuperar as informações da seqüência de bases de dados públicas 13,14. No entanto, a sequenciação de abordagens para descrever bacterianacomunidades continuam a ser insuficientes, devido à falta de informações sobre a contribuição metabólica intrínseca de cada espécie dentro da comunidade.
Stable-isótopo sondagem (SIP) é uma técnica sem cultura promissor. Ele é frequentemente usado em microbiologia ambiental para analisar filogenias microbianas associadas a determinadas atividades metabólicas. Isto é conseguido através do rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como os ácidos gordos derivados de fosfolípidos, DNA e RNA de 5. Ao considerar os ácidos nucleicos, a metodologia baseia-se na separação de 13 de ADN marcado com C ou de ARN a partir do ADN não marcado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de 6. Devido a esta ligação directa entre o marcador de ADN e actividade metabólica, uma análise molecular jusante dos ácidos nucleicos identificam as espécies e fornece informações sobre as actividades metabólicas. Além disso, a combinação de ADN-SIP e pyrosequencing como aplicado porPilloni, von Netzer, 15 et al., Permite uma identificação simples e sensível em particular da espécie bacteriana presente na 13 fracção pesada de ADN marcada com C. Até agora, esta técnica tem sido aplicada para descrever as comunidades bacterianas envolvidas em processos biogeoquímicos em solo sob aeróbicos e anaeróbicos condições 16,17 18,19. Além do uso em ciências ambientais, a técnica tem sido aplicada em ciências médicas como relatado por Reichardt, et al. 5, que descreveu as atividades metabólicas dos diferentes grupos filogenéticos da microbiota intestinal humana em resposta a um carboidrato digerível.
Aqui usamos 13 C-glucose em "rótulo" o ADN das espécies de bactérias metabolicamente activas no intestino. A glicose é um açúcar utilizado pela maioria das espécies bacterianas, ao longo da via generalizada Entner-Doudoroff (ED), embora excepções são conhecidas 20. Estejustifica o uso de 13 C-glicose como uma sonda metabólica confiável que fornece uma ligação entre metabólitos de interesse e a fonte de carbono ao longo de caminhos estabelecidos. Dependendo da causa científica, outros substratos, ou seja, 13 C-metano, 13 CO 2, ou plantas cultivadas sob uma atmosfera de 13 CO 2, podem ser usadas para tratar as actividades metabólicas.
Neste ponto, apresentamos o protocolo aplicado na caracterização metabólica da comunidade bacteriana do intestino de um inseto generalista, ou seja, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Além disso, a técnica foi acoplada a pyrosequencing, que por sua vez permite a identificação da comunidade bacteriana do intestino de insectos, com alta resolução e precisão. Como o substrato principal, 13 C-glucose marcada foi utilizado durante os experimentos.
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Protocol
1. Insect Criação
- Compre ou obter ovos garras de Spodoptera littoralis de seu próprio criação. Mantê-los em placas de Petri estéreis à temperatura ambiente (RT) até a eclosão.
- Prepare a dieta artificial para insectos de criação como se segue:
- Mergulhe 500 g de feijão branco de terra durante a noite em 100 ml de água.
- Adicionar 9,0 g de ácido ascórbico e 75 g de ágar a 1000 ml de H2O destilada e depois reduzi-lo.
- Deixe a mistura a arrefecer e, quando a mesma solidifica (para uma mistura de sólido ceroso branco) armazená-lo a 4 ° C até à sua utilização.
- Transfira a larva a uma caixa de plástico limpo e criá-los na dieta artificial a 23-25 ° C, sob um regime de longo dia com 16 horas de iluminação e 8 horas de escuridão. Mude a comida todos os dias até as larvas passam por todos os seis estágios larvais.
