Summary
المجتمع البكتيرية النشطة المرتبطة أمعاء littoralis ورق القطن، والتي يحددها مستقرة-سبر النظائر (SIP) بالإضافة إلى pyrosequencing. باستخدام هذه المنهجية، وقد تم التعرف على الأنواع البكتيريا عملية الأيض نشطة داخل المجتمع مع ارتفاع القرار والدقة.
Abstract
الشجاعة لمعظم الحشرات ويسكنها مجتمعات معقدة من البكتيريا التكافلية غير إمراضية. داخل هذه المجتمعات الميكروبية فمن الممكن لتحديد الأنواع المتعايشة أو البكتيريا المنفعة المتبادلة. تلك الأخيرة، وقد لوحظ أن تخدم وظائف متعددة لحشرة، أي مساعدة في مجال الإنجاب الحشرات 1، وتعزيز الاستجابة المناعية 2، وإنتاج فرمون 3، وكذلك التغذية، بما في ذلك تركيب الأحماض الأمينية الأساسية 4، وغيرها.
نظرا لأهمية هذه الجمعيات، وقد بذلت الكثير من الجهود لتميز المجتمعات وصولا الى أعضاء الفردية. ومع ذلك، فإن معظم هذه الجهود استندت إما على طرق الزراعة أو الاعتماد على توليد شظايا الجينات 16S الرنا الريباسي التي كانت لتحديد التسلسل النهائي. للأسف، حدد هذه الأساليب فقط الأنواع البكتيرية الموجودة في الأمعاء وعدم تقديم المعلومات حول عمليةايون على النشاط الأيضي من الكائنات الحية الدقيقة.
لتوصيف الأنواع البكتيرية عملية الأيض نشطة في القناة الهضمية للحشرة، وكنا النظائر مستقرة التحقيق (SIP) في الجسم الحي توظيف 13 C-الجلوكوز باعتباره الركيزة عالمية. هذا هو أسلوب خالية من الثقافة الواعدة التي تتيح الربط بين phylogenies الميكروبية إلى النشاط الأيضي الخاصة. هذا ممكن من خلال تتبع مستقرة، وصفت ذرات النظائر من ركائز في المؤشرات الحيوية الميكروبية، مثل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي 5. إدماج 13 C النظائر في الحمض النووي يزيد من كثافة الحمض النووي المسمى مقارنة أونلبلد (12 C) واحدة. في النهاية، يتم فصل الحمض النووي 13 C المسمى أو الحمض النووي الريبي التي كتبها الكثافة تنبيذ فائق التدرج من 12 C-أونلبلد مماثلة واحدة 6. التحليل الجزيئي لاحقة من isotopomers الحمض النووي يوفر فصل العلاقة بين النشاط الأيضي وهوية الأنواع.
هنا، فإننا نقدم البروتوكول المستخدم لوصف عملية الأيض نشطة البكتيريا في أمعاء حشرة اختصاصي (نظام نموذجنا)، littoralis ورق القطن (قشريات الجناح، Noctuidae). وقد تم تحليل النشوء والتطور من الحمض النووي باستخدام pyrosequencing، مما سمح عالية الدقة والدقة في تحديد القناة الهضمية للحشرات المجتمع البكتيرية. والركيزة الرئيسية، وكان يستخدم الجلوكوز 13 C المسمى في التجارب. كان يتغذى الركيزة إلى الحشرات باستخدام نظام غذائي الاصطناعي.
Introduction
ومن المعروف الجمعيات التكافلية الحشرات للبكتيريا لعدد كبير من أنواع الحشرات 7. في هذه الجمعيات التكافلية، والكائنات الدقيقة تلعب دورا هاما في نمو وتطور الحشرات. وقد ثبت أن الميكروبات إلى المساهمة في التكاثر الحشرات 1، 3 فرمون الحيوي، والتغذية، بما في ذلك تركيب الأحماض الأمينية الأساسية 4، وهضم الطعام قابلة للوصول إلى المضيف. على الرغم من مجموعة واسعة من الجمعيات العاملة في الأمعاء البكتيرية، كما هو معروف أقل بكثير عن دور وظيفي أنها تلعب لصالح الحشرات. فقط في حالة النمل الأبيض، والهضم التكافلية من مادة الخشب التي يقوم بها بدائيات النوى، البروتوزوا والفطريات، وقد درس على نطاق واسع 8،9. وعلى النقيض من ذلك، لا يعرف إلا القليل عن علاقة تكافلية موجودة في القناة الهضمية للحشرات اختصاصي دودة ورق القطن أي، ورق القطن littoralis. وعلاوة على ذلك، وذلك بسبب التحول المتكرر الجنود النبات، عامويتعرض الخاصة العراقية الحشرات والأمعاء البكتيرية المجتمعات المرتبطة بها بشكل دائم إلى التحديات الجديدة المرتبطة عادات التغذية الخاصة بهم طويلا النباتات مع مجموعة كبيرة من المواد الكيميائية النباتية. بجانب هذا، والبيئة في القناة الهضمية lepidopterans، يمثل في حد ذاته بيئة قاسية لنمو البكتيريا بسبب ارتفاع درجة الحموضة القناة الهضمية 10. لا سيما في حالة S. littoralis، وهي تتراوح بين 10.5 في المعى الأمامي، كاليفورنيا. 9 في المعي المتوسط لدرجة الحموضة ما يقرب من 7 في المعى المؤخر 11. من ناحية أخرى، ويرتبط مع المجتمع البكتيرية أمعاء S. littoralis بسيط. تانغ، Freitak، وآخرون. ذكرت 12 كحد أقصى 36 phylotypes ينتمون إلى ما مجموعه 7 الأنواع البكتيرية المختلفة وأعضاء فقط من المجتمع البكتيرية المصاحبة لهذه الحشرات. وبالاضافة الى هذا، لا يلزم إجراء تربية معقدة لنمو الحشرات في المختبر. وعلاوة على ذلك، وهذا ودورة حياة قصيرة من الحشرات تسهيل متعدد زدراسات enerational، وتحول هذه الأنواع إلى نظام نموذج مثالي لدراسة التفاعلات القناة الهضمية للميكروب.
