Summary
La communauté bactérienne active associée à l'intestin de Spodoptera, a été déterminée par des isotopes stables-sondage (SIP) couplé à pyroséquençage. En utilisant cette méthodologie, l'identification des espèces de bactéries métaboliquement actives au sein de la communauté a été fait avec une haute résolution et de précision.
Abstract
Entrailles de la plupart des insectes sont habitées par des communautés complexes de bactéries non pathogènes symbiotiques. Dans ces communautés microbiennes, il est possible d'identifier les espèces de bactéries commensales ou mutualistes. Ces derniers chers, ont été observées pour servir plusieurs fonctions à l'insecte, à savoir aider à une reproduction des insectes, en stimulant la réponse immunitaire 2, la production de phéromone 3, ainsi que la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels 4, entre autres.
En raison de l'importance de ces associations, de nombreux efforts ont été réalisés pour caractériser les communautés vers le bas pour les membres individuels. Cependant, la plupart de ces efforts ont été soit basées sur des méthodes de culture ou invoqué la génération de fragments de gènes ARNr 16S qui ont été séquences pour l'identification finale. Malheureusement, ces approches ne identifié les espèces bactériennes présentes dans l'intestin et n'ont fourni aucune informations sur l'activité métabolique des micro-organismes.
Afin de caractériser l'espèce bactérienne métaboliquement actives dans l'intestin d'un insecte, on a utilisé des isotopes stables de palpage (SIP) in vivo employant 13 C-glucose comme substrat universel. Il s'agit d'une technique de culture libre-prometteuse qui permet la liaison de la phylogénie microbiennes à leur activité métabolique particulier. Cela est possible en suivant, isotopes stables marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que l'ADN et de l'ARN 5. L'incorporation d'isotopes 13 C dans l'ADN augmente la densité de l'ADN marqué par rapport à la non marqué (12 C) une. En fin de compte, l'ADN marqué au 13 C ou de l'ARN est séparé par ultracentrifugation en gradient de densité à partir de la C-12 non marqué similaire une 6. Analyse moléculaire ultérieure des isotopomères d'acides nucléiques séparés assure la liaison entre l'activité métabolique et de l'identité de l'espèce.
Ici, nous présentons le protocole utilisé pour caractériser les bactéries métaboliquement actives dans l'intestin d'un insecte généraliste (notre système de modèle), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L'analyse phylogénétique de l'ADN a été effectuée à l'aide pyroséquençage, ce qui a permis une haute résolution et une précision dans l'identification de la communauté bactérienne de l'intestin des insectes. Comme substrat principal, 13 C-glucose marqué a été utilisé dans les expériences. Le substrat a été introduit dans les insectes en utilisant un régime artificiel.
Introduction
Associations symbiotiques insectes bactériennes sont connus pour un grand nombre d'espèces d'insectes 7. Dans ces associations symbiotiques, les micro-organismes jouent un rôle important dans la croissance et le développement des insectes. Les microbes ont été montrés pour contribuer à une reproduction des insectes, des phéromones biosynthèse 3, de la nutrition, y compris la synthèse des acides aminés essentiels 4, et la digestion de la nourriture inaccessible à l'hôte. En dépit de la grande variété des associations intestinale bactérienne, on sait beaucoup moins sur le rôle fonctionnel qu'ils jouent en faveur de l'insecte. Seulement dans le cas des termites, la digestion symbiotique de la lignocellulose réalisé par les procaryotes, les protozoaires et les champignons, a été largement étudiée 8,9. Contrairement à cela, on sait peu sur l'association symbiotique présente dans l'intestin des insectes généralistes à savoir la noctuelle du coton Spodoptera littoralis. Par ailleurs, en raison de leur changement fréquent des plantes hôtes, généralist insectes et de leurs communautés bactériennes associées de l'intestin sont exposés en permanence à de nouveaux défis liés à leurs habitudes alimentaires consommant des plantes avec une pléthore de composés phytochimiques. A côté de cela, l'environnement de l'intestin dans les lépidoptères, représente en soi un environnement difficile pour la croissance des bactéries en raison de l'intestin pH élevé 10. En particulier dans le cas de S. littoralis, il varie de 10,5 dans l'intestin antérieur, ca. 9 dans l'intestin moyen de pH près de 7 dans l'intestin postérieur 11. D'autre part, la communauté bactérienne associée à l'intestin de S. littoralis est simple. Tang, Freitak, et al 12. Ont rapporté un maximum de 36 phylotypes appartenant à un total de 7 espèces bactériennes différentes que les seuls membres de la communauté bactérienne associée à cet insecte. En outre, aucune procédure d'élevage compliqué est nécessaire pour la croissance des insectes dans le laboratoire. En outre, ce et le cycle de vie court de l'insecte faciliter multi-gétudes enerational, tournant cette espèce dans un système de modèle idéal pour étudier les interactions intestin-microbe.