2. 13 C-rotulagem de DNA em bactérias do intestino metabolicamente ativo
- Dissolve-se 186,1 mg de totalmente 13 C-glucose marcada com água destilada e água desionizada (ddH2O) e misture bem com 100 g de uma dieta artificial para o experimento SIP. Certifique-se de uma concentração de 13 C-glucose final de 10 mM na dieta artificial. Este simula a concentração de glucose in situ no intestino de S. littoralis larvas em plantas de algodão de acordo com Shao et al. (submetido).
- Transferência 9-15 segunda larvas saudável a partir da caixa de criação para placas de Petri de plástico estéril (uma larva por placa de Petri) contendo fresco 13 C-glicose cravado dieta artificial. Use dieta artificial contendo a mesma quantidade de glicose nativa (12 C-glicose), tal como descrito, para a alimentação do grupo de controlo.
- Renove a dieta artificial com frequência durante o período de incubação (1 dia). Use condições de criação como no passo 1.3.
- Colete nove larvas de cada tratamento para posterior processamento (extração de DNA). Cadareplicar é constituído por três indivíduos; fazer, pelo menos, três repetições por tratamento.
3. Insect Dissection
- Limpar e desinfectar as ferramentas de dissecação no início do trabalho com etanol 70% (Ferramentas = tesoura Vannas, fórceps e bisturi com lâminas descartáveis finas).
- Pegue os insetos com uma pinça macios e lavar a pele superficialmente com água destilada. Colocá-los em gelo durante pelo menos 30 minutos para anestesiar eles.
- Enquanto ainda anestesiados lugar deles a 0 ° C durante 1 hora para matar. Desinfetar os insetos mortos superficialmente por imersão em etanol (70%) por um par de minutos.
- Realizar o insecto dissecção em um volume de aproximadamente 15 ml de PBS 1x depositado sobre uma placa de Petri esterilizada (NaCl 1XPBS = 137 mM, KCl 2,7 mM, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, 1,47 mM, KH 2 PO 4, ajustar o pH para 7,4 , autoclave). Certifique-se de ter o corpo todo inseto totalmente imersa na solutíon durante todo o período de dissecação.
- Comece a dissecção, fazendo uma incisão na pele ao longo do lado esquerdo do inseto direita e, começará na cabeça e terminar no ânus. Retire toda a pele, túbulos de Malpighi, e gordura corporal. Mude para tampão fresco antes de cortar aberto o intestino. Seção do intestino em primeiro plano, médio e intestino posterior, quando necessário. Armazenar o tecido no congelador (-80 a -20 ° C) até que a extracção do ADN
4. Extração de DNA e amplificação
- Colocar o tecido de insectos em um tubo de 1,5 ml de centrífuga estéril e secar todas as amostras a 45 ° C num dispositivo de concentrador de vácuo. Esmagar o tecido seco com um pilão de plástico estéril.
- Extrair o DNA genômico utilizando um kit adequado para a extração de DNA do solo. Transferir o tecido seco para o tubo de reacção do kit e seguir as instruções como indicado pelo fabricante.
- Determinar a concentração do ADN eluído final, utilizando um espectrofotómetro.
- Verifya extração com sucesso do DNA metagenômica microbiana do intestino do inseto através da preparação de um ensaio de PCR diagnóstico usando eubacterianas primers gerais 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) e 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Definir a reacção de PCR como se segue:
- Definir uma mistura de reacção de 50 ul contendo 1x tampão, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM de quatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), 2,5 U de Taq DNA polimerase, 0,5 mM de cada iniciador e 60 ng do ADN extraído como molde.
- Executar as reacções de PCR utilizando um termociclador como se segue: desnaturação inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de: 94 ° C durante 45 seg, emparelhamento a 55 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 1 min . Usar um passo de extensão final a 72 ° C durante 10 min.
- Verificar a amplificação com êxito por PCR em agarose a 1% da electroforese de brometo de etídio (EB) gel corado (dissolver 1 g de agarose em 100 ml de tampão 1 x TAE e mancha com 1ml EB). Depósito 5 jul of thproduto e PCR + 1ml de 6x corante de carregamento para os bolsos de gel. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM de ácido acético glacial, 1 mM de EDTA, ajustado a pH 8).