مع ظهور تقنيات التسلسل PCR القائم، ازداد عدد من الدراسات التي تتناول القناة الهضمية الكائنات الحية من عدة كائنات (أي البشر والحشرات، أو الكائنات البحرية). وعلاوة على ذلك، فإن النتائج تكون مستقلة من العزلة وزراعة الأمعاء آوى البكتيريا كما هو الحال في الماضي. تقريبا 99٪ من البكتيريا ليست صالحة للزراعة ومحاكاة للظروف البيئية السائدة في القناة الهضمية من الصعب 12. باستخدام PCR، 16S الرنا الريباسي شظايا الجينات (المورثات علامة النشوء والتطور المستخدمة على نطاق واسع بين البكتيريا) يمكن التوسع بشكل انتقائي من قالب الحمض النووي مختلطة من المجتمعات البكتيرية امعاء، والتسلسل، والمستنسخة. مع هذه المعلومات، يكون المستخدم قادرا على تحديد الأنواع البكتيرية بعد استرجاع المعلومات من قواعد البيانات العامة تسلسل 13،14. ومع ذلك، تقترب من التسلسل لوصف البكتيريةلا تزال المجتمعات غير كافية نظرا لعدم وجود معلومات عن مساهمة الأيض لا يتجزأ من الأنواع الفردية داخل المجتمع.
مستقر النظائر التحقيق (SIP) هو تقنية خالية من ثقافة واعدة. وغالبا ما تستخدم في علم الأحياء الدقيقة البيئية لتحليل phylogenies الجراثيم مرتبطة سيما أنشطة الأيضية. ويتحقق هذا من خلال تتبع مستقرة، وصفت ذرات النظائر من ركائز في المؤشرات الحيوية الميكروبية، مثل الأحماض الدهنية المشتقة من الدهون الفوسفاتية، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي 5. عند النظر في الأحماض النووية، ويستند على منهجية فصل 13 الحمض النووي المسمى C أو الحمض النووي الريبي من الحمض النووي غير المسماة التي كتبها الكثافة تنبيذ فائق التدرج 6. ونتيجة لهذا الاتصال المباشر بين تسمية الحمض النووي والنشاط الأيضي، تحليل الجزيئي المصب من الأحماض النووية يحدد الأنواع ويقدم معلومات عن أنشطة الأيضية. علاوة على ذلك، مزيج من الحمض النووي SIP وpyrosequencing الذي يطبقهPilloni، فون نيتسر، 15 آخرون، يسمح بتحديد بسيطة وحساسة خاصة من الأنواع البكتيرية الموجودة في الثقيلة 13-C المسمى DNA الكسر. حتى الآن، وقد تم تطبيق هذه التقنية لوصف المجتمعات البكتيرية المشاركة في العمليات البيولوجية الكيميائية في التربة تحت الهوائية واللاهوائية 16،17 18،19 الظروف. إلى جانب استخدام في العلوم البيئية، وقد تم تطبيق هذه التقنية في العلوم الطبية كما ذكرت من قبل Reichardt، وآخرون. 5، الذي وصف الأنشطة الأيضية لمجموعات مختلفة من النشوء والتطور مجهريات البقعة المعوية الإنسان ردا على الكربوهيدرات غير قابلة للهضم.
هنا نستخدم 13 C-الجلوكوز إلى 'التسمية' الحمض النووي من الأنواع البكتيرية عملية الأيض نشطة في القناة الهضمية. الجلوكوز هو سكر استخدامها من قبل معظم الأنواع البكتيرية على طول نطاق واسع Entner-Doudoroff (ED) المسار، على الرغم من استثناءات معروفة 20. هذايبرر استخدام 13 C-الجلوكوز باعتباره التحقيق الأيض موثوقة التي توفر وصلة بين نواتج الأيض من الاهتمام ومصدر الكربون على طول مسارات ثابتة. اعتمادا على مسألة علمية، ركائز أخرى، أي 13 C-الميثان، 13 CO 2، أو النباتات التي أثيرت في إطار جو 13 CO 2، ويمكن استخدامها للتصدي للأنشطة الأيضية.
