Summary
La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.
Abstract
Guts della maggior parte degli insetti sono abitate da comunità complesse di batteri non patogeni simbiotici. All'interno di queste comunità microbiche è possibile identificare commensali o batteri mutualistiche specie. Questi ultimi, sono stati osservati per servire molteplici funzioni per l'insetto, ossia ad assistere nella riproduzione insetto 1, stimolare la risposta immunitaria 2, produzione feromone 3, così come la nutrizione, tra cui la sintesi di amminoacidi essenziali 4, tra gli altri.
Data l'importanza di queste associazioni, sono stati fatti molti sforzi per caratterizzare le comunità fino ai singoli membri. Tuttavia, la maggior parte di questi sforzi sono stati entrambi basati su metodi di coltivazione o invocato la generazione di frammenti del gene 16S rRNA che sono stati sequenziati per l'identificazione finale. Purtroppo, questi approcci solo individuate le specie batteriche presenti nell'intestino e non hanno fornito alcuna informatione sull'attività metabolica dei microrganismi.
Per caratterizzare le specie batteriche metabolicamente attive nell'intestino di un insetto, abbiamo usato isotopo stabile tastatura (SIP) in vivo impiegando 13 C-glucosio come substrato universale. Questa è una tecnica priva di cultura promettente che permette il collegamento di filogenesi microbica per la loro particolare attività metabolica. Ciò è possibile inseguimento stabili, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, come DNA e RNA 5. L'incorporazione di 13 C isotopi nel DNA aumenta la densità del DNA marcato rispetto al non marcato (12 C) uno. Alla fine, il DNA 13 C-marcato o RNA è separato mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità del 12 C-marcato una simile 6. La successiva analisi molecolare dei isotopomeri separati acidi nucleici fornisce il collegamento tra l'attività metabolica e l'identità delle specie.
Qui vi presentiamo il protocollo utilizzato per caratterizzare i batteri metabolicamente attivi nell'intestino di un insetto generalista (il nostro modello di sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L'analisi filogenetica del DNA è stata effettuata usando pyrosequencing, che ha permesso alta risoluzione e precisione nell'identificazione del budello insetto comunità batterica. Come substrato principale, 13 C-glucosio marcato è stato usato negli esperimenti. Il substrato è stato alimentato agli insetti con una dieta artificiale.
Introduction
Associazioni simbiotiche Insect-batteriche sono conosciute per un gran numero di specie di insetti 7. In queste associazioni simbiotiche, i microrganismi svolgono un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo di insetti. I microbi hanno dimostrato di contribuire alla riproduzione insetto 1, feromone biosintesi 3, alimentazione, compresa la sintesi di amminoacidi essenziali 4, e la digestione del cibo inaccessibili all'host. Nonostante la grande varietà di associazioni gut-batterica, tanto meno si sa circa il ruolo funzionale che svolgono a favore degli insetti. Solo in caso di termiti, la digestione simbiotico di lignocellulosa effettuata da procarioti, protozoi e funghi, è stata ampiamente studiata 8,9. In contrasto con questo, poco si sa circa l'associazione simbiotica presente nell'intestino degli insetti generalisti cioè il leafworm cotone, Spodoptera littoralis. Inoltre, a causa del loro spostamento frequente di piante ospiti, generaleTSI insetti e loro intestino comunità batteriche associate sono esposti in modo permanente alle nuove sfide legate alle loro abitudini alimentari consumando piante con una pletora di sostanze fitochimiche. Oltre a questo, l'ambiente intestinale in lepidotteri, costituisce di per sé un ambiente difficile per la crescita di batteri causa della elevata budello pH 10. In particolare nel caso di S. littoralis, si va dal 10,5 al foregut, ca. 9 nella midgut a pH quasi 7 nella hindgut 11. D'altra parte, la comunità batterica associata con l'intestino di S. littoralis è semplice. Tang, Freitak, et al. 12 hanno riportato un massimo di 36 filotipi appartenenti ad un totale di 7 diverse specie batteriche come unici membri della comunità batterica associata a questo insetto. Oltre a questo, non complicata procedura allevamento è necessaria per la crescita degli insetti in laboratorio. Inoltre, questo e il breve ciclo di vita dell'insetto facilitare multi-gstudi enerational, trasformando questa specie in un sistema modello ideale per lo studio delle interazioni gut-microbo.