- Executar o gel utilizando tampão 1xTAE a 300 V, 115 mA, durante ca. 20 min em uma câmara de eletroforese. Usando uma câmara de documentação de gel (transiluminador UV ligado a uma câmera digital e computador) observar o gel e comparar o tamanho do seu produto final com o marcador de gene também carregado, o tamanho correto dos amplicons deve ser de aproximadamente 1,5 kb.
- Armazenar os produtos de PCR sob condições de congelamento profundo, preferencialmente -80 ° C, até utilização.
5. Separação do CsCl DNA Gradiente Ultracentrifugação
- Preparar os reagentes para os gradientes de ultracentrifugação como se segue:
- Prepara-se uma M de cloreto de césio (CsCl), solução 7,163 dissolvendo gradualmente 603,0 g de CsCl em ddH2O e encher-se até um volume final de 500 ml.
- Exatamente desterminé a densidade da solução de CsCl preparado por pesagem de um aliquota de 1,0 ml em um equilíbrio de três dígitos por triplicado. Esta, geralmente, varia entre 1,88 e 1,89 g / ml à temperatura ambiente.
- Preparar o tampão de gradiente (Tris 100 mM, KCl 100 mM e EDTA 1 mM) por combinação de 50 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8) e 3,75 g de KCl numa final volume de 500 ml, utilizando DDQ 2 O. Filtro (0,22 mM) e esterilizar em autoclave esta solução.
- Separação DNA
- Tendo determinado a concentração de DNA individual dos insectos tratados, medida como no ponto 4.3, reunir os insetos correspondentes a um conjunto de replicação e normalizar a concentração de ADN para assegurar que cada um, contribui igualmente para a amostra combinada. A concentração final de 500-5.000 ng de ADN (medir novamente a concentração final), é adequado para o processo de ultracentrifugação 21.
- Para configurar o meio de gradiente, combinar o DNA quantificado, um buffer de gradiented 4,8 mL de solução 7,163 M de CsCl em conjunto a um volume de mistura de 6,0 ml para um tubo estéril de 15 ml com tampa de rosca (geração de uma mistura de ADN-meio de gradiente).
- Cuidadosamente coloque o gradiente de mistura de ADN-meio preparado para um tubo de ultracentrífuga 5,1 ml (preencher até a base do gargalo do tubo) utilizando uma seringa e agulha. Evitar bombeamento ou formar quaisquer bolhas de ar. Inclua pelo menos um gradiente em branco (usando DDH 2 O em vez de DNA) em cada centrífuga prazo, como um gradiente de referência.
- Pares de tubos de equilíbrio para dentro de 10 mg de peso após cada meio de gradiente necessário é preenchida para o respectivo tubo de ultracentrífuga. Selar o tubo com um "Topper Tube" e garantir que o selo é livre de vazamentos invertendo o tubo e aplicando uma pressão moderada com a mão.
- Use um rotor quase vertical com oito poços para a realização de 5,1 ml tubos de ultracentrifugação para a ultracentrifugação. Selar cuidadosamente os poços do rotor e carregar o rotor para a ultracentrífuga de acordo com a mainstruções do nufacturer. Definir as condições de ultracentrifugação: rotação em 50.000 rpm (cerca de 177.000 xg), a temperatura a 20 ° C, e ultracentrifugação tempo de funcionamento por 40 horas, com vácuo. Selecione a aceleração máxima e desaceleração sem freio.
- Uma vez terminado, remova cuidadosamente os tubos do rotor de centrífuga com a pinça. Colocá-los em um rack, sem perturbar os gradientes formados dentro dos tubos. Processe as amostras de fraccionamento de gradiente, logo que possível, para minimizar qualquer difusão.