Avec l'avènement des technologies de séquençage basées sur la PCR, le nombre d'études traitant de l'intestin biote de plusieurs organismes (par exemple les humains, les insectes ou les organismes marins) a augmenté. De plus, les résultats sont indépendants de l'isolement et de culture des bactéries de l'intestin hébergé comme par le passé. Près de 99% des bactéries ne sont pas cultivables et la simulation des conditions environnementales régnant dans l'intestin est difficile 12. En utilisant la PCR, des fragments de gène d'ARNr 16S (un marqueur de gène phylogénétique largement utilisé chez les bactéries) peuvent être amplifiés de manière sélective à partir d'une matrice d'ADN mixte des communautés bactériennes intestinales, séquencées, et clones. Avec cette information, l'utilisateur est capable d'identifier les espèces bactériennes après avoir récupéré les informations de séquence à partir de bases de données publiques 13,14. Néanmoins, le séquençage des approches pour décrire bactériennecommunautés restent insuffisants en raison du manque d'informations sur la contribution métabolique intrinsèque de chacune des espèces au sein de la communauté.
Isotopes stables de sondage (SIP) est une technique de culture libre-prometteur. Il est souvent utilisé en microbiologie environnementale à analyser phylogénies microbiennes liées à certaines activités métaboliques. Ce résultat est obtenu en suivant les isotopes stables, marqué atomes de substrats en biomarqueurs microbiens, tels que des acides gras de phospholipides dérivés, l'ADN et l'ARN 5. Lorsque l'on considère les acides nucléiques, la méthode est basée sur la séparation de l'ADN 13 marqué au carbone ou de l'ARN à partir de l'ADN non marqué par ultracentrifugation en gradient de densité-6. En raison de cette connexion directe entre le marqueur d'ADN et l'activité métabolique, une analyse moléculaire en aval des acides nucléiques identifie les espèces et fournit des informations sur les activités métaboliques. En outre, la combinaison de l'ADN-SIP et pyroséquençage appliquée parPilloni, von Netzer, et al. 15, permet une identification simple et sensible notamment des espèces bactériennes présentes dans la fraction lourde de 13 C-ADN marqué. Jusqu'à présent, cette technique a été appliquée pour décrire les communautés bactériennes impliquées dans les processus biogéochimiques dans le sol sous aérobies et anaérobies 16,17 18,19 conditions. Outre l'utilisation en sciences de l'environnement, la technique a été appliquée dans les sciences médicales tel que rapporté par Reichardt, et al. 5, qui décrit les activités métaboliques des différents groupes phylogénétiques du microbiote intestinal humain en réponse à un glucide non digestible.
Ici, nous utilisons 13 C-glucose de «label» de l'ADN des espèces bactériennes métaboliquement actives dans l'intestin. Le glucose est un sucre utilisé par la plupart des espèces bactériennes le long de la voie généralisée Entner-Doudoroff (ED), bien que des exceptions sont connues 20. Cejustifie l'utilisation de 13 C-glucose comme sonde métabolique fiable qui fournit un lien entre les métabolites d'intérêt et la source de carbone le long des voies établies. En fonction de la question scientifique, d'autres substrats, à savoir 13 C-méthane, le 13 CO 2, ou de plantes obtenues sous une atmosphère de 13 CO 2, peut être utilisé pour traiter des activités métaboliques.
À ce stade, nous présentons le protocole appliqué dans la caractérisation métabolique de la communauté bactérienne de l'intestin d'un insecte généraliste, à savoir S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). En outre, la technique a été couplé à pyroséquençage, qui à son tour permet l'identification de la communauté bactérienne de l'intestin des insectes avec une haute résolution et de précision. Comme le substrat principal, 13 C-glucose marqué a été utilisé au cours des expériences.
