Summary
Den aktive bakterielle samfund er forbundet med tarmen hos Spodoptera littoralis, blev bestemt ved stabil isotop-probe (SIP) koblet til pyrosekventering. Ved hjælp af denne metode blev identifikation af metabolisk aktive bakteriearter i samfundet gjort med høj opløsning og præcision.
Abstract
Tarme af de fleste insekter beboet af komplekse samfund af symbiotiske patogene bakterier. Inden for sådanne mikrobielle samfund er det muligt at identificere kommensale eller mutualistic bakteriearter. Sidstnævnte dem, er blevet observeret til at tjene flere funktioner til insektet, dvs hjælper i insekt reproduktion 1, øge immunresponset 2 feromon produktion 3, samt ernæring, herunder syntesen af essentielle aminosyrer 4, blandt andre.
På grund af vigtigheden af disse foreninger, er blevet gjort mange bestræbelser på at karakterisere de samfund ned til de enkelte medlemmer. Men de fleste af disse bestræbelser blev enten baseret på dyrkningsmetoder eller påberåbt sig den generation af 16S rRNA-genet fragmenter, der blev sekventeret til endelig identifikation. Desværre er disse metoder kun identificeret bakteriearter til stede i tarmen, og forudsat at der ikke information den metaboliske aktivitet af mikroorganismer.
At karakterisere de metabolisk aktive bakteriearter i tarmen af et insekt, brugte vi en stabil isotop sondering (SIP) in vivo beskæftiger 13 C-glucose som en universel substrat. Dette er en lovende kultur-fri teknik, der tillader binding af mikrobielle fylogenier deres særlige metaboliske aktivitet. Dette er muligt ved at spore stabile isotopmærkede atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, såsom DNA og RNA 5. Inkorporeringen af 13C-isotoper i DNA øger densiteten af det mærkede DNA i forhold til det umærkede (12 C) en. I sidste ende er det 13C-mærkede DNA eller RNA separeret ved densitetsgradient ultracentrifugering fra 12 C-mærket tilsvarende ét 6. Efterfølgende molekylær analyse af de separerede nukleinsyre isotopomers tilvejebringer forbindelsen mellem metabolisk aktivitet og identitet af arten.
Her præsenterer vi den protokol, der bruges til at karakterisere de metabolisk aktive bakterier i tarmen af en generalist insekt (vores model-system), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Ugler). Den fylogenetisk analyse af DNA blev udført under anvendelse af pyrosekventering, hvilket gav høj opløsning og præcision i identifikationen af insekt gut bakteriel samfund. Som vigtigste substrat blev 13C-mærket glucose, der anvendes i forsøgene. Substratet blev tilført til insekter ved hjælp af en kunstig diæt.
Introduction
Insekt-bakterielle symbiotiske foreninger er kendt for et stort antal insektarter 7. I disse symbiotiske foreninger, mikroorganismer spiller en vigtig rolle i vækst og udvikling af insekter. Mikrober har vist sig at bidrage til insekt reproduktion 1 feromon biosyntese 3, ernæring, herunder syntese af essentielle aminosyrer 4, og fordøjelse af utilgængelig fødevarer til værten. Trods det store udvalg af tarm-bakterie foreninger er langt mindre kendt om den funktionelle rolle, de spiller til fordel for insekt. Kun i tilfælde af termitter, symbiotisk fordøjelse af lignocellulose udføres af prokaryoter, protozoer og svampe, er blevet bredt undersøgt 8,9. I modsætning til dette, er lidt om det symbiotiske association til stede i tarmen af generalist insekter dvs bomuld leafworm, Spodoptera littoralis. Som følge af deres hyppige skift af plante værter, generelist insekter og deres tarmassocierede bakterielle samfund er permanent udsat for nye udfordringer i forbindelse med deres fodring vaner forbrugende planter med et væld af fytokemikalier. Udover dette, tarmen miljø Lepidoptera'er udgør i sig selv et barsk miljø for vækst af bakterier på grund af den høje tarm pH 10. Især i tilfælde af S. littoralis, det varierer fra 10,5 i foregut, ca. 9 i mellemtarmen til pH næsten 7 i stortarmen 11. På den anden side, den bakterielle samfund er forbundet med tarmen S. littoralis er enkel. Tang, Freitak, m.fl. 12. Rapporteret højst 36 phylotypes tilhører alt 7 forskellige bakteriearter, som de eneste medlemmer af den bakterielle samfund er forbundet med denne insekt. Ud over dette er ikke kompliceret procedure opdræt kræves for væksten insekt i laboratoriet. Desuden er denne og den korte livscyklus insekt lette multi-generational undersøgelser, vender denne art i en ideel model for at studere gut-mikrobe interaktioner.