Con l'avvento delle tecnologie di sequenziamento basate sulla PCR, il numero di studi che si occupano di budello biota di diversi organismi (cioè esseri umani, insetti o organismi marini) è aumentata. Inoltre, i risultati sono indipendenti da isolamento e la coltura dei batteri intestinali nutrito come in passato. Quasi il 99% dei batteri non sono coltivabili e la simulazione delle condizioni ambientali prevalenti nell'intestino è difficile 12. Utilizzando PCR, 16S rRNA frammenti di geni (un gene marcatore filogenetico ampiamente utilizzato tra i batteri) potrebbero essere selettivamente amplificati da un modello di DNA misto di comunità batteriche intestinali, sequenziati e clonati. Con queste informazioni, l'utente è in grado di identificare le specie batteriche dopo aver recuperato le informazioni sulla sequenza da database pubblici 13,14. Tuttavia, la sequenza si avvicina a descrivere battericacomunità rimangono insufficienti a causa della mancanza di informazioni sul contributo metabolica intrinseca delle singole specie all'interno della comunità.
Stabile-isotopo sondaggio (SIP) è una tecnica priva di cultura promettente. E 'spesso utilizzato in microbiologia ambientale per analizzare filogenesi microbica legati a particolari attività metaboliche. Ciò si ottiene usando stable, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, quali acidi grassi derivati da fosfolipidi, DNA e RNA 5. Quando si considera acidi nucleici, la metodologia è basata sulla separazione di 13 C-marcato DNA o RNA dal DNA non marcato dal gradiente di densità ultracentrifugazione 6. A causa di questa connessione diretta tra l'etichetta DNA e l'attività metabolica, un'analisi molecolare a valle degli acidi nucleici individua le specie e fornisce informazioni sulle attività metaboliche. Inoltre, la combinazione di DNA-SIP e pyrosequencing come applicato dallaPilloni, von Netzer, et al. 15, permette una particolare identificazione semplice e sensibile delle specie batteriche presenti nella frazione DNA pesante 13 C-marcato. Fino ad ora, questa tecnica è stata applicata per descrivere le comunità batteriche coinvolte in processi biochimici nel terreno sotto 16,17 aerobiche e anaerobiche condizioni 18,19. Oltre all'uso in scienze ambientali, la tecnica è stata applicata per la medicina come riportato da Reichardt, et al. 5, che descrive le attività metaboliche dei diversi gruppi filogenetici del microbiota intestinale umano in risposta ad un carboidrato nondigestible.
Qui usiamo 13 C-glucosio di 'label' il DNA delle specie batteriche metabolicamente attivi nell'intestino. Il glucosio è uno zucchero utilizzato dalla maggior parte delle specie batteriche lungo la diffusa Entner-Doudoroff (ED) percorso, anche se le eccezioni sono noti 20. Questogiustifica l'utilizzo di 13 C-glucosio come sonda metabolico affidabile che fornisce un collegamento tra metaboliti di interesse e la fonte di carbonio lungo percorsi stabiliti. A seconda della domanda scientifica, altri substrati, cioè 13 C-metano, 13 CO 2, o piante ottenute sotto atmosfera di 13 CO 2, può essere utilizzato per affrontare attività metaboliche.
A questo punto, presentiamo il protocollo applicato nella caratterizzazione metabolica della comunità batterica intestinale di un insetto generalista, cioè S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Inoltre, la tecnica è stata accoppiata con pyrosequencing, che a sua volta permette l'identificazione di insetto comunità batterica intestinale con alta risoluzione e precisione. Come substrato principale, 13 C-glucosio marcato è stato utilizzato durante gli esperimenti.
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Protocol
1. Insetto allevamento
- Acquistare o avere uova grinfie di Spodoptera littoralis dal proprio allevamento. Mantenerle in piastre sterili a temperatura ambiente (RT) fino alla schiusa.
- Preparare la dieta artificiale per gli insetti che allevano come segue:
- Mettere a bagno i fagioli bianchi 500 g di terra durante la notte in 100 ml di acqua.