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Protocol
Une. Élevage des insectes
- Acheter ou obtenir des œufs griffes de Spodoptera littoralis partir de votre propre élevage. Les maintenir dans des plats de Pétri à température ambiante (TA) jusqu'à l'éclosion.
- Préparer l'alimentation artificielle pour les insectes d'élevage comme suit:
- Faire tremper 500 g de haricots blancs au sol pendant la nuit dans 100 ml d'eau.
- Ajouter 9,0 g d'acide ascorbique et 75 g d'agar à 1 000 ml d'eau distillée H 2 O et ensuite la faire bouillir.
- Laisser le mélange refroidir et il se solidifie quand (à un mélange solide cireux blanc) stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Transférer les larves nouvellement écloses dans une boîte en plastique propre et les élever sur le régime artificiel à 23-25 ° C sous un régime de jours longs avec 16 h d'éclairage et 8 heures d'obscurité. Changer la nourriture tous les jours jusqu'à ce que les larves passent par six stades larvaires.
2. 13 C-marquage de l'ADN dans les bactéries intestinales métaboliquement actives
- Dissoudre 186,1 mg de glucose entièrement 13 C marqué avec de l'eau distillée et déminéralisée (le trou DDH 2 O) et bien mélanger avec 100 g de nourriture artificielle pour l'expérience de SIP. Assurer une concentration finale de 13 C-glucose 10 mM dans l'alimentation artificielle. Cela imite la concentration en glucose in situ dans l'intestin de S. littoralis larves qui se nourrissent sur les plantes de coton selon Shao et al. (soumis).
- Transfert 9-15 deuxième stade larvaire santé de la zone d'élevage des boîtes de Petri en plastique stérile (une larve par boîte de Pétri) contenant frais 13 C-glucose dopés alimentation artificielle. Utilisation régime artificiel contenant la même quantité de glucose native (12 C-glucose), comme décrit, pour l'alimentation du groupe de contrôle.
- Renouveler le régime alimentaire artificiel fréquemment au cours de la période d'incubation (1 jour). Utilisez conditions d'élevage que dans l'étape 1.3.
- Recueillir neuf larves de chaque traitement pour un traitement ultérieur (de l'extraction d'ADN). Chaquereproduire est constitué par trois individus; faire au moins trois répétitions par traitement.
3. Insecte Dissection
- Nettoyer et désinfecter les outils de dissection au début du travail avec de l'éthanol 70% (Outils = ciseaux Vannas, pinces et scalpel avec des lames jetables fines).
- Prenez les insectes avec une pince doux et laver la peau avec de l'eau distillée superficiellement. Placez-les sur de la glace pendant au moins 30 min pour les anesthésier.
- Alors qu'il était encore anesthésié les mettre à 0 ° C pendant 1 heure pour les tuer. Désinfecter les insectes morts superficiellement en les plongeant dans de l'éthanol (70%) pour un couple de minutes.
- Effectuer la dissection de l'insecte dans un volume d'environ 15 ml de PBS 1x déposée sur une boîte de Pétri stérile (NaCl 1XPBS = 137 mM, KCl 2,7, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM de KH 2 PO 4, ajuster le pH à 7,4 , autoclave). Assurez-vous d'avoir tout le corps de l'insecte complètement immergé dans la solution au cours de toute la période de dissection.
- Commencez la dissection en faisant une incision dans la peau le long de la côté gauche de l'insecte droite et commence à la tête et finir sur l'anus. Retirez toute la peau, les tubes de Malpighi, et le corps de graisse. Changer de tampon frais avant de couper ouvert l'intestin. Section de l'intestin en avant, au milieu et à l'intestin postérieur lorsque cela est nécessaire. Stocker le tissu dans le congélateur (-80 à -20 ° C) jusqu'à ce que l'extraction d'ADN
4. Extraction de l'ADN et l'amplification
- Placer le tissu de l'insecte dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml et sécher les échantillons à 45 ° C dans un dispositif de concentrateur sous vide. Écraser le tissu séché avec un pilon en plastique stérile.
- Extraire l'ADN génomique en utilisant un kit adapté pour l'extraction de l'ADN du sol. Transférer le tissu sec pour le tube de réaction de la trousse et suivez les instructions comme indiqué par le fabricant.
- Déterminer la concentration de l'ADN élue finale à l'aide d'un spectrophotomètre.