- Recuperação de DNA a partir de gradientes isopícnica separados por fracionamento
- Usar um sistema de bomba de HPLC com uma precisão de realizar o fraccionamento de gradiente, o qual separa os gradientes igualmente formados a partir do tubo de ultracentrífuga método de deslocamento superior. Ligue a bomba de HPLC (100% gradiente de fluxo) para a garrafa cheia de 1 L de deslocamento DDH 2 O e firmemente anexar a tubulação da bomba aberta com um 23 G 1 em agulha de seringa. Adicionar suficiente bromophenol corante azul para o DDH 2 O para dar-lhe uma cor azul escuro. Isto facilita a visualização de interface entre o meio de gradiente e o deslocamento de ddH 2 O.
- Definir a bomba a uma taxa de fluxo de 850 mL / min e equilibrar o sistema até que uma gota da cor azul ddH2O emerge para fora da agulha de uma seringa.
- Cuidadosamente fixar o tubo de ultracentrífuga para uma posição de fixação e perfurar o fundo do tubo com uma seringa de 23 G 1 em agulha longa. Ligar a bomba para o tubo de ultracentrífuga, inserindo a agulha ligada ao tubo da bomba para a parte superior do tubo, e recolher gotas a partir do fundo directamente em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 ml. Coletar uma fração a cada 30 seg, no valor de cerca de 425 mL por fração e um total de 12 frações por gradiente. Note que a última fracção (fracção 12) contém geralmente o deslocamento ddH2O e deve ser descartado.
- Após o fracionamento, measure a densidade de todas as fracções separadas, utilizando uma balança analítica, como mencionado na etapa 5.1.2.
- Precipitar o DNA a partir de cada fracção (em 425 uL) adicionando primeiro uma glicogénio ul (20 ug / ul em ddH2O, autoclavado) como um transportador para a precipitação de uma baixa quantidade de ADN. Misture bem por inversão.
- Adicionar dois volumes (850 uL) de uma solução de (PEG) (dissolver 150 g de polietileno glicol 6000 e 46,8 g de NaCl em ddH2O para um volume total de 500 ml de polietileno-glicol. Filtro, esterilizar e autoclave. A solução de PEG é 30 % PEG 6000 e 1,6 M de NaCl), e misturar novamente invertendo dez vezes.
- Deixar os tubos a temperatura ambiente durante pelo menos duas horas (se for necessário, durante a noite) para precipitar o ADN.
- Centrifugar os precipitados a 13.000 xg durante 30 min à temperatura ambiente. A pelota visível devem formar.
- Cuidadosamente remove-se o sobrenadante com uma pipeta e lava-se o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. Centrifugar sob o mesmocondições para 10 minutos novamente.
- Descartar o sobrenadante cuidadosamente e ar secar o sedimento à TA durante 15 min.
- Redissolver o sedimento de DNA seco em 30 uL de ddH2O e misturar bem batendo ligeiramente no tubo. Quantificar o DNA em cada fração gradiente como no passo 4.3 loja as amostras a -20 ou -80 ° C, se o armazenamento de longo prazo é necessária.
6. DNA Caracterização por Pyrosequencing
- Assegure-se que o ADN nativo não marcado (12 C) ocupa o intervalo de densidade de 1,705 g / ml a 1,720 g / ml, enquanto que o ADN de C-13 marcado tem uma densidade de cerca de 1,720-1,735 g / ml. Note-se que tanto o nativo e 13-C marcado de DNA extraído a partir de amostras ambientais pode abranger várias fracções do gradiente. Esperar que o ADN de luz para ser associada com as fracções 9-11 e o ADN pesado para ser associada com as fracções 4-6.
- Combine frações chave para criar um único "compilado" ac fracção representativacordões para a atribuição de pico específico do ADN resolvido densidade. Alternativamente, outros meios para examinar as fracções separadas usando a espectrometria de massa isotópica razão isotópica (IRMS) 22 ou um método de impressão digital, como eletroforese desnaturante (DGGE) 23, pode ajudar a escolher frações apropriadas antes do seqüenciamento.