Med fremkomsten af PCR-baserede sekventering teknologier, er antallet af undersøgelser, der beskæftiger sig med tarm biota af adskillige organismer (dvs. mennesker, insekter eller marine organismer) øges. Desuden er resultaterne uafhængige af isolering og dyrkning af tarmen nærede bakterier i fortiden. Næsten 99% af bakterier er ikke dyrkbare og er vanskelig 12 simulering af de miljømæssige forhold i tarmen. Ved hjælp af PCR, kunne 16S rRNA-genet fragmenter (en udbredt fylogenetisk genmarkør blandt bakterier) selektivt amplificeret fra en blandet DNA-skabelon af tarmen bakterielle samfund, sekventeret og klonet. Med denne information, brugeren er i stand til at identificere de bakteriearter efter hentning sekvensen oplysninger fra offentlige databaser 13,14. Alligevel sekventering tilgange til at beskrive bakterielsamfund fortsat utilstrækkelig på grund af manglende oplysninger om den iboende metaboliske bidrag af de enkelte arter inden for fællesskabet.
Stabil-isotop sondering (SIP) er en lovende kultur-fri teknik. Det er ofte brugt i miljø mikrobiologi til at analysere mikrobielle fylogenier knyttet til særlige metaboliske aktiviteter. Dette opnås ved at spore stabile isotopmærkede atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, såsom phospholipid-afledte fedtsyrer, DNA og RNA 5. Når man overvejer nukleinsyrer den metode, der er baseret på adskillelse af 13C-mærket DNA eller RNA fra den umærkede DNA ved densitetsgradient ultracentrifugering 6. På grund af denne direkte forbindelse mellem DNA etiketten og metabolisk aktivitet, en nedstrøms molekylær analyse af nukleinsyrerne identificerer arten og giver information om metaboliske aktiviteter. Desuden kombination af DNA-SIP og pyrosekventering som anvendt afPilloni von Netzer et al. 15. tillader en særlig enkel og følsom identifikation af bakteriearter til stede i den tunge 13C-mærkede DNA-fraktion. Indtil nu er denne teknik blevet anvendt til at beskrive de bakterielle samfund involveret i biokemiske processer i jorden under aerobe 16,17 og anaerobe betingelser 18,19. Udover anvendelsen i miljøvidenskab er teknikken blevet anvendt i medicinske videnskaber som rapporteret af Reichardt, et al. 5, der beskrev de metaboliske aktiviteter i forskellige fylogenetiske grupper af den menneskelige tarm mikrobiota som reaktion på en ufordøjelig kulhydrat.
Her bruger vi 13C-glucose til "etiket" DNA'et af metabolisk aktive bakteriearter i tarmen. Glucose er en sukker anvendt af de fleste bakteriearter langs udbredt Entner-Doudoroff (ED) pathway, selv om undtagelser er kendte 20. Detretfærdiggør brugen af 13C-glucose som en pålidelig metabolisk sonde, der giver en sammenhæng mellem metabolitter af interesse og kulstof kilde langs etablerede veje. Afhængigt af de videnskabelige spørgsmål andre substrater, dvs 13C-methan, 13 CO 2 eller planter opdrættet under en 13 CO2-atmosfære, kan anvendes til at behandle metaboliske aktiviteter.