- VerifYa réussie extraction de l'ADN metagénomique microbienne de l'intestin de l'insecte par la préparation d'un essai de PCR de diagnostic en utilisant des amorces générales eubactéries 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) et 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Régler la réaction PCR comme suit:
- Régler un mélange réactionnel de 50 ul contenant du tampon 1x, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de quatre désoxynucléoside triphosphates (dNTP), 2,5 U de Taq DNA polymerase, 0,5 mM de chaque amorce et 60 ng de l'ADN extrait comme matrice.
- Exécuter les réactions de PCR en utilisant un thermocycleur de la manière suivante: dénaturation initiale à 94 ° C pendant 3 min, suivie de 35 cycles: 94 ° C pendant 45 s, hybridation à 55 ° C pendant 30 secondes, et extension à 72 ° C pendant 1 min . Utiliser une étape d'extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
- Vérifiez l'amplification par PCR avec succès dans un agarose à 1% électrophorèse bromure d'éthidium (EB) de gel coloré (dissoudre 1 g d'agarose dans 100 ml de tampon TAE 1X et tache avec 1 microlitre EB). Dépôt de 5 pi de ee produit PCR + 1 microlitre de 6x colorant de charge dans les poches de gel. (1x TAE = 40 mM de Tris-Base, 20 mM d'acide acétique glacial, EDTA 1 mM, ajuster le pH à 8).
- Exécutez le gel en utilisant un tampon 1xTAE à 300 V, 115 mA pour ca. 20 min dans une chambre d'électrophorèse. En utilisant une chambre de documentation de gel (transilluminateur UV connecté à un appareil photo numérique et ordinateur) observer le gel et comparer la taille de votre produit final avec le marqueur de gène également chargé; la bonne taille des amplicons doit être d'environ 1,5 kb.
- Stocker les produits de PCR dans des conditions de surgélation, de préférence -80 ° C, jusqu'à utilisation.
5. Séparation ADN-CsCl ultracentrifugation en gradient
- Préparer les réactifs pour les gradients pour ultracentrifugation comme suit:
- Préparer un M de chlorure de césium (CsCl) solution 7.163 en dissolvant progressivement 603,0 g de CsCl dans le trou DDH 2 O et remplir jusqu'à un volume final de 500 ml.
- Précision déTermine la densité de la solution préparée en pesant CsCl une aliquote de 1,0 ml sur une balance à trois chiffres en triple exemplaire. Ceci est habituellement comprise entre 1,88 et 1,89 g / ml à température ambiante.
- Préparer le tampon de gradient (Tris 100 mM, KCl 100 mM et EDTA 1 mM) en combinant 50 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8) et de 3,75 g de KCl dans un finale volume de 500 ml en utilisant le trou DDH 2 O. Filtre (0,22 um) et stériliser à l'autoclave cette solution.
- ADN séparation
- Après avoir déterminé la concentration individuelle d'ADN des insectes traités, mesurée au point 4.3, mettent en commun les insectes correspondant à une répétition ensemble et normaliser leur concentration d'ADN pour s'assurer que chacun, contribue également à la population échantillonnée. Une concentration finale de 500-5000 ng d'ADN (mesurer à nouveau la concentration finale) est approprié pour le procédé d'ultracentrifugation 21.
- Pour mettre en place le milieu dégradé, combiner l'ADN quantifié, un tampon gradientd 4,8 ml de solution 7,163 M CsCl ensemble pour un volume mixte de 6,0 ml dans un tube de 15 ml à bouchon à vis stérile (génération d'un mélange moyen de l'ADN dégradé).
- Placez délicatement le mélange moyen de l'ADN dégradé préparé dans un tube de 5,1 ml d'ultracentrifugation (remplir jusqu'à la base du col du tube) en utilisant une seringue et une aiguille. Éviter pompage ou de formation de bulles d'air. Inclure au moins un gradient de vide (en utilisant le trou DDH 2 O à la place de l'ADN) dans chaque cycle de centrifugation selon un gradient de référence.
- tube de la balance des paires à l'intérieur de 10 mg de poids après chaque support gradient requis est rempli dans le tube d'ultracentrifugeuse respectif. Sceller le tube avec un "Topper Tube" et veiller à ce que le joint est sans fuite en inversant le tube et en appliquant une pression modérée à la main.