- Aggiungere 9,0 g di acido ascorbico e 75 g di agar a 1000 ml di acqua distillata H 2 O e poi bollire.
- Lasciare la miscela a raffreddare e quando solidifica (a una miscela solido ceroso bianco) conservarla a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Trasferire le larve appena schiusi di una scatola di plastica pulito e posteriori sulla dieta artificiale a 23-25 ° C sotto un regime di lunga giornata con 16 ore di illuminazione e 8 ore di oscurità. Cambiare il cibo ogni giorno fino a quando le larve passare attraverso tutti i sei stadi larvali.
2. 13 C-etichettatura del DNA in batteri intestinali metabolicamente attivo
- Sciogliere 186,1 mg di glucosio completamente 13 C-marcato con acqua distillata e deionizzata (DDH 2 O) e mescolare bene con 100 g di dieta artificiale per l'esperimento SIP. Garantire una concentrazione finale 13 C-glucosio di 10 mm nella dieta artificiale. Questo imita la concentrazione in situ glucosio nell'intestino di S. littoralis larve si nutrono di piante di cotone secondo Shao et al. (presentato).
- Trasferimento 9-15 sano secondo le larve instar dalla casella di allevamento di piastre di Petri di plastica sterile (una larva ogni capsula di Petri) contenenti fresca 13 C-glucosio spillo dieta artificiale. Utilizzare dieta artificiale contenente la stessa quantità di glucosio nativo (12 C-glucosio), come descritto, per l'alimentazione del gruppo di controllo.
- Rinnovare la dieta artificiale frequentemente durante il periodo di incubazione (1 giorno). Utilizzare condizioni di allevamento come al punto 1.3.
- Raccogliere nove larve di ogni trattamento per una successiva elaborazione (estrazione del DNA). Ognireplicare è costituito da tre individui; fare almeno tre repliche per ogni trattamento.
3. Insetto Dissection
- Pulire e disinfettare gli strumenti di dissezione all'inizio del lavoro con etanolo al 70% (Strumenti = forbici Vännäs, pinze e bisturi con sottili lame usa e getta).
- Prendete gli insetti con un morbido pinza e lavare la pelle superficialmente con acqua distillata. Metterli in ghiaccio per almeno 30 minuti per anestetizzare loro.
- Mentre ancora anestetizzato posto li a 0 ° C per 1 ora per ucciderli. Disinfettare gli insetti morti superficialmente immergendole in etanolo (70%) per un paio di minuti.
- Eseguire la dissezione insetto in un volume di circa 15 ml di PBS 1x depositato su una piastra di Petri sterile (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4, regolare il pH a 7,4 , autoclave). Essere sicuri di avere tutto il corpo dell'insetto completamente immerso nel solutlitio durante l'intero periodo di dissezione.
- Iniziare la dissezione facendo un'incisione nella pelle lungo il lato destro e sinistro dell'insetto, inizio alla testa e finire l'ano. Rimuovere tutta la pelle, tubuli malpighiani, e grasso corporeo. Passare a tampone fresco prima di tagliare aperto l'intestino. Sezione l'intestino in fore-, medio-, e hindgut quando è necessario. Conservare il tessuto nel congelatore (-80 a -20 ° C) fino al momento dell'estrazione del DNA
4. Estrazione del DNA e amplificazione
- Posizionare il tessuto insetto in un tubo da centrifuga da 1,5 ml sterile e asciugare tutti i campioni a 45 ° C in un dispositivo concentratore a vuoto. Schiacciare tessuto essiccato con un pestello di plastica sterile.
- Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit adatto per l'estrazione del DNA suolo. Trasferire il tessuto secco al tubo di reazione del kit e seguire le istruzioni come indicato dal produttore.
- Determinare la concentrazione del DNA eluito finale utilizzando uno spettrofotometro.
- Verifya successo estrazione del DNA microbico metagenomic dall'intestino insetto preparando un test PCR diagnostica utilizzando eubatterica primer generali 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) e 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Impostare la reazione di PCR come segue:
- Impostare una miscela di reazione contenente 50 microlitri 1x tampone, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM quattro trifosfati deossinucleoside (dNTP), 2.5 U di Taq DNA Polymerase, 0,5 mM di ciascun primer e 60 ng di DNA estratto come template.