På dette tidspunkt, vi præsenterer den protokol, der anvendes i den metaboliske karakterisering af tarmen bakterielle samfund af en generalist insekt, nemlig S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Desuden blev den teknik koblet til Pyrosequencing, hvilket muliggør identifikation af insekt gut bakteriel samfund med høj opløsning og præcision. Da det primære substrat blev 13C-mærket glucose anvendt under forsøgene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Insect Opdræt
- Købe eller få æg kløerne på Spodoptera littoralis fra dit eget opdræt. Bevar dem i sterile petriskåle ved stuetemperatur (RT), indtil klækning.
- Forbered den kunstige kost for de insekter, opdræt som følger:
- Soak 500 g hakket hvide bønner natten over i 100 ml vand.
- Tilføj 9,0 g ascorbinsyre og 75 g agar til 1.000 ml destilleret H2O og derefter koges.
- Lad blandingen køle ned, og når den størkner (til et hvidt voksagtigt fast stof blanding) opbevare det ved 4 ° C indtil brug.
- Overfør nyklækkede larver til en ren plastik kasse og bag dem på den kunstige kost ved 23-25 ° C under en lang dag regime med 16 timer af belysning og 8 timers mørke. Skift mad hver dag, indtil larverne gå igennem alle seks larvernes instars.
2.. 13C-mærkning af DNA i metabolisk aktive tarmbakterier
- 186,1 mg fuldt 13C-mærket glucose med destilleret og deioniseret vand (ddH2O) og blandes det godt med 100 g kunstig kost for SIP eksperiment. At sikre en endelig 13C-glucose koncentration på 10 mM i den kunstige kost. Dette efterligner in situ glucosekoncentration i tarmen S. littoralis larver fodring på bomuld planter i henhold til Shao et al. (indsendt).
- Overførsel 9-15 sund andet stadium larver fra boksen opdræt til sterilt plastik petriskåle (en larve pr petriskål) indeholdende friske 13C-glucose tilsat kunstig kost. Brug kunstig diæt indeholdende den samme mængde nativ glucose (12 C-glucose), som beskrevet, til tilførsel kontrolgruppen.
- Forny den kunstige kost ofte i inkubationstiden (1 dag). Brug opdrætsforhold som i trin 1.3.
- Saml ni larver fra hver behandling til senere behandling (DNA ekstraktion). Hvertreplikere består af tre personer, foretage mindst tre gentagelser pr behandling.
3. Insect Dissection
- Rengør og desinficer dissekere værktøjer i begyndelsen af arbejdet med ethanol 70% (Værktøjer = Vännäs saks, pincet og skalpel med fine engangsklinger).
- Tag insekter med en blød pincet og vaske deres hud overfladisk med destilleret vand. Læg dem på is i mindst 30 minutter for at bedøve dem.
- Mens stadig bedøvet placere dem ved 0 ° C i 1 time for at dræbe dem. Desinficere døde insekter overfladisk ved at nedsænke dem i ethanol (70%) i et par minutter.
- Udfør insekt dissektion til et volumen på ca 15 ml 1x PBS aflejret på en steril petriskål (1XPBS = 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2PO 4, pH-værdien justeres til 7,4 autoklav). Vær sikker på at have det hele insekt krop helt nedsænket i solution under hele dissekere periode.
- Begynd dissektion ved at gøre et snit i huden langs højre og venstre side af insektet, begynde på hovedet og slutte på anus. Fjerne hele hud, Malpighian tubuli og fedt kroppen. Skift til frisk buffer før opskæring åbne tarmen. Afsnit tarmen i forgrunden-, mid-og stortarmen når det er påkrævet. Opbevar væv i fryser (-80 til -20 ° C), indtil DNA-ekstraktion
4.. DNA Udvinding og Forstærkning
- Placer insekt væv i en 1,5 ml sterilt centrifugerør og tør alle prøver ved 45 ° C i en vakuum-koncentrator enhed. Knus tørret væv med en steril plastik pistil.
- Uddrag genomisk DNA ved anvendelse af et egnet kit til jord DNA-ekstraktion. Overfør det tørre væv til reaktionsrøret af kittet og følg instruktionerne som angivet af producenten.
- Bestemme koncentrationen af den endelige eluerede DNA under anvendelse af et spektrofotometer.