عند هذه النقطة، فإننا نقدم البروتوكول المطبق في توصيف التمثيل الغذائي للمجتمع الأمعاء البكتيرية من حشرة اختصاصي، وهما س. littoralis (قشريات الجناح، Noctuidae). علاوة على ذلك، كان إلى جانب هذه التقنية لpyrosequencing، والذي يسمح بدوره بتحديد الحشرات الأمعاء البكتيرية المجتمع مع ارتفاع القرار والدقة. والركيزة الرئيسية، واستخدمت 13 الجلوكوز C المسمى خلال التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تربية الحشرات
- شراء أو الحصول على البيض براثن ورق القطن littoralis من تربية الخاصة بك. المحافظة عليها في أطباق بتري معقمة في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الفقس.
- إعداد نظام غذائي اصطناعية لتربية الحشرات على النحو التالي:
- نقع الفاصوليا البيضاء 500 غ الأرض بين عشية وضحاها في 100 مل من الماء.
- إضافة 9.0 ز حمض الاسكوربيك و75 غ أجار إلى 1،000 مل المقطر H 2 O وبعد ذلك أنها تغلي.
- اسمحوا الخليط ليبرد وعندما يتصلب (لخليط صلبة بيضاء شمعية) تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- نقل اليرقات حديثة الفقس إلى علبة بلاستيكية نظيفة والخلفية منها في النظام الغذائي الاصطناعي في 23-25 درجة مئوية تحت نظام يوم طويل مع 16 ساعة من الإضاءة و8 ساعة من الظلام. تغيير الطعام كل يوم حتى اليرقات تذهب من خلال جميع الأعمار اليرقية ستة.
2 13 C-وضع العلامات من الحمض النووي في بكتيريا الأمعاء عملية الأيض نشطة
- حل 186.1 ملغ من كامل 13 C المسمى الجلوكوز مع المقطر منزوع الأيونات والماء ([ده 2 O) وتخلط جيدا مع 100 غرام من النظام الغذائي الاصطناعي للتجربة SIP. ضمان تركيز 13 C-الجلوكوز النهائي من 10 ملم في النظام الغذائي الاصطناعي. هذا يحاكي في تركيز الجلوكوز في الموقع أمعاء S. littoralis تغذية اليرقات على نباتات القطن وفقا لشاو وآخرون (المقدمة).
- نقل 9-15 صحية يرقات العمر الثاني من مربع لتربية أطباق بتري بلاستيكية معقمة (يرقة واحدة لكل طبق بيتري) التي تحتوي على الطازجة 13 C-الجلوكوز ارتفعت النظام الغذائي الاصطناعي. استخدام النظام الغذائي الاصطناعي التي تحتوي على نفس كمية الجلوكوز الأم (12 C-الجلوكوز)، كما وصفها، لتغذية مجموعة التحكم.
- تجديد النظام الغذائي الاصطناعي في كثير من الأحيان خلال فترة الحضانة (1 اليوم). استخدام ظروف تربية كما في الخطوة 1.3.
- جمع اليرقات تسعة من كل علاج للتجهيز في وقت لاحق (استخراج الحمض النووي). كلتكرار مكونة من ثلاثة أفراد، وجعل لا يقل عن ثلاثة مكررات لكل معاملة.
3. تشريح الحشرات
- تنظيف وتعقيم أدوات تشريح في بداية العمل مع الايثانول 70٪ (أدوات = مقص Vannas، ملقط ومشرط مع شفرات يمكن التخلص منها غرامة).
- تأخذ الحشرات مع ملقط لينة وغسل الجلد بشكل سطحي مع الماء المقطر. وضعها على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل لتخدير لهم.
- في حين لا يزال تخدير مكان لهم في 0 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لقتلهم. تطهير الحشرات الميتة بشكل سطحي عن طريق غمر لهم في الايثانول (70٪) لبضع دقائق.
- إجراء تشريح الحشرات في وحدة تخزين ما يقرب من 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X المودعة على طبق بتري معقمة (1XPBS = 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 4.3 ملي نا 2 هبو 4، 1.47 ملي KH 2 PO 4، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 ، الأوتوكلاف). تأكد من وجود جسم الحشرة كلها مغمورة تماما في solutأيون خلال الفترة تشريح كامل.
- بدء تشريح عن طريق شق في الجلد على طول الجانبين الأيمن والأيسر من الحشرات، وتبدأ في الرأس وتنتهي في فتحة الشرج. إزالة الجلد كله، الأنابيب مالبيغي، والدهون في الجسم. تغيير عازلة جديدة قبل قطع مفتوحة الأمعاء. القسم الأمعاء في الصدارة، منتصف، والمعى المؤخر عند الاقتضاء. تخزين الأنسجة في الثلاجة (-80 إلى -20 درجة مئوية) حتى استخراج الحمض النووي
4. استخراج الحمض النووي والتضخيم
- وضع الأنسجة الحشرات في 1.5 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي وتجفيف جميع العينات عند 45 درجة مئوية في جهاز فراغ المكثف. سحق الأنسجة المجففة مع مدقة بلاستيكية معقمة.
- استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام عدة مناسبة لاستخراج الحمض النووي التربة. نقل الأنسجة الجافة إلى أنبوب تفاعل عدة واتبع التعليمات كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
- تحديد تركيز الحمض النووي مزال النهائي باستخدام مقياس الطيف.
- Verifيا استخراج ناجحة من الحمض النووي metagenomic الجراثيم من الأمعاء الحشرات عن طريق إعداد مقايسة التشخيص باستخدام PCR Eubacterial الاشعال العامة 27F (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) و1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). تعيين رد فعل PCR على النحو التالي:
- تعيين 50 ميكرولتر خليط التفاعل التي تحتوي على 1X العازلة، 1.5 ملي MgCl 2، 10 ملي أربعة triphosphates deoxynucleoside (dNTPs)، و 2.5 U طق البلمرة DNA، و 0.5 ملي من كل التمهيدي و 60 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج كقالب.
- تشغيل تفاعلات PCR باستخدام thermocycler على النحو التالي: تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 35 دورات: 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، والصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والإرشاد في 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة . استخدام خطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- التحقق من التضخيم PCR ناجحة في الاغاروز 1٪ الكهربائي بروميد إيثيديوم (EB) هلام ملون (حل 1 غرام من الاغاروز في 100 مل من 1X TAE العازلة وصمة عار مع 1μl EB). إيداع 5 ميكرولتر من اله PCR المنتج + 1μl صبغة تحميل 6X في جيوب هلام. (1X TAE = 40 ملي تريس، قاعدة، 20 ملم حمض الخليك الجليدي، 1 ملم EDTA، وضبط درجة الحموضة إلى 8).
- تشغيل هلام باستخدام العازلة 1xTAE في 300 V، 115 مللي أمبير لكاليفورنيا. 20 دقيقة في غرفة الكهربائي. باستخدام غرفة الوثائق هلام (transilluminator الأشعة فوق البنفسجية متصلة الكاميرا الرقمية والكمبيوتر) مراقبة هلام والمقارنة بين حجم المنتج النهائي الخاص بك مع علامة الجين تحميلها أيضا، ويجب أن يكون حجم الصحيح من amplicons ما يقرب من 1.5 كيلو بايت.
- تخزين المنتجات PCR في ظل ظروف التجميد العميق، تفضيلي -80 درجة مئوية، حتى الاستخدام.
5. فصل الحمض النووي CSCL التدرج تنبيذ فائق
- إعداد الكواشف لتدرجات لتنبيذ فائق على النحو التالي:
- إعداد كلوريد السيزيوم M (CSCL) حل عن طريق إذابة 7.163 تدريجيا 603.0 غرام من CSCL في DDH 2 O وملء تصل إلى الحجم النهائي من 500 مل.
- بدقة ديتيرمينى كثافة من الحل CSCL استعداد من قبل وزنها 1.0 مل قسامة على التوازن من ثلاثة أرقام عن طريق ثلاث نسخ. هذا وتتراوح عادة من 1.88 و 1.89 جم / مل في RT.
- إعداد المخزن المؤقت التدرج (100 ملي تريس، 100 ملي بوكل و1 ملم EDTA) عن طريق الجمع بين 50 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 1 مل من EDTA M 0.5 (درجة الحموضة 8) و 3.75 غرام من بوكل في النهائي حجم 500 مل باستخدام DDH 2 O. تصفية (0.22 ميكرون) وتعقيم الأوتوكلاف هذا الحل.
- فصل الحمض النووي
- بعد تحديد تركيز الحمض النووي الفردية للتعامل الحشرات، كما هو الحال في قياس 4.3 نقطة، تجمع تلك الحشرات المقابلة لتكرار معا وتطبيع تركيز الحمض النووي للتأكد من أن كل واحد، يساهم بشكل متساو على العينة المجمعة. تركيز النهائي من 500-5،000 نانوغرام من الحمض النووي (قياس تركيز النهائي مرة أخرى) هو مناسبة لعملية تنبيذ فائق 21.
- لإعداد متوسطة الانحدار، والجمع بين الحمض النووي كميا، والتدرج وجود مخزن مؤقتد 4.8 مل من 7.163 M CSCL حل معا إلى وحدة تخزين مختلطة من 6.0 مل في 15 مل العقيمة المسمار غطاء أنبوب (جيل من التدرج خليط الحمض النووي المتوسطة).
- وضع بعناية على استعداد التدرج خليط الحمض النووي المتوسطة إلى 5.1 مل أنبوب نابذة فائقة السرعة (ملء حتى قاعدة العنق أنبوب) باستخدام حقنة وإبرة. تجنب ضخ أو تشكيل أي فقاعات الهواء. تشمل واحدة على الأقل التدرج فارغة (باستخدام ده 2 O بدلا من DNA) في كل تشغيل أجهزة الطرد المركزي باعتباره المرجعية التدرج.
- شغل أزواج أنبوب التوازن لفي غضون 10 ملغ من الوزن المتوسط بعد كل التدرج المطلوب في أنبوب نابذة فائقة السرعة منها. ختم الأنبوب مع "توبر تيوب" والتأكد من أن الختم هو تسرب خالية كتبها قلب الأنبوب والضغط المعتدل باليد.