- Utilisez un rotor vertical près de huit puits pour maintenir 5,1 ml tubes d'ultracentrifugation pour l'ultracentrifugation. Bien sceller les puits de rotor et charger le rotor dans le ultracentrifugation selon la males instructions tion du fabricant. Définir les conditions d'ultracentrifugation: rotation à 50 000 tours par minute (environ 177 000 xg), la température à 20 ° C, et ultracentrifugation durée de 40 heures avec le vide. Sélectionnez une accélération maximale et la décélération sans frein.
- Une fois terminé, retirez avec précaution les tubes du rotor de la centrifugeuse en utilisant une pince. Placez-les dans un rack sans perturber les gradients formés dans les tubes. Traiter les échantillons de fractionnement gradient dès que possible afin de minimiser toute diffusion.
- Récupération de l'ADN de dégradés isopycnique séparées par fractionnement
- Utilisation d'un système de pompe HPLC précis pour réaliser le fractionnement du gradient, qui sépare également les gradients formés par le haut méthode de déplacement du tube d'ultracentrifugeuse. Raccordez la pompe HPLC (gradient de débit de 100%) à la bouteille remplie avec 1 L déplacement ddH 2 O et bien attacher le tuyau de pompe ouvert avec un 23 G 1 aiguille de la seringue. Ajouter suffisamment de bromophenol colorant bleu au trou DDH 2 O pour donner une couleur bleu foncé. Ceci facilite la visualisation de l'interface entre le milieu de gradient et le déplacement du trou DDH 2 O.
- Régler la pompe à un débit de 850 ul / min et l'écoulement du système s'équilibrer jusqu'à ce qu'une goutte de la couleur bleue trou DDH 2 O émerge hors de l'aiguille de la seringue.
- Fixez soigneusement le tube d'ultracentrifugation à un support de fixation et percer le fond du tube avec une seringue 23 G 1 dans la longue aiguille. Raccorder la pompe au tube d'ultracentrifugation en insérant l'aiguille fixée à la tubulure de la pompe dans la partie supérieure du tube, et collecter des gouttes à partir du fond directement dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml stériles. Recueillir une fraction toutes les 30 secondes, un montant d'environ 425 pi par fraction et un total de 12 fractions par gradient. Notez que la dernière fraction (fraction 12) contient habituellement le déplacement trou DDH 2 O et doit être jeté.
- Après fractionnement, measure la densité de toutes les fractions séparées utilisant une balance analytique tel que mentionné à l'étape 5.1.2.
- Précipiter l'ADN de chaque fraction (environ 425 ul) en ajoutant d'abord 1 ul de glycogène (20 ug / ul dans le trou DDH 2 O, passé à l'autoclave) en tant que support pour la précipitation de faible quantité d'ADN. Mélangez bien par inversion.
- Ajouter deux volumes (850 ul) et de polyéthylène glycol (PEG) solution (dissolution de 150 g de polyéthylène glycol 6000 et de 46,8 g de NaCl dans le trou DDH 2 O pour obtenir un volume total de 500 ml. Filtrer, stériliser et autoclave. La solution de PEG est de 30 % de PEG 6000 et 1,6 M de NaCl), et mélanger à nouveau en inversant dix fois.
- Laisser les tubes à température ambiante pendant au moins deux heures (si nécessaire, pendant la nuit) pour précipiter l'ADN.
- Centrifuger les précipités à 13 000 xg pendant 30 min à température ambiante. Une pastille visible devrait former.
- Retirez délicatement le surnageant avec une pipette et laver le culot avec 500 ul de 70% d'éthanol. Centrifuger sous le mêmeconditions de 10 min à nouveau.
- Prenez soin de le surnageant et sécher à l'air le culot à température ambiante pendant 15 min.
- Reprendre le culot d'ADN séché dans 30 pl de ddH 2 O et bien mélanger en tapotant doucement le tube. Quantifier l'ADN dans chaque fraction gradient comme dans l'étape 4.3 Stocker les échantillons sous -20 ou -80 ° C si le stockage à long terme est nécessaire.