- Verifya succesfulde ekstraktion af den mikrobielle metagenomisk DNA fra insekt tarmen ved fremstilling af en diagnostisk PCR-assay under anvendelse eubakterielle generelle primere 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) og 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Indstil PCR-reaktion som følger:
- Sæt en 50 ul reaktionsblanding indeholdende 1x buffer, 1,5 mM MgCl2, 10 mM fire deoxynukleosidtriphosphater (dNTP'er), 2,5 U Taq DNA-polymerase, 0,5 mM af hver primer og 60 ng af det ekstraherede DNA som template.
- Kør PCR-reaktioner under anvendelse af en thermocycler som følger: indledende denaturering ved 94 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 35 cyklusser: 94 ° C i 45 sekunder, annealing ved 55 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 1 min . Brug en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 min.
- Kontroller vellykket PCR-amplifikation i en 1% agarose elektroforese ethidiumbromid (EB) farvet gel (opløse 1 g agarose i 100 ml 1x TAE buffer og pletten med 1 pi EB). Depositum 5 pi af the PCR-produkt + 1 pi af 6x loading dye i gelen lommer. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM eddikesyre, 1 mM EDTA, indstilles til pH 8).
- Kør gelen ved hjælp 1xTAE buffer ved 300 V, 115 mA i ca. 20 min i en elektroforese kammer. Ved hjælp af en gel dokumentation kammer (UV transilluminator tilsluttet et digitalt kamera og computer) observere gelen og sammenligne størrelsen af din endelige produkt med det også fyldt genmarkøren, den korrekte størrelse amplikonerne skal være på cirka 1,5 kb.
- Opbevar PCR produkter under dybfrysning betingelser, fortrinsvis -80 ° C, indtil anvendelse.
5.. DNA Separation-CsCI ultracentrifugering
- Forbered reagenser til stigninger for ultracentrifugering som følger:
- Forbered en 7,163 M cæsiumchlorid (CsCl) løsning ved gradvist opløse 603,0 g CsCl i Hedeselskabet 2 O og fylde op til et endeligt volumen på 500 ml.
- Præcist beTermine densiteten af den fremstillede CsCl opløsning ved afvejning af en 1,0 ml alikvot på et trecifret balance ved triplo. Dette spænder normalt fra 1,88 og 1,89 g / ml ved RT.
- Forbered gradient buffer (100 mM Tris, 100 mM KCl og 1 mM EDTA) ved at kombinere 50 ml 1 M Tris-HCI (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) og 3,75 g KCl i en endelig volumen på 500 ml ved anvendelse af Hedeselskabet 2 O. Filter (0,22 um) steriliseres og autoklaveres denne løsning.
- DNA Separation
- Efter at have fastslået den enkelte DNA-koncentration af de behandlede insekter, målt som i punkt 4.3, pool de insekter, der svarer til en gengivelse sammen og normalisere deres DNA-koncentration for at sikre, at hver enkelt, bidrager også til samleprøve. En slutkoncentration på 500-5.000 ng DNA (måle igen slutkoncentration) er egnet til ultracentrifugering proces 21.
- For at opsætte gradient medium, kombinere den kvantificerede DNA, gradient buffer end 4,8 ml 7,163 M CsCl løsning sammen til en blandet volumen på 6,0 ml i en steril 15 ml skruelåg rør (generering af en gradient medium-DNA-blanding).
- Læg forsigtigt forberedt medium-DNA-blanding gradient i en 5,1 ml ultracentrifugerør (udfyld indtil bunden af røret halsen) ved hjælp af en sprøjte og kanyle. Undgå at pumpe eller danner luftbobler. Omfatte mindst én blank gradient (ved hjælp ddH2O stedet for DNA) i hver centrifuge køre som en henvisning gradient.
- Balance rør par til inden for 10 mg i vægt efter hvert krævet gradient medium fyldes i respektive ultracentrifugerør. Røret forsegles med en "Tube Topper" og sikre, at forseglingen er lækage-fri ved at vende røret og anvende moderat tryk med hånden.