- استخدام الدوار العمودي قرب مع ثمانية آبار لعقد أنابيب 5.1 مل تنبيذ فائق لتنبيذ فائق. ختم بعناية الآبار الدوار وتحميل الدوار في نابذة فائقة السرعة وفقا لأماهتعليمات nufacturer و. تهيئة الظروف تنبيذ فائق: تدور في 50،000 دورة في الدقيقة (حوالي 177،000 x ج)، ودرجة الحرارة عند 20 درجة مئوية، وتنبيذ فائق تشغيل لمدة 40 ساعة مرة مع فراغ. حدد أقصى تسارع وتباطؤ دون فرامل.
- بعد الانتهاء، وإزالة بعناية الأنابيب من الدوار الطرد المركزي باستخدام ملقط. وضعها في رف من دون إزعاج التدرجات شكلت داخل الأنابيب. معالجة عينات تجزئة التدرج في أقرب وقت ممكن للحد من أي نشرها.
- استرجاع الحمض النووي من التدرجات الإيزوبيكنيكي مفصولة تجزئة
- استخدام نظام مضخة HPLC دقيقة لتنفيذ تجزئة التدرج، الذي يفصل على قدم المساواة التدرجات تشكلت من أنبوب نابذة فائقة السرعة الأعلى طريقة الإزاحة. توصيل مضخة HPLC (100٪ تدفق التدرج) إلى زجاجة مملوءة 1 L التشريد ده 2 O ونعلق بإحكام إلى المضخة أنابيب مفتوحة مع 23 G 1 في حقنة الإبرة. إضافة كافية بromophenol صبغة زرقاء إلى [ده 2 O لإعطائها اللون الأزرق الداكن. هذا يسهل تصور واجهة بين المتوسطة الانحدار وتشريد ده 2 O.
- تعيين مضخة لمعدل تدفق 850 ميكرولتر / دقيقة وتتوازن النظام حتى قطرة واحدة من ده زرقاء اللون 2 O يخرج من إبرة حقنة.
- بعناية إصلاح أنبوب نابذة فائقة السرعة الى وقفة المشبك ويخترق الجزء السفلي من أنبوب مع حقنة 23 G 1 في إبرة طويلة. توصيل مضخة إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة عن طريق إدخال إبرة تعلق على أنابيب المضخة في الجزء العلوي من الأنبوب، وجمع قطرات من أسفل مباشرة في أنابيب معقمة microcentrifuge 1.5 مل. جمع جزء كل 30 ثانية، وتصل إلى ما يقرب من 425 ميكرولتر لكل جزء وما مجموعه 12 كسور في التدرج. نلاحظ أن نسبة مشاركة (جزء 12) عادة ما تحتوي على تشريد ده 2 O، وينبغي التخلص منها.
- بعد تجزئة، ليعسر كثافة كل فصل الكسور باستخدام الميزان التحليلي على النحو المذكور في الخطوة 5.1.2.
- ترسيب الحمض النووي من كل جزء (حوالي 425 ميكرولتر) وذلك بإضافة أول 1 ميكرولتر الجليكوجين (20 ميكروغرام / ميكرولتر في DDH 2 O، تعقيمها) باعتبارها الناقل للترسب كمية قليلة من الحمض النووي. يخلط جيدا بواسطة انقلاب.
- إضافة مجلدين (850 ميكرولتر) من البولي ايثلين جليكول (PEG) الحل (حل 150 غ من البولي ايثلين غليكول 6000 و 46.8 غرام من كلوريد الصوديوم في DDH 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 500 مل. تصفية، وتعقيم الأوتوكلاف. الحل PEG 30 ٪ PEG 6000 و 1.6 M كلوريد الصوديوم)، ومزيج مرة أخرى عن طريق قلب عشر مرات.
- ترك الأنابيب في RT لمدة ساعة على الأقل (إذا لزم الأمر، بين عشية وضحاها) لترسيب الحمض النووي.
- الطرد المركزي في رواسب 13،000 x ج لمدة 30 دقيقة في RT. ينبغي أن تشكل بيليه مرئية.
- إزالة بعناية طاف مع ماصة وغسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪. أجهزة الطرد المركزي تحت نفسالظروف لمدة 10 دقيقة مرة أخرى.
- تجاهل بعناية طاف والهواء الجاف بيليه في RT لمدة 15 دقيقة.
- تنحل بيليه الحمض النووي المجففة في 30 ميكرولتر من DDH 2 O وتخلط جيدا من خلال استغلال بلطف الأنبوب. قياس الحمض النووي في كل جزء التدرج كما في الخطوة 4.3 مخزن العينات تحت -20 أو -80 ° C إذا كان مطلوبا تخزين على المدى الطويل.
6. الحمض النووي توصيف بواسطة Pyrosequencing
- تأكد من أن الحمض النووي الأصلي غير المسماة (C 12) تحتل كثافة تتراوح من 1.705 جم / مل إلى 1.720 جم / مل، بينما 13 C الحمض النووي المسمى ديها كثافة حوالي 1،720-1،735 ز / مل. لاحظ أن كلا من الأم و 13 الحمض النووي المسمى C المستخرجة من العينات البيئية يمكن أن تمتد لعدة كسور التدرج. نتوقع أن الحمض النووي ضوء لتترافق مع كسور 9-11 والحمض النووي الثقيلة لتترافق مع كسور 4-6.