- Realize pyrosequencing dos genes 16S rRNA amplificados por PCR a partir das frações pesadas, médias e leves compilados de cada gradiente individual. Usando este método, a identificação da linhagem e abundância relativa de espécies de bactérias metabolicamente activas no SIP amostras incubadas é possível. Realizar pyrosequencing como se segue:
- Realizar amplicão pyrosequencing usando um instrumento FLX Roche 454 com reagentes de titânio.
- Prepare amplicons com código de barras para multiplexação usando o primer fusão definir Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) e Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 estendido com the respectiva cartilha adaptador A / B e identificadores multiplex-específica da amostra (média).
- Aplicar uma PCR de um passo com 30 ciclos, utilizando uma polimerase Hot Start Taq, para gerar a biblioteca de sequenciação.
- Sequenciar o amplicons com base no protocolo de fornecedor, e estender a lê a frente (Gray28F) como descrito no http://www.researchandtesting.com/ .
7. Análise de Dados pyrosequencing
- Analisar a seqüência cru lê gerado pelo 454 pyrosequencing com os "insights quantitativos em ecologia microbiana", software QIIME oleoduto 26. Executar o processamento da seguinte forma:
- Inicialmente, converter o arquivo sff 454-máquina gerado para FASTA, QUAL e arquivos Flowgram com o script process_sff.py.
- Validar o arquivo de mapeamento (baseado em check_id_map.py) e atribuir multiplexado lê para sam biológicacípios com o script split_libraries.py. Apare a baixa qualidade termina com um tamanho de janela de correr de 50 e um parâmetro de qualidade média de corte de 25, eliminar também as sequências ambíguas curtas (o comprimento <200 pb) do conjunto de dados.
- DeNoise dos dados 454 utilizando o denoise_wrapper.py.
- Em seguida, agrupar a alta qualidade lê em unidades taxonômicas operacionais (Otus) usando o método de múltipla OTU escolher (pick_otus.py com 97% de similaridade de seqüência cut-offs).
- Escolha uma seqüência representante de cada OTU usando pick_rep_set.py.
- Atribuir taxonomia para o conjunto representativo seqüência com base em assign_taxonomy.py. Use o classificador Ribosomal Database Project (RDP) com uma confiança mínima para atribuição recorde de 0,80.
- Alinhe a seqüência de representação instituído contra os prealigned principais seqüências 16S GreenGenes usando o algoritmo PyNast (align_seqs.pycom o mínimo seqüência identidade por cento conjunto de 75).
- Além disso, esgotar quimeras de uma análise mais aprofundada, executando identify_chimeric_seqs.py.
- Remova todas as posições de gap (não úteis para inferência filogenética) com o modelo lanemask (filter_alignment.py) antes da construção de uma árvore filogenética (make_phylogeny.py).
- Finalmente, gerar tabelas OTU com make_otu_table.py, descrevendo a ocorrência de filotipos bacterianos dentro de cada amostra. Use a tabela de OTU para construir o mapa de calor para comparar a abundância ea atividade bacteriana.
- Se necessário, calcular o alfa e beta diversidade dentro e entre as amostras, respectivamente. Da mesma forma, curvas de rarefação (gráficos de diversidade em função da profundidade de seqüenciamento) e Análise de Coordenadas Principais (PCoA) parcelas representando as relações entre comunidades microbianas pode também estar preparado.