- Brug en næsten vertikal rotor med otte brønde til at holde 5,1 ml ultracentrifugering rør for ultracentrifugering. Forsegle forsigtigt rotoren brønde og indlæse rotoren i ultracentrifuge henhold til manufacturer anvisninger. Indstil ultracentrifugering betingelser: centrifugering ved 50.000 rpm (omkring 177.000 xg), temperatur ved 20 ° C, og ultracentrifugering køretid til 40 timer med vakuum. Vælg maksimal acceleration og deceleration, uden at bremse.
- Når du er færdig, fjernes forsigtigt rørene fra centrifugen rotor ved hjælp af pincet. Læg dem i et rack uden at forstyrre de dannede gradienter inden rørene. PROCES gradient fraktionering prøver så hurtigt som muligt for at minimere eventuelle diffusion.
- Fremfinding af DNA fra isopyknisk Adskilt Gradienter ved fraktionering
- Brug en nøjagtig HPLC pumpe system til at udføre gradient fraktionering, som ligeledes adskiller de dannede gradienter fra ultracentrifugerør top forskydning metode. Slut HPLC-pumpe (100% flow gradient) til flaske fyldt med 1 L forskydning ddH2O og stramt tillægger åbne pumpe slange med en 23 G 1 i kanylen. Tilføj tilstrækkelig bromophenol blåt farvestof til ddH2O at give det en mørkeblå farve. Dette letter visualisering af grænsefladen mellem gradient medium og fordrivelse af Hedeselskabet 2 O.
- Indstil pumpen til en strømningshastighed på 850 ul / min og bringe systemet i ligevægt, indtil en enkelt dråbe af blåfarvet ddH2O dukker ud af kanylen.
- Forsigtigt fastsætte ultracentrifugerør til en klemme stå og gennembore bunden af røret med en sprøjte 23 G 1 i lang nål. Tilslut pumpen til ultracentrifugerør ved at indsætte nålen til pumpen slangen i toppen af røret, og indsamle dråber fra bunden direkte i sterile 1,5 ml mikrocentrifugerør. Saml en brøkdel hvert 30. sek, svarende til cirka 425 ul pr fraktion og i alt 12 fraktioner pr gradient. Bemærk, at den sidste fraktion (fraktion 12) indeholder sædvanligvis forskydningen ddH2O og skal kasseres.
- Efter fraktionering, migasure tætheden af alle udsorterede fraktioner ved hjælp af en analytisk balance som nævnt i trin 5.1.2.
- Udfældning af DNA'et fra hver fraktion (ca. 425 ul) ved først at tilsætte 1 pi glykogen (20 pg / pl i ddH2O, autoklaveret) som en bærer for udfældning af lav mængde af DNA. Bland det godt ved inversion.
- Tilsæt to volumener (850 ul) af polyethylenglycol (PEG)-opløsning (opløse 150 g polyethylenglycol 6000 og 46,8 g NaCI i ddH2O til et samlet volumen på 500 ml. Filter, sterilisere og autoklave. PEG opløsning er 30 % PEG 6000 og 1,6 M NaCl), og bland igen ved at vende ti gange.
- Lad rørene ved stuetemperatur i mindst to timer (eventuelt natten over) for at udfælde DNA'et.
- Centrifuger præcipitaterne ved 13.000 xg i 30 minutter ved stuetemperatur. Et synligt pellet bør indgå.
- Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette og vask bundfaldet med 500 pi 70% ethanol. Centrifuge under sammebetingelser for 10 min igen.
- Kassere forsigtigt supernatanten og lufttørre pillen ved stuetemperatur i 15 min.
- Genopløse tørrede DNA pellet i 30 pi ddH2O og bland godt ved forsigtigt at banke røret. Kvantificere DNA'et i hver gradientfraktion som i trin 4.3 Store prøverne under -20 eller -80 ° C, hvis langtidsopbevaring er påkrævet.
6.. DNA Karakterisering af Pyrosequencing
- Sikre, at det umærkede native (12 C) DNA indtager tætheden området fra 1,705 g / ml til 1.720 g / ml, mens 13C-mærket DNA har en massefylde på omkring 1,720 til 1,735 g / ml. Bemærk, at både den native og 13 C-mærket DNA ekstraheret fra miljøprøver kan spænde over flere gradientfraktioner. Expect lyset DNA at være forbundet med fraktioner 9-11 og den tunge DNA at være forbundet med fraktioner 4-6.