- الجمع بين الكسور الرئيسية لإنشاء واحد "تجميع" جزء ميلان ممثلحبال لتخصيص ذروة محددة من الحمض النووي حل الكثافة. بدلا من ذلك، يمكن وسائل أخرى لفحص الكسور مفصولة باستخدام النظائر الطيف نسبة الكتلة (IRMS) 22 أو طريقة أخذ البصمات، مثل تغيير طبيعة التدرج الكهربائي للهلام (DGGE) 23، وتساعد على اختيار الكسور المناسبة قبل التسلسل.
- أداء pyrosequencing من PCR تضخيم الجينات 16S الرنا الريباسي البكتيرية من الكسور الثقيلة والمتوسطة والخفيفة جمعت كل التدرج الفردية. باستخدام هذا الأسلوب، وتحديد النسب والوفرة النسبية للأنواع البكتيريا عملية الأيض نشطة في SIP عينات المحتضنة ممكن. أداء pyrosequencing على النحو التالي:
- أداء AMPLICON pyrosequencing باستخدام روش 454 FLX الصك مع الكواشف التيتانيوم.
- إعداد amplicons barcoded لمضاعفة باستخدام مجموعة Gray28F التمهيدي الانصهار (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) وGray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24،25 تمديد مع اله منها التمهيدي محول A / B ومعرفات متعددة عينة محددة (MID).
- تطبيق PCR خطوة واحدة مع 30 دورات، وذلك باستخدام البلمرة حار البدء طق، لتوليد المكتبة التسلسل.
- تسلسل amplicons استنادا إلى بروتوكول المورد، وتمديد يقرأ من الاتجاه إلى الأمام (Gray28F) كما هو موضح في http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyrosequencing تحليل البيانات
- تحليل التسلسل يقرأ الخام الناتجة عن pyrosequencing 454 مع "رؤى الكمي في البيئة الميكروبية"، خط أنابيب البرمجيات QIIME 26. إجراء معالجة على النحو التالي:
- في البداية، لتحويل الملف SFF إنشاؤها 454 آلة لFASTA، QUAL والملفات Flowgram مع البرنامج النصي process_sff.py.
- التحقق من صحة ملف تعيين (على أساس check_id_map.py) وتعيين المضاعفة ليقرأ سام البيولوجيةبليس مع البرنامج النصي split_libraries.py. تقليم منخفضة الجودة تنتهي مع انزلاق حجم الإطار من 50 ومتوسط الجودة المعلمة قطع من 25، والقضاء أيضا تسلسل غامضة قصيرة (طول <200 بي بي) من ورقة العمل.
- دينويسي البيانات باستخدام denoise_wrapper.py 454.
- المقبل، الكتلة عالية الجودة يقرأ في وحدات تصنيفية التشغيلية (OTUs) باستخدام اتو متعددة طريقة اختيار (pick_otus.py مع 97٪ تشابه تسلسل خفض العرضية).
- اختيار تسلسل ممثل عن كل اتو باستخدام pick_rep_set.py.
- تعيين التصنيف إلى مجموعة تسلسل ممثل استنادا assign_taxonomy.py. استخدام مشروع قاعدة بيانات الريباسي (RDP) المصنف مع الحد الأدنى من الثقة لتسجيل الاحالة لتعيين 0.80.
- محاذاة تسلسل ممثل مجموعة ضد prealigned Greengenes الأساسية 16S تسلسل باستخدام خوارزمية PyNast (align_seqs.pyمع الحد الأدنى من تسلسل مجموعة في المئة الهوية إلى 75).
- بالإضافة إلى ذلك، تستنزف من الوهم مزيد من التحليل عن طريق تشغيل identify_chimeric_seqs.py.
- إزالة جميع المناصب الفجوة (ليست مفيدة للاستدلال النشوء والتطور) مع قالب lanemask (filter_alignment.py) قبل بناء شجرة النشوء والتطور (make_phylogeny.py).
- أخيرا، وتوليد الجداول اتو مع make_otu_table.py، واصفا حدوث phylotypes البكتيرية داخل كل عينة. استخدام الجدول اتو لبناء heatmap لمقارنة وفرة البكتيرية والنشاط.