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Representative Results
Para alcançar rotulagem suficiente das bactérias metabolicamente activas presentes no intestino do insecto, o insecto pode ser exposto ao 13 substrato rico em C, durante um período previamente optimizado suficiente para permitir a separação da fracção mais pesada marcado facilmente do não marcado mais leve. No nosso caso, 13 C-glucose foi suplementado na dieta artificial a uma concentração final de 10 mM durante 1 dia (Figura 1A). A mesma quantidade de glicose normal (Figura 1B) foi fornecido na dieta artificial de controlar os insectos. Como mencionado antes, a separação das fracções de ADN (mais pesado do isqueiro) constitui a base de todo o processo. Portanto, o primeiro passo a ser executado é a extracção do ADN a partir do tecido de interesse, neste caso, a comunidade bacteriana associada com o insecto intestino. Para confirmar a sua qualidade, é importante para executar um gel de electroforese para determinar se qualquer ADN em tudo foi obtido a partir da anátecido zed. Na Figura 1C, pode-se observar uma forte banda de ADN genómico na parte superior da imagem de confirmação positiva da extracção do ADN. Além disso, é necessário realizar uma PCR de diagnóstico, utilizando iniciadores universais para bactérias, para determinar a presença de ADN bacteriano (Figura 1D). Este resultado positivo é importante para decidir se prosseguir com a separação do ADN extraído metagenômico.
Após ultracentrifugação, uma vez que a quantidade de ADN em cada fracção separada é confirmada, e a medição da densidade é feita, graficamente a fracção de densidade média em g / ml ao longo do número de fracção para confirmar a formação do gradiente adequado de tubos, que abrange normalmente um faixa de densidade de 1,690 (para a fração de 12 ou 11) para g / ml 1,760 g / ml (Para a fração 1). Pyrosequencing quantitativa é realizada diretamente sobre os gradientes SIP representativos para revelar linhagem de espécies e abundância relativa (Figura 2 13 C-glicose eo controle sem rótulo, que serviu para perfilar população activa na comunidade. Após sequenciação, um total de 120.045 alta qualidade lê com um comprimento médio de 404 nucleótidos foram gerados. O perfil pyrosequencing mostrou uma maior abundância de certas espécies, incluindo Enterococcus e Pantoea na amostra marcada (13 de ADN marcado com C, Figura 3), em comparação com os do grupo de controlo (C 12 controlo de ADN, Figura 3). Por isso essas bactérias são considerados metabolicamente ativo, e merecem mais estudo.
Experimento Figura 1. Alimentação 13 C-glucose, a extracção de ADN e de amplificação por PCR do rRNA 16S bacteriano gen e. (A) 13 C-glucose alterada dieta artificial consumido por larvas de Spodoptera littoralis. (B) glicose nativo (12 C-glucose) alterado dieta artificial consumido por larvas a partir do mesmo lote de insectos utilizados em (A), que serve como controlo . (C) extrato de DNA metagenomic típica do tecido intestinal de larvas na C-glicose grupo de tratamento e 13 no grupo controle 12 C-glicose. Três réplicas biológicas (pista 1, 2 e 3) estão incluídos em cada grupo. M representa o marcador de ADN 1 kb. (D) a amplificação por PCR com um conjunto de primer universal de bactérias gera os produtos de correcção do gene 16S rRNA de 1,5 kb utilizando ADN extraído metagenômico como molde. Pistas 1 é o controle PCR positivo. Pista 2 e 3 representam o 13 C-glucose na amostra tratada e o controlo 12 C-glucose, respectivamente. "target =" _blank jpg "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Esboço de um experimento Pyro-SIP envolvendo densidade CsCl gradiente ultracentrifugação e caracterização fração com pyrosequencing do DNA separados. H = maior abundância, L = menor abundância. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. A diversidade bacteriana e abundância relativa nas frações pesadas de larvas nativa glicose alimentado (12 DNA-controle C) e 13 C-glicose larvas alimentadas (DNA 13 C-rotuladas)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