- Eseguire reazioni PCR utilizzando un termociclatore come segue: denaturazione iniziale a 94 ° C per 3 min, seguiti da 35 cicli: 94 ° C per 45 sec, annealing a 55 ° C per 30 sec, ed estensione a 72 ° C per 1 min . Utilizzare una fase di estensione finale a 72 ° C per 10 min.
- Verifica successo amplificazione PCR in un agarosio 1% elettroforesi bromuro di etidio (EB) gel colorato (sciogliere 1 g di agarosio in 100 ml di tampone TAE 1x e macchia con 1ml EB). Cassetta di 5 ml di the PCR prodotto + 1ml di 6x loading dye nelle tasche di gel. (TAE 1x = 40 mM Tris-Base, 20 mM di acido acetico glaciale, 1 mM EDTA, regolare a pH 8).
- Eseguire il gel utilizzando tampone 1xTAE a 300 V, 115 mA per ca. 20 min in una camera di elettroforesi. Utilizzando una camera di documentazione gel (transilluminatore UV collegato ad una fotocamera digitale e computer) osservare il gel e confrontare le dimensioni del vostro prodotto finale con il gene marcatore anche caricato, la dimensione corretta delle ampliconi deve essere di circa 1,5 kb.
- Immagazzinare i prodotti di PCR in condizioni di surgelazione, preferibilmente -80 ° C, fino al momento dell'uso.
5. Separazione-CsCl DNA Gradient Ultracentrifugazione
- Preparare i reagenti per i gradienti per ultracentrifugazione come segue:
- Preparare una M di cloruro di cesio (CsCl) soluzione 7.163 sciogliendo gradualmente 603,0 g di CsCl in DDH 2 O e riempire fino a un volume finale di 500 ml.
- Accuratamente deTermine la densità della soluzione CsCl preparata pesando 1,0 ml aliquota su un equilibrio tre cifre da triplicato. Questo varia solitamente da 1,88 e 1,89 g / ml a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone gradiente (Tris 100 mM, KCl 100 mM e EDTA 1 mM) combinando 50 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml di 0,5 M EDTA (pH 8) e 3,75 g di KCl in un finale volume di 500 ml con DDH 2 O. Filtro (0,22 micron) e sterilizzare in autoclave questa soluzione.
- Separazione DNA
- Avendo stabilito la concentrazione di DNA individuale degli insetti trattati, misurato come al punto 4.3, piscina quegli insetti corrispondenti ad una replica insieme e normalizzare la loro concentrazione DNA per garantire che ciascuno, ugualmente contribuisce al campione collettivo. Una concentrazione finale di 500-5,000 ng di DNA (misura nuovamente la concentrazione finale) è adatto per il processo ultracentrifugazione 21.
- Per impostare il dislivello medio, unire il DNA quantificato, buffer di pendenza di und 4.8 ml di soluzione 7.163 M CsCl insieme ad un volume misto di 6,0 ml in una provetta sterile da 15 ml con tappo a vite (generazione di una miscela medio DNA gradiente).
- Posizionare accuratamente la miscela medio DNA gradiente preparato in una provetta da 5,1 ml ultracentrifuga (riempire fino alla base del collo tubo) usando una siringa con ago. Evitare di pompaggio o la formazione di eventuali bolle d'aria. Includere almeno un gradiente bianco (usando DDH 2 O invece di DNA) in ogni corsa centrifuga come gradiente di riferimento.
- Coppie di tubi Saldo entro 10 mg di peso dopo ogni dislivello medio richiesto è riempito nella rispettiva provetta ultracentrifuga. Sigillare il tubo con un "Topper Tube" e assicurarsi che il sigillo è a tenuta invertendo il tubo e applicando una pressione moderata a mano.