6. ADN Caractérisation par Pyroséquençage
- S'assurer que l'ADN natif non marqué (12 C) occupe la plage de densité de 1,705 g / ml à 1,720 g / ml, alors que 13 l'ADN marqué au C a une masse volumique de 1,720 à 1,735 g environ / ml. Noter que les deux indigène et 13 ADN C marqué extrait à partir d'échantillons environnementaux peut s'étendre sur plusieurs fractions de gradient. Attendez-vous à l'ADN de lumière pour être associé avec des fractions 9-11 et l'ADN lourd pour être associé avec des fractions 4-6.
- Combiner les fractions clés pour créer une seule "compilé" fraction ac représentantCording à l'allocation spécifique de pointe de l'ADN de la densité résolu. Alternativement, d'autres moyens d'examiner les fractions séparées en utilisant la spectrométrie isotopique rapport de masse (IRMS) 22 ou une méthode de prise d'empreintes digitales, comme dénaturant gradient électrophorèse sur gel (DGGE) 23, peuvent aider à choisir fractions appropriées avant le séquençage.
- Effectuer pyroséquençage de 16S ARNr bactériens amplifiés par PCR des gènes de fractions lourdes, moyennes et légères compilés de chaque individu gradient. En utilisant cette méthode, l'identification de la lignée et l'abondance relative des espèces de bactéries métaboliquement actives dans le SIP est incubé les échantillons possible. Effectuer pyroséquençage comme suit:
- Effectuer amplicon pyroséquençage l'aide d'un instrument Roche FLX 454 avec des réactifs de titane.
- Préparer amplicons barres pour le multiplexage en utilisant l'amorce de fusion mis Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) et Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 prolongé avec ee amorce respective, adaptateur A / B et identifiants multiplex spécifiques à l'échantillon (MID).
- Appliquer une PCR en une étape avec 30 cycles, en utilisant une polymerase Hot Start Taq, pour générer la bibliothèque de séquençage.
- Séquencer les amplicons sur la base du protocole de fournisseur, et s'étendent le lit de la direction avant (Gray28F) tel que décrit dans http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyroséquençage analyse de données
- Analyser la séquence premières lectures généré par le pyroséquençage 454 avec les «idées quantitatives en écologie microbienne", pipeline logiciel de QIIME 26. Effectuer le traitement comme suit:
- Initialement, convertir le fichier SFF 454-machine générée à FASTA, QUAL et fichiers Flowgram avec le script process_sff.py.
- Valider le fichier de mappage (basé sur check_id_map.py) et attribuer multiplexé lit à sam biologiqueples avec le script split_libraries.py. Découpez le faible qualité se termine avec une taille de fenêtre glissante de 50 et un paramètre moyen de coupure de qualité de 25, éliminent également de courtes séquences ambiguës (la longueur <200 pb) de l'ensemble de données.
- Débruiter les données en utilisant le 454 denoise_wrapper.py.
- Ensuite, la grappe de haute qualité lit en unités taxonomiques opérationnelles (UTO) en utilisant la méthode du multiple OTU la cueillette (de pick_otus.py avec 97% de similarité de séquence seuils).
- Choisissez une séquence représentant de chaque OTU utilisant pick_rep_set.py.
- Affecter taxonomie à l'ensemble de la séquence représentative fondée sur assign_taxonomy.py. Utiliser le classificateur projet de base de données ribosomique (RDP) avec un minimum de confiance pour enregistrer cession prévu à 0,80.
- Aligner la séquence représentant ensemble contre les préalignée Greengenes base 16S séquences en utilisant l'algorithme pynast (align_seqs.pyavec la séquence minimale identité pour cent ensemble à 75).
- En outre, épuiser chimères d'une analyse complémentaire en exécutant identify_chimeric_seqs.py.
- Retirez toutes les positions (pas utiles pour l'inférence phylogénétique) avec le modèle de lanemask (de filter_alignment.py) avant de construire un arbre phylogénétique (de make_phylogeny.py) de l'écart.
- Enfin, générer des tableaux UTO avec make_otu_table.py, décrivant l'apparition de phylotypes bactériennes dans chaque échantillon. Utilisez le tableau OTU pour construire la carte thermique pour comparer l'abondance et l'activité bactérienne.
- Si nécessaire, calculer l'alpha et bêta de la diversité au sein de et entre les échantillons, respectivement. De la même manière, les courbes de raréfaction (graphiques de la diversité par rapport à la profondeur de séquençage) et principal Coordonnées analyse (PCoA) parcelles représentant les relations entre les communautés microbiennes peuvent également être préparés.