O intestino da maioria dos insetos abriga uma comunidade microbiana rica e complexa, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas apresentar lá, superando as próprias células do hospedeiro, na maioria dos casos. Assim, o inseto intestino é um "hot spot" para diversas atividades microbianas, representando vários aspectos das relações microbianas, de patogênese para obrigar mutualismo 27. Embora muitos estudos têm descrito uma incrível variedade de comunidades microbianas do intestino do inseto, a caracterização da atividade metabólica da microbiota intestinal é raro. Isótopos estáveis sondagem abordagens oferecem agora uma possibilidade para distinguir os membros ativos de um fundo microbiota complexo independente de cultivo e até mesmo in vivo. Nós aplicamos esta ferramenta valiosa para o estudo da microbiota intestinal em um sistema modelo de insetos, algodão folha verme (Spodoptera littoralis). Desde glicose é o açúcar predominante no intestino de curuquerê, nesta demonstração que alimentou o larvae com uma dieta artificial enriquecida com uma dose extra, mas fisiológica de 13 C-glicose para rastrear as bactérias metabolicamente ativas na flora intestinal. Uma incubação idêntico estabelecida com glicose nativo fornecido um controlo crítico para comparação posterior para garantir que qualquer rotulagem aparente de ácido nucleico não é um artefacto do método em si, tais como elevado teor de G+ C em ADN contribui para a separação. O próximo na concentração de glicose situ adicionalmente reduzido viés experimental. Outras considerações relacionadas com uma configuração experimental rigorosa do estudo do DNA-SIP foi discutido em outros lugares 28,29. As bactérias do intestino normalmente são metabolicamente muito ativo e ter tempo de geração curto em comparação com os microorganismos da maioria dos ambientes terrestres e aquáticos. Assim, uma 24 horas alimentando continuamente já causou uma marcação significativa. Note-se que uma grande quantidade de ADN genómico hospedeiro foi também co-extraídos a partir dos tecidos do intestino, o que deve ser tomada emconsideração quando se discute os resultados.
A caracterização típica fração gradiente depende dos métodos de impressão digital de baixa resolução, como polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais (T-RFLP), e demorada construção da biblioteca clone de vincular os dados. Só muito recentemente é que o advento de high-throughput segunda geração técnica de seqüenciamento permite a análise rápida, eficaz e detalhado de comunidades microbianas complexas. Aqui nós aplicamos essa nova tecnologia para examinar diretamente a composição genética das frações gradiente de densidade e identificar bactérias metabolicamente ativas, o que deu maior sensibilidade em comparação com os métodos baseados em eletroforese em gel, e facilitou a classificação filogenética subseqüente. Comparando frações pesadas equivalentes, tanto do 13 C-rotulados e 12 amostras de controle C, descobrimos que Pantoea e Enterococcus tornou-se rotulado sobre isótopo sondagem. Uma vez que o metabolically bactérias activas foram identificadas, outra análise, tais como a hibridação in situ fluorescente (FISH), utilizando sondas específicas e análise metagenômico do ADN marcado recuperados a partir de membros da comunidade activas pode ser realizado para fornecer uma visão global dos verdadeiros simbiontes associados ao hospedeiro . Baseado no sistema estabelecido aqui, outras fontes de carbono 13 C-rotulados também pode ser alimentado no hospedeira para dissecar as bactérias envolvidas na via metabólica do intestino alvo, por exemplo, a marcação de celulose para identificar bactérias activas envolvidas no processo de digestão de acolhimento. Com o desenvolvimento dessas novas abordagens, o papel da microbiota intestinal do inseto se tornará mais aparente do que atualmente.
Colectivamente, o protocolo descrito aqui, representa um método simples, rápido e eficaz para determinar as actividades metabólicas da flora intestinal, que ainda pode ser utilizado para avaliar o papel específico de bactericidasimbiontes rial na nutrição de acolhimento, desintoxicação, e defesa.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Angelika Berg de assistência laboratorial. Este trabalho foi apoiado e financiado pela Sociedade Max Planck e da Escola de Comunicação Jena microbiana (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
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