- Kombiner centrale fraktioner til at oprette en enkelt "kompileret" repræsentant fraktion achold til den specifikke højdepunkt fordeling af tætheden-løst DNA. Alternativt kan andre midler til at undersøge de separerede fraktioner ved hjælp af isotopforholdet massespektrometri (IRMS) 22 eller et fingeraftryk fremgangsmåde, såsom denaturerende gradient gel elektroforese (DGGE) 23, bidrager til at vælge passende fraktioner før sekventering.
- Udfør pyrosekventering af PCR-forstærkede bakterielle 16S rRNA-generne fra de indsamlede tunge, mellemledere og lette fraktioner enkelte gradient. Ved hjælp af denne metode, identifikation af afstamning og relative forekomst af metabolisk aktive bakteriearter i SIP inkuberes prøverne er mulig. Udfør pyrosekventering som følger:
- Udfør amplicon pyrosekventering anvendelse af en Roche 454 FLX instrument Titanium reagenser.
- Forbered stregkodede amplikoner for multiplexing hjælp af fusion primer sæt Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) og Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 udvidet med the respektive primer Adaptor A / B og prøve-specifikke multipleks id'er (MID).
- Anvende en ettrins-PCR med 30 cykler under anvendelse af en Hot StartTM Taq-polymerase, til at generere sekventering biblioteket.
- Sekventere amplikonerne baseret på leverandørens protokol, og udvide læser fra forlæns retning (Gray28F) som beskrevet i http://www.researchandtesting.com/ .
7.. Pyrosequencing Dataanalyse
- Analyser rå sekvens læser genereret af 454 pyrosekventering med de "kvantitative indsigt i mikrobiel økologi", QIIME software rørledning 26. Udfør behandlingen som følger:
- I første omgang konvertere 454-maskine-genererede SFF fil til FASTA QUAL og Flowgram filer med process_sff.py script.
- Godkend kortlægning fil (baseret på check_id_map.py) og tildele multiplex læser til biologisk sampler med split_libraries.py script. Trim lav kvalitet slutter med et glidende vindue størrelse på 50 og en gennemsnitlig kvalitet cutoff parameter 25, fjerne også korte tvetydige sekvenser (længden <200 bp) fra datasættet.
- Denoise de 454 data ved hjælp af denoise_wrapper.py.
- Dernæst klynge høj kvalitet læser i operationelle taksonomiske enheder (otus) ved hjælp af multiple OTU plukke metoden (pick_otus.py med 97% sekvens lighed cut-offs).
- Pick en repræsentativ sekvens fra hver OTU hjælp pick_rep_set.py.
- Tildel taksonomi til repræsentanten sekvens sæt baseret på assign_taxonomy.py. Brug Ribosomal Database Project (RDP) klassificeringen med et minimum tillid til rekord opgave sat til 0,80.
- Juster repræsentative sekvens sæt mod de prealigned Greengenes kerne 16S-sekvenser ved hjælp af algoritmen PyNast (align_seqs.pymed mindst sekvensidentitet procent indstillet til 75).
- Derudover nedbryder kimærer fra yderligere analyse ved at køre identify_chimeric_seqs.py.
- Fjern alle gap positioner (ikke nyttigt for fylogenetisk inferens) med lanemask skabelon (filter_alignment.py) forud for opbygningen af et fylogenetisk træ (make_phylogeny.py).
- Endelig generere otu borde med make_otu_table.py, der beskriver forekomsten af bakterielle phylotypes inden for hver prøve. Brug OTU tabellen at konstruere Heatmap til at sammenligne den bakterielle overflod og aktivitet.