- Utilizzare un rotore verticale vicino con otto pozzi per lo svolgimento di 5,1 ml tubi ultracentrifugazione per l'ultracentrifugazione. Sigillare accuratamente i pozzetti del rotore e caricare il rotore nello ultracentrifuga secondo il mAistruzioni di azienda i valori. Impostare le condizioni ultracentrifugazione: centrifuga a 50.000 rpm (circa 177.000 xg), temperatura a 20 ° C, e ultracentrifugazione durata per 40 ore con il vuoto. Selezionare massima accelerazione e la decelerazione senza freno.
- Una volta terminato, rimuovere con attenzione i tubi dal rotore della centrifuga con pinze. Metterli in un rack senza disturbare i gradienti formate all'interno dei tubi. Elaborare i campioni di frazionamento gradiente appena possibile per minimizzare qualsiasi diffusione.
- Recupero di DNA da gradienti isopicnica separati da frazionamento
- Utilizzare un accurato sistema di pompa HPLC per effettuare il frazionamento gradiente, che separa ugualmente i gradienti formate dal metodo di spostamento superiore del tubo ultracentrifuga. Collegare la pompa HPLC (100% di pendenza di flusso) per la bottiglia riempita con 1 L di spostamento DDH 2 O e strettamente collegare al tubo della pompa aperta con un 23 G 1 ago della siringa. Aggiungere sufficiente bromophenol colorante blu per la DDH 2 O per dargli un colore blu scuro. Questo facilita la visualizzazione dell'interfaccia tra il gradiente medio e lo spostamento di DDH 2 O.
- Impostare la pompa ad una portata di 850 ml / min ed equilibrare il sistema fino a quando una goccia del colore blu DDH 2 O emerge dalla siringa.
- Fissare accuratamente il tubo ultracentrifuga a un supporto pinza e perforare il fondo del tubo con una siringa 23 G 1 in lungo ago. Collegare la pompa al tubo ultracentrifuga inserendo l'ago attaccato al tubo della pompa nella parte superiore del tubo, e raccogliere gocce dal basso direttamente in provette da 1,5 ml microcentrifuga sterili. Raccogliere una piccola parte ogni 30 sec, pari a circa 425 microlitri per ogni frazione ed un totale di 12 frazioni per gradiente. Si noti che l'ultima frazione (frazione 12) contiene di solito lo spostamento DDH 2 O e deve essere eliminata.
- Dopo il frazionamento, miasure la densità di tutte le frazioni separate utilizzando una bilancia analitica di cui al punto 5.1.2.
- Precipitare il DNA da ogni frazione (circa 425 ml) dalla prima aggiungendo 1 ml di glicogeno (20 mg / mL in DDH 2 O, autoclavato) come supporto per la precipitazione della bassa quantità di DNA. Mescolare bene per inversione.
- Aggiungere due volumi (850 microlitri) di polietilene glicole soluzione (PEG) (sciogliere 150 g di polietilenglicole 6000 e 46,8 g di NaCl in DDH 2 O ad un volume totale di 500 ml. Filtro, sterilizzare e autoclave. La soluzione PEG è 30 % PEG 6000 e 1,6 M NaCl), e mescolare ancora una volta capovolgendo dieci volte.
- Lasciare le provette a temperatura ambiente per almeno due ore (se necessario, durante la notte) per precipitare il DNA.
- Centrifugare i precipitati a 13.000 xg per 30 minuti a RT. Un pellet visibile dovrebbe formare.
- Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e lavare il precipitato con 500 ml di etanolo al 70%. Centrifugare sotto lo stessocondizioni per 10 min di nuovo.
- Eliminare attentamente il supernatante e aria asciugare il pellet a temperatura ambiente per 15 min.
- Riprendere il pellet di DNA secca in 30 ml di DDH 2 O e mescolare bene picchiettando delicatamente il tubo. Quantificare il DNA in ogni frazione gradiente come al punto 4.3 Conservare i campioni sotto -20 o -80 ° C se è richiesta una conservazione a lungo termine.
6. DNA Caratterizzazione da Pyrosequencing
- Assicurarsi che il DNA nativo non marcato (12 C) occupa l'intervallo di densità di 1.705 g / ml a 1.720 g / ml, mentre 13 C-marcato DNA ha una densità di circa 1,720-1,735 g / ml. Si noti che sia il nativo e 13 C-marcato DNA estratto da campioni ambientali possono estendersi su più frazioni gradiente. Aspettarsi il DNA luce di essere associata alle frazioni 9-11 e il DNA pesante per essere associati con le frazioni 4-6.