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Representative Results
Pour réaliser un étiquetage adéquat des bactéries métaboliquement actives présentes dans l'intestin d'insecte, l'insecte doit être exposée sur le substrat 13 de C-riche pendant une période préalablement optimisé suffisante pour permettre la séparation de la fraction plus lourde marqué facilement à partir de l'allumeur non marqué une. Dans notre cas, 13 C-glucose a été complétée dans le régime alimentaire artificiel à une concentration finale de 10 mM pendant 1 jour (Figure 1A). La même quantité de glucose normale (Figure 1B) a été fournie dans le régime alimentaire artificiel des insectes témoins. Comme mentionné précédemment, la séparation des fractions d'ADN (plus lourds de plus légère) est la base de l'ensemble du processus. Par conséquent, la première étape doit être réalisée est l'extraction de l'ADN à partir du tissu d'intérêt, dans ce cas, la communauté bactérienne associée à l'intestin de l'insecte. Pour confirmer sa qualité, il est important d'exécuter un gel d'électrophorèse pour déterminer si l'ADN à tous a été obtenue à partir de l'analysetissu zed. Sur la figure 1C, on peut observer une forte bande d'ADN génomique dans le haut de l'image qui confirme l'extraction d'ADN positif. En outre, il est nécessaire d'effectuer une PCR de diagnostic, en utilisant des amorces universelles bactériennes, afin de déterminer la présence d'ADN bactérien (figure 1D). Ce résultat positif est important de décider si continuer avec en outre la séparation de l'ADN extrait metagénomique.
Après ultracentrifugation, une fois que la quantité de l'ADN dans chaque fraction séparée est confirmée, et la mesure de la densité est faite, tracer la densité de la fraction moyenne en g / ml au cours de numéro de fraction pour confirmer la formation de gradient approprié dans des tubes, qui couvre normalement une plage de densité de 1,690 g / ml (pour la fraction 12 ou 11) à 1,760 g / ml (Pour la fraction 1). Pyroséquençage quantitative est effectuée directement sur les gradients de SIP représentatifs de révéler lignée des espèces et l'abondance relative (Figure 2 13 C-glucose échantillon modifié et le contrôle sans étiquette, qui a servi pour le profilage des populations actives dans la communauté. Après séquençage, un total de 120 045 de haute qualité lit avec une longueur moyenne de 404 nucléotides ont été générés. Le profil de pyroséquençage a montré une abondance accrue de certaines espèces, y compris Enterococcus et Pantoea marqué dans l'échantillon (13 ADN marqué au C, figure 3) par rapport à celle dans le groupe témoin (C Control DNA 12, figure 3). Par conséquent, ces bactéries sont considérés comme métaboliquement active, et mérite une étude plus approfondie.
Expérience figure 1. 13C-glucose alimentation, de l'extraction de l'ADN et l'amplification par PCR de l'ARNr 16S bactérien gen e. (A) 13 C-glucose modifié régime artificiel consommée par larves de Spodoptera littoralis (B). Glucose native (12 C-glucose) a modifié l'alimentation artificielle consommée par des larves du même lot d'insectes utilisés dans (A), qui sert de contrôle (C). typique de l'ADN extrait à partir de metagénomique le tissu de l'intestin des larves dans le groupe de traitement 13 C-glucose et dans le groupe témoin 12 C-glucose. Trois répliques biologiques (voies 1, 2 et 3) sont inclus dans chaque groupe. M représente de 1 kb d'ADN marqueur. (D) d'amplification par PCR avec un jeu d'amorces bactériennes universelles génère les bons produits géniques de 1,5 kb de l'ARNr 16S en utilisant l'ADN extrait metagénomique comme matrice. Les pistes 1 est le contrôle positif à la PCR. La piste 2 et 3 représentent la 13 C-glucose et l'échantillon traité au contrôle 12 C-glucose, respectivement. "target =" _blank jpg "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Esquisse d'une expérience Pyro-SIP impliquant ultracentrifugation en gradient de densité de CsCl et la fraction la caractérisation de pyroséquençage de l'ADN séparé. H = plus grande abondance, L = faible abondance. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. La diversité bactérienne et l'abondance relative dans les fractions lourdes du glucose nourri les larves natif (12 d'ADN C-contrôle) et 13 C-glucose larves nourries (ADN 13 C marqué)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