- Hvis det er nødvendigt, beregne alfa og beta mangfoldighed inden for og mellem prøver. På samme måde kan rarefaction kurver (grafer af mangfoldighed versus sekventering dybde) og Principal koordinater Analysis (PCoA) parceller, der repræsenterer relationerne mellem mikrobielle samfund også blive forberedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå tilstrækkelig mærkning af metabolisk aktive bakterier i insekt tarmen skal insekt blive udsat for de 13 C-rige substrat for en tidligere optimeret periode tilstrækkelig til at tillade adskillelse af det mærkede tungere fraktion let fra den umærkede lysere én. I vores tilfælde blev 13C-glucose suppleret i den kunstige kost ved en endelig koncentration på 10 mM i 1 dag (figur 1A). Den samme mængde af normal glukose (figur 1B) blev leveret i den kunstige kost af kontrol insekter. Som nævnt før, adskillelse af DNA-fraktioner (tungere fra lighter) er grundlaget for hele processen. Derfor er det første skridt, der skal udføres, er ekstraktion af DNA fra væv af interesse, i dette tilfælde, den bakterielle samfund er forbundet med insekt tarmen. For at bekræfte dens kvalitet, er det vigtigt at have en elektroforesegel at afgøre, om nogen DNA overhovedet blev opnået ud fra anaZed væv. I figur 1C er det observeres et stærkt bånd af genomisk DNA i toppen af billedet, der bekræfter den positive DNA-ekstraktion. Desuden er det nødvendigt at udføre en diagnostisk PCR, ved hjælp af bakterielle universelle primere til at bestemme tilstedeværelsen af bakteriel DNA (figur 1D). Dette positive resultat er vigtigt at afgøre, om yderligere fortsætte med separation af det ekstraherede metagenomisk DNA.
Efter ultracentrifugering, når mængden af DNA i hver separerede fraktion er bekræftet, og målingen af densiteten er færdig, plotte den gennemsnitlige fraktion densitet i g / ml i løbet af fraktionen for at bekræfte den korrekte gradient dannelse i rør, der normalt dækker et tæthed fra 1.690 g / ml (til fraktion 12 eller 11) til 1.760 g / ml (For fraktion 1). Kvantitative pyrosekventering udføres direkte på de repræsentative SIP gradienter at afsløre arter afstamning og relativ overflod (figur 2 13 C-glucose ændret prøven og umærkede kontrol, hvilket tjente til profilering aktive befolkningsgrupper i samfundet. Efter sekventering alt 120.045 høj kvalitet læser med en gennemsnitlig længde på 404 nucleotider blev genereret. Den pyrosekventering profil viste en øget forekomst af visse arter, herunder Enterococcus og Pantoea i mærkede prøve (13C-mærket DNA, figur 3) sammenlignet med kontrolgruppen (12 C Control DNA, figur 3). Derfor de bakterier, anses for at være metabolisk aktive og fortjener yderligere undersøgelse.
Fig. 1. 13C-glucose fodringsforsøg, DNA-ekstraktion og PCR-amplifikation af det bakterielle 16S rRNA gen e. (A) 13 C-glucose ændret kunstig kost forbruges af Spodoptera littoralis-larver. (B) Native glucose (12 C-glucose) ændrede kunstig kost forbruges af larver fra samme batch af insekter, der anvendes i (A), der tjener som kontrol . (C) Typisk metagenomisk dna-ekstrakt fra tarmen væv af larver i de 13 C-glucose behandlingsgruppe og i 12 C-glucose kontrolgruppe. Tre biologiske gentagelser (bane 1, 2 og 3) er inkluderet i hver gruppe. M står for 1 kb DNA-markør. (D) PCR-amplifikation med en universel bakteriel primersæt genererer de korrekte 1,5 kb 16S rRNA-gen-produkter ved hjælp af det ekstraherede metagenomisk DNA som skabelon. Bane 1 er PCR positiv kontrol. Bane 2 og 3 repræsenterer 13C-glucose behandlede prøve og 12 C-glucose kontrol hhv. jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 2. Omridset af en Pyro-SIP eksperiment, der involverer CsCI densitetsgradientultracentrifugering og fraktion karakterisering med Pyrosequencing af den separerede DNA. H = højere overflod, L = lavere overflod. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Bakteriel diversitet og relativ overflod i de tunge fraktioner af den indfødte glukose fodret larver (12 C-kontrol DNA) og 13 C-glucose fodret larver (13 C-mærket DNA)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarmen hos de fleste insekter rummer en rig og kompleks mikrobielle samfund, typisk 10 7 -10 9 prokaryote celler indgive der, outnumbering værtens egne celler i de fleste tilfælde. Således insekt tarmen er et "hot spot" for forskellige mikrobielle aktiviteter, repræsenterer mange aspekter af mikrobielle relationer, fra patogenese at forpligte mutualisme 27. Selv om mange undersøgelser har beskrevet et fantastisk udvalg af insekt gut mikrobielle samfund, karakterisering af den metaboliske aktivitet af tarmen mikrobiota er sjælden. Stabile isotop sondering tilgange tilbyder nu en mulighed for at skelne de aktive medlemmer fra en kompleks mikrobiota baggrund uafhængig af dyrkning og selv in vivo. Vi anvendte denne værdifuldt værktøj til at studere tarmens mikrobiota i et insekt modelsystem, bomuld blad orm (Spodoptera littoralis). Da glukose er den dominerende sukker i tarmen bomuld leafworm i denne demonstration vi fodret LARvae med en kunstig diæt tilsat en ekstra, men fysiologisk dosis af 13C-glucose til at spore de metabolisk aktive bakterier i tarmfloraen. En identisk inkubation etableret med indfødte glukose forudsat et kritisk kontrolpunkt henblik på senere sammenligning at sikre, at enhver tilsyneladende mærkning af nukleinsyre ikke var en artefakt af selve metoden, såsom høj G+ C-indhold i DNA bidrager til adskillelse. Den nærmeste in situ koncentration af glukose desuden reduceret eksperimenterende bias. Andre betragtninger i relation til en streng forsøgsopstilling af DNA-SIP undersøgelse er blevet omtalt andetsteds 28,29. Gut bakterier, der normalt er metabolisk meget aktive og har kort generationstid i forhold til mikroorganismer fra de fleste terrestriske og akvatiske miljøer. Således kan en 24 timers kontinuerlig tilførsel forårsaget allerede en stor mærkning. Bemærk, at en stor mængde af genomisk værts-DNA blev også coextracted fra tarmvæv, der skal under hensyntagenovervejelse, når vi diskuterer resultaterne.
Den typiske gradientfraktion karakterisering bygger på lav opløsning fingeraftryk metoder, såsom terminal restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (T-RFLP) og tidskrævende klon bibliotek konstruktion til at forbinde data. Det er først for nylig, at fremkomsten af high-throughput andengenerations sekventering teknik giver mulighed for hurtig, omkostningseffektiv, og detaljeret analyse af komplekse mikrobielle samfund. Her anvendte vi denne nye teknologi til direkte kortlægge den genetiske sammensætning af densitet gradientfraktioner og identificere metabolisk aktive bakterier, hvilket gav øget sensitivitet i forhold til de gelelektroforesesystemer-baserede metoder, og lettet efterfølgende fylogenetiske klassificering. Ved at sammenligne tilsvarende tunge fraktioner fra både de 13 C-mærket og 12 C-kontrolprøver, finder vi, at Pantoea og Enterococcus blev mærket på isotop sondering. Når Metabolically aktive bakterier er blevet identificeret, kan gennemføres andre analyser, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH) ved hjælp af specifikke prober og metagenomisk analyse af den mærkede DNA inddrives fra aktive medlemmer af fællesskabet til at give et omfattende indblik i de sande symbionter forbundet med værten . Baseret på det etablerede system her, kan andre 13C-mærkede carbonkilder også tilføres i værten til at dissekere de involverede målrettet tarmen metaboliske vej bakterier, for eksempel mærkning af cellulose til at identificere aktive bakterier involveret i værten fordøjelsesprocessen. Med udviklingen af sådanne nye metoder, vil den rolle insekt gut mikrobiota blive mere synlige end i øjeblikket.
Kollektivt, protokollen beskrevet her repræsenterer en enkel, hurtig og effektiv metode til bestemmelse af metaboliske aktiviteter i tarmen mikrobiota, hvilket yderligere kunne anvendes til at vurdere den specifikke rolle bakterieRial symbionter i værtslandet ernæring, afgiftning, og forsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Angelika Berg til laboratorie assistance. Dette arbejde blev støttet og finansieret af Max Planck Society og Jena School for Mikrobiel Kommunikation (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