- Combina frazioni chiave per creare un unico "compilato" frazione ac rappresentantecondo la ripartizione picco specifica del DNA densità risolta. In alternativa, altri mezzi per esaminare le frazioni separate utilizzando la spettrometria di massa rapporto isotopico (IRMS) 22 o un metodo di impronte digitali, come elettroforesi su gel denaturante gradiente (DGGE) 23, consentono di scegliere frazioni appropriate prima del sequenziamento.
- Eseguire pyrosequencing delle PCR-amplificate 16S rRNA geni batterici provenienti dalle frazioni pesanti, medi e leggeri compilati di ogni singolo gradiente. Usando questo metodo, l'identificazione della linea e l'abbondanza relativa delle specie di batteri metabolicamente attive nel SIP campioni incubata è possibile. Eseguire pyrosequencing come segue:
- Eseguire amplicone pyrosequencing utilizzando uno strumento FLX Roche 454 con reagenti titanio.
- Preparare ampliconi codici a barre per multiplexing utilizzando il primer di fusione impostato Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) e Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 esteso con °e rispettivo fondo adattatore A / B e identificatori multiplex specifico campione (MID).
- Applicare una PCR one-step con 30 cicli, utilizzando un polimerasi Hot Start Taq, per generare la libreria sequenziamento.
- Sequenza gli ampliconi in base al protocollo di fornitori, ed estendere la legge dalla direzione in avanti (Gray28F), come descritto nella http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyrosequencing Analisi dei dati
- Analizzare la sequenza grezza letture generato dal 454 pyrosequencing con le "intuizioni quantitativi nella ecologia microbica", software QIIME gasdotto 26. Esecuzione dell'elaborazione come segue:
- Inizialmente, convertire il file SFF 454-macchina-generato FASTA, QUAL e file Flowgram con lo script process_sff.py.
- Convalidare il file di mapping (sulla base di check_id_map.py) e assegnare multiplex legge al sam biologicoples con lo script split_libraries.py. Tagliare la bassa qualità si conclude con una dimensione della finestra scorrevole di 50 e un parametro di qualità media cutoff di 25, eliminano anche brevi sequenze ambigue (la lunghezza <200 bp) dal dataset.
- Denoise i dati 454 utilizzando il denoise_wrapper.py.
- Avanti, gruppo l'alta qualità legge in unità tassonomiche operative (Otus) utilizzando il multiplo OTU raccogliendo metodo (pick_otus.py con il 97% similarità di sequenza cut-off).
- Scegliere una sequenza rappresentante di ogni OTU utilizzando pick_rep_set.py.
- Assegnare tassonomia al set rappresentante sequenza in base a assign_taxonomy.py. Utilizzare il classificatore progetto di database ribosomiale (RDP) con una fiducia minima per l'assegnazione record stabilito a 0,80.
- Allineare la sequenza rappresentante insieme contro le preallineati Greengenes fondamentali 16S sequenze utilizzando l'algoritmo PyNast (align_seqs.pycon il minimo identità di sequenza percentuale impostata su 75).
- Inoltre, riducono le chimere da ulteriori analisi eseguendo identify_chimeric_seqs.py.
- Rimuovere tutte le posizioni gap (non utili per l'inferenza filogenetica) con il modello lanemask (filter_alignment.py) prima di costruire un albero filogenetico (make_phylogeny.py).
- Infine, generare tabelle OTU con make_otu_table.py, descrivendo il verificarsi di filotipi batteriche all'interno di ogni campione. Utilizzare la tabella OTU per costruire il heatmap per confrontare l'abbondanza e attività batterica.
- Se necessario, calcolare l'alfa e beta diversità all'interno e tra i campioni, rispettivamente. Allo stesso modo, le curve di rarefazione (grafici di diversità rispetto a profondità sequencing) e Principal Coordinate Analysis (PCOA) Trame rappresentano le relazioni tra le comunità microbiche possono anche essere preparati.