L'intestin de la plupart des insectes abrite une communauté microbienne riche et complexe; généralement 10 7 -10 9 cellules procaryotes déposer là, plus nombreux que les propres cellules de l'hôte dans la plupart des cas. Ainsi, l'intestin de l'insecte est un "point chaud" pour les activités microbiennes différentes, représentant de multiples aspects des relations microbiennes, de la pathogenèse d'obliger mutualisme 27. Bien que de nombreuses études ont décrit une étonnante variété de communautés microbiennes intestin des insectes, la caractérisation de l'activité métabolique de la microflore intestinale est rare. Isotopes stables de sondage approches offrent maintenant la possibilité de distinguer les membres actifs d'un microbiote fond complexe indépendant de la culture et même in vivo. Nous avons appliqué cet outil précieux pour étudier la flore intestinale dans un système de modèle d'insecte, coton ver de feuilles (Spodoptera littoralis). Depuis le glucose est le sucre dominant dans l'intestin de coton noctuelle, dans cette démonstration, nous avons nourri le larvae avec une alimentation artificielle dopé avec une dose supplémentaire, mais physiologique de 13 C-glucose pour suivre les bactéries métaboliquement actives dans la flore intestinale. Une incubation identique établie avec le glucose natif fourni un contrôle essentiel pour comparaison ultérieure de s'assurer que tout étiquetage apparente de l'acide nucléique n'est pas un artefact de la méthode elle-même, tels que la haute teneur en G+ C dans l'ADN contribuent à la séparation. La proximité de concentration in situ de glucose dans plus réduit biais expérimental. Autres considérations relatives à une configuration expérimentale rigoureuse de l'étude de l'ADN-SIP a été discuté ailleurs 28,29. Les bactéries intestinales sont normalement métaboliquement très actif et avoir le temps de génération court par rapport aux micro-organismes de la plupart des milieux terrestres et aquatiques. Ainsi, une alimentation en continu de 24 heures a provoqué un étiquetage déjà significatif. Notez qu'une grande quantité d'ADN génomique d'accueil a également été coextraites des tissus intestinaux, qui devrait être en tenantconsidération lors de l'examen des résultats.
Le type de caractérisation de la fraction de gradient s'appuie sur les méthodes des empreintes basse résolution, telles que la borne polymorphisme de longueur de fragment (T-RFLP), et la construction de la bibliothèque de clone de temps pour lier les données. Ce n'est que récemment que l'avènement de haut débit technique de séquençage de deuxième génération permet une analyse rapide, rentable, et détaillée des communautés microbiennes complexes. Ici, nous avons appliqué cette nouvelle technologie pour étudier directement la composition génétique des fractions de gradient de densité et d'identifier les bactéries métaboliquement actives, qui ont donné une sensibilité accrue par rapport aux méthodes basées sur l'électrophorèse de gel, et facilité la classification phylogénétique ultérieure. En comparant les fractions lourdes équivalentes à la fois du 13 C marqué et 12 échantillons C-commande, nous constatons que Pantoea et Enterococcus sont devenus étiquetés sur isotope sondage. Une fois que le Metabbactéries olically actifs ont été identifiés, d'autres analyses comme l'hybridation fluorescente in situ (FISH) utilisant des sondes spécifiques et l'analyse métagénomique de l'ADN marqué recouvrées des membres actifs de la communauté peut être menée afin de fournir un aperçu complet des vrais symbiotes associés à l'hôte . Sur la base du système mis en place ici, d'autres sources de carbone 13 C-marqués peuvent également être introduits dans l'hôte pour disséquer les bactéries impliquées dans la voie métabolique de l'intestin ciblée, par exemple, l'étiquetage de la cellulose pour identifier les bactéries actives intervenant dans le processus de la digestion de l'hôte. Avec le développement de ces nouvelles approches, le rôle des insectes microbiote intestinal deviendra plus évident qu'à l'heure actuelle.
Collectivement, le protocole décrit ici représente une méthode simple, rapide et efficace pour déterminer les activités métaboliques de la flore intestinale, ce qui pourrait en outre être utilisé pour évaluer le rôle spécifique des bactésymbiotes rial de la nutrition de l'hôte, la désintoxication, et de la défense.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Nous remercions Angelika Berg à l'aide de laboratoire. Ce travail a été soutenu et financé par la Société Max Planck et l'École Jena for Microbial Communication (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