- إذا لزم الأمر، حساب ألفا وبيتا التنوع داخل وبين عينات، على التوالي. بنفس الطريقة، والمنحنيات خلخلة (الرسوم البيانية للتنوع مقابل العمق التسلسل) وتحليل الاحداثيات الرئيسية (PCoA) المؤامرات التي تمثل العلاقات بين المجتمعات الميكروبية يمكن أن تكون مستعدة أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحقيق وضع العلامات كافية من البكتيريا عملية الأيض نشطة موجودة في القناة الهضمية للحشرات، يجب أن تتعرض الحشرة الى 13-C الغنية الركيزة لفترة الأمثل سابقا كافية للسماح للانفصال وصفت جزء أثقل بسهولة من أخف وزنا غير المسماة واحد. في حالتنا، واستكملت 13 C-الجلوكوز في النظام الغذائي الاصطناعي في تركيز النهائي من 10 ملم لمدة 1 يوم (الشكل 1A). تم توفير نفس كمية الجلوكوز العادي (الشكل 1B) في النظام الغذائي الاصطناعي من الحشرات السيطرة. كما ذكر من قبل، والفصل بين الكسور الحمض النووي (أثقل من أخف وزنا) هو أساس العملية برمتها. لذا، فإن الخطوة الأولى التي يتعين القيام بها هي استخراج الحمض النووي من الأنسجة من الاهتمام، وفي هذه الحالة، ويرتبط المجتمع البكتيرية مع القناة الهضمية للحشرات. لتأكيد جودتها من المهم لتشغيل هلام الكهربائي لتحديد ما إذا تم الحصول على أي الحمض النووي على الإطلاق من analyالأنسجة زيد. في الشكل 1C، فمن ملاحظتها فرقة قوية من الحمض النووي الجيني في الجزء العلوي من الصورة مؤكدا استخراج الحمض النووي إيجابية. بالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري إجراء PCR التشخيص، وذلك باستخدام الاشعال عالمية البكتيرية، لتحديد وجود الحمض النووي البكتيري (1D الشكل). هذه النتيجة الإيجابية من المهم أن تقرر ما إذا مزيد من الاستمرار في فصل الحمض النووي المستخرج metagenomic.
بعد تنبيذ فائق، بمجرد تأكيد كمية من الحمض النووي في كل جزء فصل، ويتم قياس الكثافة ومتوسط الكثافة رسم الكسر في غرام / مل على عدد ضئيل لتأكيد تشكيل التدرج السليم في أنابيب، والذي يغطي عادة كثافة تتراوح من 1.690 إلى 1.760 جم / مل جرام / مل (للجزء 12 أو 11) (لجزء 1). يتم تنفيذ pyrosequencing الكمي مباشرة على التدرجات SIP ممثل للكشف عن نسب الأنواع والوفرة النسبية (الشكل 2 C-13 عينة الجلوكوز المعدلة والسيطرة غير المسماة، والذي خدم لمدة التنميط السكان الفعلية في المجتمع. بعد التسلسل، ما مجموعه 120045 جودة عالية يقرأ مع تم إنشاؤها بمتوسط طول 404 النيوكليوتيدات. وأظهرت البيانات الشخصية pyrosequencing وفرة متزايدة من أنواع معينة بما في ذلك معوي وPantoea في العينة وصفت (13 الحمض النووي المسمى C، الشكل 3) مقارنة مع تلك في السيطرة على المجموعة (12 C مراقبة الحمض النووي، والشكل 3). لذا تعتبر هذه البكتيريا لتكون عملية الأيض نشطة، وتستحق مزيدا من الدراسة.
التجربة الشكل 1. تغذية 13 C-الجلوكوز، واستخراج الحمض النووي PCR التضخيم من البكتيريا 16S الرنا الريباسي جنرال ه. (A) 13 C-الجلوكوز تعديل النظام الغذائي الاصطناعي التي يستهلكها ورق القطن littoralis اليرقات. (B) الجلوكوز الأصلية (12 C-الجلوكوز) تعديل النظام الغذائي الاصطناعي التي يستهلكها اليرقات من نفس دفعة من الحشرات المستخدمة في (أ)، والتي هي بمثابة السيطرة (C) نموذجي استخراج الحمض النووي من الأنسجة metagenomic أمعاء اليرقات في مجموعة العلاج 13-C الجلوكوز وفي السيطرة على المجموعة 12 C-الجلوكوز. وشملت ثلاثة مكررات البيولوجية (حارة 1 و 2 و 3) في كل مجموعة. M لتقف على 1 كيلو بايت الحمض النووي علامة. (D) PCR التضخيم مع مجموعة التمهيدي البكتيرية عالمية يولد الصحيح منتجات الجينات 16S الرنا الريباسي 1.5 كيلو بايت باستخدام الحمض النووي المستخرج metagenomic كقالب. حارات 1 هو السيطرة الإيجابية PCR. لين 2 و 3 تمثل C-الجلوكوز عينة تعامل 13 والسيطرة C-الجلوكوز 12، على التوالي. jpg و"الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. الخطوط العريضة للتجربة بايرو-SIP التي تنطوي على كثافة CSCL تنبيذ فائق التدرج وتوصيف جزء مع pyrosequencing من الحمض النووي فصل. = H أعلى وفرة، L = فرة أقل. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. التنوع البكتيري والوفرة النسبية في الكسور الثقيلة من الجلوكوز تغذية اليرقات الأم (12 الحمض النووي السيطرة C) و 13 C-الجلوكوز تغذية اليرقات (DNA 13 C المسمى)./ www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القناة الهضمية لمعظم الحشرات تؤوي المجتمع الميكروبية غنية ومعقدة، عادة 10 -10 7 9 خلايا أولية النواة تقديم هناك، يفوق عدد خلايا المضيف نفسه في معظم الحالات. وبالتالي، فإن القناة الهضمية للحشرات هو "نقطة ساخنة" للأنشطة الميكروبية متنوعة، تمثل جوانب متعددة من العلاقات الميكروبية، من التسبب إلزام تبادل المنافع والمصالح 27. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد وصفت مجموعة متنوعة مذهلة من المجتمعات الميكروبية الأمعاء الحشرات، وتوصيف النشاط الأيضي من الأمعاء مجهريات البقعة أمر نادر الحدوث. النظائر التحقيق النهج مستقرة تقدم الآن إمكانية للتمييز بين أعضاء نشطين من خلفية مجهريات البقعة المعقدة مستقلة زراعة وحتى في الجسم الحي. طبقنا هذه الأداة القيمة لدراسة مجهريات البقعة الأمعاء في نظام نموذجي للحشرات، والقطن دودة ورق (ورق القطن littoralis). منذ الجلوكوز هو السكر المهيمنة في أمعاء دودة ورق القطن، في هذه التظاهرة التي قمنا تغذية لارالدرهم مع النظام الغذائي الاصطناعي ارتفعت مع جرعة إضافية ولكن الفسيولوجية لل13 C-الجلوكوز لتعقب البكتيريا عملية الأيض نشطة في النباتات الأمعاء. أتاحت الحضانة متطابقة أنشئت مع الجلوكوز الأم عنصر تحكم حرجة للمقارنة اللاحقة لضمان أن أي وضع العلامات وضوحا من الحمض النووي ليست قطعة أثرية من الأسلوب نفسه، مثل المحتوى C G+ عالية في الحمض النووي المساهمة في الانفصال. قرب الموضع تركيز الجلوكوز في خفض بالإضافة إلى التحيز التجريبية. اعتبارات أخرى تتعلق الإعداد التجريبية الصارمة للدراسة الحمض النووي SIP وقد نوقشت في أماكن أخرى 28،29. لبكتيريا الأمعاء عادة ما تكون عملية الأيض نشطة للغاية ولها جيل وقت قصير بالمقارنة مع الكائنات الحية الدقيقة من معظم البيئات الأرضية والمائية. بالتالي 24 ساعة تغذية مستمر تسبب بالفعل وضع العلامات الهامة. لاحظ أن كمية كبيرة من الحمض النووي الجيني المضيف وcoextracted أيضا من أنسجة الأمعاء، والتي ينبغي الأخذ بعينالاعتبار عند مناقشة النتائج.
يعتمد توصيف نموذجي الانحدار جزء على أساليب أخذ البصمات منخفضة الدقة، مثل محطة تقييد تعدد الأشكال جزء طول (T-RFLP)، وتستغرق وقتا طويلا بناء مكتبة استنساخ لربط البيانات. فإنه في الآونة الأخيرة إلا أن ظهور الإنتاجية العالية الجيل الثاني تقنية تسلسل يسمح ل، التحليل السريع للمجتمعات الميكروبية معقدة فعالة من حيث التكلفة، ومفصلة. نحن هنا تطبيق هذه التكنولوجيا الجديدة لمسح مباشر على التركيب الجيني للكثافة الكسور التدرج وتحديد البكتيريا عملية الأيض نشطة، مما أعطى تعزيز حساسية مقارنة مع الأساليب القائمة على هلام الكهربائي، وسهلت تصنيف تطور السلالات اللاحقة. من خلال مقارنة الكسور الثقيلة ما يعادلها من كل من C 13 و 12 وصفت عينات السيطرة C-، نجد أن Pantoea والمعوية أصبح المسمى على النظائر التحقيق. بمجرد أن متعبوقد تم تحديد البكتيريا النشطة olically، ويمكن إجراء تحليل أخرى مثل مضان التهجين في الموضع (FISH) باستخدام مسابر محددة وتحليل metagenomic من الحمض النووي المسمى تعافى من أفراد المجتمع نشطة لتوفير نظرة شاملة في المتكافلة الحقيقية المرتبطة المضيف . استنادا إلى النظام القائم هنا، ويمكن أيضا أن يكون الطعام مصادر الكربون الأخرى 13 C المسمى إلى المضيف لتشريح البكتيريا تشارك في القناة الهضمية الأيضية مسار المستهدفة، على سبيل المثال، واصفة السليلوز لتحديد البكتيريا النشطة المشاركة في عملية الهضم المضيف. مع تطور هذه النهج الجديد، فإن دور الحشرات الأمعاء مجهريات البقعة تصبح أكثر وضوحا من عرضه.
بشكل جماعي، وبروتوكول الموصوفة هنا يمثل طريقة واضحة وسريعة، وفعالة لتحديد الأنشطة الأيضية للمجهريات البقعة الأمعاء، الأمر الذي يزيد من يمكن تطبيقها على تقييم دور محدد من البكتيرياالمتكافلة الريال في التغذية المضيف، وإزالة السموم، والدفاع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر انجيليكا بيرغ للمساعدة المختبر. وأيد هذا العمل وبتمويل من جمعية ماكس بلانك ومدرسة جينا لالميكروبية الاتصالات (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