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Representative Results
Per ottenere un'etichettatura adeguata dei batteri metabolicamente attive presenti nell'intestino dell'insetto, l'insetto deve essere esposto alla ricca-C substrato 13 per un periodo già ottimizzata sufficiente per consentire la separazione della frazione più pesante etichettata facilmente dal marcato leggero. Nel nostro caso, 13 C-glucosio è stata integrata nella dieta artificiale ad una concentrazione finale di 10 mM per 1 giorno (Figura 1A). La stessa quantità di glucosio normale (Figura 1B) è stata fornita nella dieta artificiale degli insetti controllo. Come già accennato, la separazione delle frazioni di DNA (più pesante da accendisigari) è la base di tutto il processo. Pertanto, il primo passo da eseguire è l'estrazione di DNA dal tessuto di interesse, in questo caso, la comunità batterica associata nell'intestino dell'insetto. Per confermare la sua qualità, è importante eseguire un gel elettroforesi per determinare se il DNA a tutti è stato ottenuto dalla analisitessuto zed. In Figura 1C, è osservabile una forte banda di DNA genomico nella parte superiore dell'immagine confermando l'estrazione del DNA positivo. Inoltre, è necessario eseguire una diagnosi mediante PCR, utilizzando primer universali batteriche, per determinare la presenza di DNA batterico (Figura 1D). Questo risultato positivo è importante per decidere se proseguire ulteriormente con la separazione del DNA metagenomico estratto.
Dopo ultracentrifugazione, una volta confermata la quantità di DNA in ciascuna frazione separata, e la misura della densità è fatto, tracciare la densità media frazione in g / ml su numero frazione per confermare la corretta formazione di pendenza in tubi, che normalmente copre una gamma di densità da 1.690 (per frazione 12 o 11) per g / ml 1.760 g / ml (Per frazione 1). Pyrosequencing quantitativa viene eseguita direttamente sulle pendenze SIP rappresentativi di rivelare specie lignaggio e abbondanza relativa (Figura 2 13 C-glucosio e il controllo senza etichetta, che serviva per il profiling popolazioni attive nella comunità. Dopo il sequenziamento, per un totale di 120.045 di alta qualità legge con una lunghezza media di 404 nucleotidi sono stati generati. Il profilo pyrosequencing mostrato un aumento abbondanza di alcune specie compresi Enterococcus e Pantoea nel campione marcato (13 C-marcato DNA, Figura 3) rispetto a quella del gruppo di controllo (12 DNA di controllo C, Figura 3). Pertanto tali batteri sono considerati metabolicamente attiva, e meritano ulteriore studio.
Esperimento Figura 1. Alimentazione 13 C-glucosio, estrazione del DNA e amplificazione PCR del 16S rRNA batterico gen e. (A) 13 C-glucosio modificato dieta artificiale consumato da Spodoptera littoralis larve. (B) glucosio Native (12 C-glucosio) ha modificato la dieta artificiale consumato da larve dallo stesso lotto di insetti utilizzati in (A), che serve come controllo . (C) estratto Tipica DNA metagenomic dal tessuto intestinale delle larve nel gruppo di trattamento 13 C-glucosio e nel gruppo di controllo 12 C-glucosio. Tre repliche biologiche (corsia 1, 2 e 3) sono inclusi in ogni gruppo. M sta per 1 kb DNA marcatore. (D) amplificazione PCR con genera i corretti prodotti genici 1,5 kb 16S rRNA usando il DNA estratto metagenomic come template una serie di primer universale batterica. Lanes 1 è il controllo positivo di PCR. Corsia 2 e 3 rappresentano il C-glucosio campione 13 trattati e di controllo 12 C-glucosio, rispettivamente. jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Schema di un esperimento Pyro-SIP coinvolge densità CsCl gradiente ultracentrifugazione e caratterizzazione frazione con pyrosequencing del DNA separati. H = maggiore abbondanza, L = minore abbondanza. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Diversità batterica e la relativa abbondanza nelle frazioni pesanti del glucosio alimentato larve nativo (12 DNA C-controllo) e 13 C-glucosio larve alimentate (DNA 13 C-marcato)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
L'intestino della maggior parte degli insetti ospita una comunità microbica ricco e complesso, in genere 10 7 -10 9 cellule procariote alloggiano lì, superando in numero le cellule dell'ospite nella maggior parte dei casi. Così, l'intestino insetto è un "hot spot" per diverse attività microbiche, che rappresenta molteplici aspetti delle relazioni microbici, da patogenesi di obbligare mutualismo 27. Anche se molti studi hanno descritto una straordinaria varietà di comunità microbiche dell'intestino insetti, caratterizzazione dell'attività metabolica del microbiota è rara. Approcci di isotopi stabili di sondaggio offrono ora la possibilità di distinguere i membri attivi provenienti da un microbiota sfondo complesso indipendente di coltivazione e anche in vivo. Abbiamo applicato questo prezioso strumento per studiare la flora intestinale in un sistema modello insetto, foglia verme del cotone (Spodoptera littoralis). Dal momento che il glucosio è lo zucchero dominante nell'intestino di cotone leafworm, in questa dimostrazione abbiamo alimentato la larVAE con una dieta artificiale arricchito con una dose extra ma fisiologico di 13 C-glucosio per monitorare i batteri metabolicamente attivi nella flora intestinale. Un'incubazione identico stabilito con glucosio nativo disponibile un controllo critico per il successivo raffronto per garantire che l'etichettatura apparente di acido nucleico non è un artefatto del metodo stesso, come ad alta contenuto G+ C in DNA contribuire alla separazione. La quasi in situ concentrazione di glucosio ulteriormente ridotto pregiudizi sperimentale. Altre considerazioni relative a un rigoroso apparato sperimentale dello studio di DNA-SIP è stato discusso altrove 28,29. I batteri intestinali normalmente sono metabolicamente molto attivi e hanno breve tempo di generazione rispetto ai microrganismi dalla maggior ambienti terrestri e acquatici. Così una 24 ore alimentando in continuo causato già un sistema di etichettatura significativo. Si noti che una grande quantità di ospitante DNA genomico è stato anche coestratte dai tessuti intestinali, che dovrebbero essere tenendoconsiderazione quando si parla dei risultati.
La tipica caratterizzazione frazione gradiente si basa sui metodi di fingerprinting bassa risoluzione, come il terminale di restrizione frammento lunghezza polimorfismo (T-RFLP), e il tempo di costruzione di biblioteche clone per collegare i dati. E 'solo di recente che l'avvento di high-throughput di seconda generazione tecnica di sequenziamento consente la rapida, analisi costi-efficacia, e dettagliato delle comunità microbiche complesse. Qui abbiamo applicato questa nuova tecnologia per rilevare direttamente la composizione genetica delle frazioni gradiente di densità e di identificare i batteri metabolicamente attivi, che hanno dato maggiore sensibilità rispetto ai metodi basati elettroforesi gel, e facilitata la successiva classificazione filogenetica. Confrontando frazioni pesanti equivalenti sia dal 13 C-marcato e 12 campioni di C-controllo, troviamo che Pantoea e Enterococcus divennero etichettati su isotopo sondaggio. Una volta che il MetabSono stati individuati batteri olically attive, altre analisi come l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde specifiche e analisi metagenomica del DNA marcato recuperati dai membri della comunità attivi può essere condotta per fornire un quadro completo nella veri simbionti associati con l'host . Basato sul sistema stabilito qui, altre fonti di carbonio 13 C-marcato potrebbero anche essere alimentati nell'ospite per sezionare i batteri coinvolti nell'intestino via metabolica mirata, ad esempio, la cellulosa etichettatura per identificare batteri attivi coinvolti nel processo di digestione ospitante. Con lo sviluppo di questi nuovi approcci, il ruolo di insetto microbiota diventerà più evidente di quanto attualmente.
Collettivamente, il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice, rapido ed efficace per determinare le attività metaboliche del microbiota intestinale, che ha ulteriormente potrebbe essere applicato per valutare il ruolo specifico di bactesimbionti Rial nella nutrizione ospitante, la disintossicazione, e la difesa.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Angelika Berg per l'assistenza di laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto e finanziato dalla Max Planck Society e la Scuola di Jena per microbica Communication (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
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