Summary
Den aktiva bakteriesamhället i samband med tarmen av Spodoptera littoralis, bestämdes med stabil-isotop-sondering (SIP) kopplad till pyrosekvensering. Med användning av denna metod, var identifieringen av de metaboliskt aktiva bakteriespecies i samhället gjort med hög upplösning och precision.
Abstract
Guts flesta insekter är bebodda av komplexa samhällen av symbiotiska icke-patogena bakterier. Inom sådana mikrobiella samhällen är det möjligt att identifiera kommen eller mutualistic bakteriearter. De senare, har observerats att tjäna flera funktioner till insekten, det vill säga att hjälpa i insekts reproduktion 1, öka immunsvaret 2, feromonproduktion 3, samt näring, däribland syntesen av essentiella aminosyror 4, bland annat.
På grund av betydelsen av dessa föreningar, har många ansträngningar gjorts för att karakterisera de samhällen ned till de enskilda medlemmarna. Men de flesta av dessa ansträngningar var antingen baserade på odlingsmetoder eller förlitat sig på generering av 16S rRNA genen fragment som sekvenserades för slutlig identifiering. Tyvärr är dessa metoder bara identifierat de bakteriearter som finns i tarmen och under förutsättning att ingen informatjonen på den metaboliska aktiviteten hos mikroorganismerna.
För att karakterisera de metaboliskt aktiva bakteriearter i tarmen hos en insekt, använde vi stabil isotop sondering (SIP) in vivo med användning av 13 C-glukos som en universell substrat. Detta är ett lovande kultur fria teknik som tillåter bindningen av mikrobiella fylogenier till deras speciella metaboliska aktiviteten. Detta är möjligt genom att spåra stabila isotopmärkta atomer från substrat i mikrobiella biomarkörer, såsom DNA-och RNA-5. Införlivandet av 13 C-isotoperna i DNA ökar densiteten av det märkta DNA: t i förhållande till den omärkta (12 C) ett. I slutändan är den 13 C-märkt DNA eller RNA separerades genom densitetsultracentrifugering från 12 C-omärkt liknande en 6. Efterföljande molekylär analys av de separerade nukleinsyrasekvenser isotopomererna tillhandahåller anslutningen mellan metabolisk aktivitet och identiteten av arten.
Här presenterar vi det protokoll som används för att karakterisera de metaboliskt aktiva bakterier i tarmen hos en generalist insekt (vårt modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Den fylogenetisk analys av DNA utfördes med användning av pyrosekvensering, som tillät hög upplösning och precision vid identifiering av insekts gut bacterial community. Som huvudsakliga substrat, var 13 C-märkt glukos användes i experimenten. Substratet matades till de insekter med hjälp av en konstgjord diet.
Introduction
Insect-bakteriella symbiotiska föreningar är kända för ett stort antal insektsarter 7. I dessa symbiotiska föreningar, mikroorganismer spelar en viktig roll i tillväxten och utvecklingen av insekter. Mikrober har visat sig bidra till en insekt reproduktion 1, feromon biosyntes 3, näring, inklusive syntes av essentiella aminosyrorna 4 och digerering av otillgängliga mat till värden. Trots det stora utbudet av gut-bakteriella föreningar, än mindre är känt om den funktionella roll de spelar till förmån för insekten. Endast i fall av termiter, det symbiotiska digestion av lignocellulosa utförs av prokaryoter, protozoer och svampar, har studerats ingående 8,9. I motsats till detta, är lite känt om det symbiotiska förening som finns i tarmen av generalist insekter dvs bomulls leafworm, littoralis Spodoptera. Dessutom på grund av sin täta förskjutning av växtvärdar, allmänist insekter och deras gut associerade bakteriesamhällen är ständigt utsatta för nya utmaningar kopplade till deras matvanor krävande anläggningar med en uppsjö av fytokemikalier. Bredvid detta tarmen miljö lepidopterans representerar i sig en hård miljö för tillväxt av bakterier på grund av den höga gut pH 10. Särskilt i fallet med S. littoralis, varierar den från 10,5 i framtarmen, ca. 9 i midgut att pH-värdet nästan 7 i hindgut 11. Å andra sidan, den bakteriella gemenskap associerad med tarmen hos S. littoralis är enkel. Tang, Freitak, et al. 12 rapporterade högst 36 phylotypes tillhör totalt 7 olika bakteriearter som de enda medlemmarna av bakteriesamhället i samband med denna insekt. Förutom detta, är ingen komplicerad uppfödning förfarande krävs för insekters tillväxt i laboratoriet. Dessutom är det här, och den korta livscykel insekt lätta multi-generational studier, svarvning denna art i ett perfekt modellsystem för att studera gut-mikrob-interaktioner.
Med tillkomsten av PCR-baserade sekvensering teknik, har flera studier som behandlar gut biota av flera organismer (dvs. människor, insekter, eller marina organismer) ökat. Dessutom är resultaten oberoende av isolering och odling av tarm hyste bakterier som tidigare. Nästan 99% av bakterier är inte förökas och simulering av de miljöförhållanden som råder i tarmen är svår 12. Genom att använda PCR, kunde 16S rRNA genfragment (en allmänt använd fylogenetisk gen markör bland bakterier) selektivt amplifieras från en blandad DNA-mall av tarmbakteriesamhällen, sekvenseras och klonas. Med denna information kan användaren identifiera bakteriearter efter hämtning av sekvensinformation från offentliga databaser 13,14. Ändå närmar sig sekvensering för att beskriva bakteriellsamhällen förblir otillräckliga på grund av bristande information om den inneboende metaboliska bidrag av enskilda arter inom gemenskapen.
Stabil-isotop sondering (SIP) är ett lovande kultur-fri teknik. Den används ofta i miljömikrobiologi för att analysera mikrobiella fylogenier kopplade till speciella metaboliska aktiviteter. Detta uppnås genom att spåra stabila isotopmärkta atomer från substrat i mikrobiella biomarkörer, såsom fosfolipid härrörande från fettsyror, DNA och RNA 5. När man överväger nukleinsyror, är den metod som baseras på separation av 13 C-märkt DNA eller RNA från den omärkta DNA genom densitet-gradient ultracentrifugering 6. På grund av denna direkta förbindelse mellan den DNA-etikett och metabolisk aktivitet, en nedströms molekylär analys av nukleinsyrorna identifierar arten och ger information om metaboliska aktiviteter. Dessutom är kombinationen av DNA-SIP och pyrosekvensering som tillämpas avPilloni von Netzer, et al. 15, medger en viss enkel och känslig identifiering av bakteriearter som finns i den tunga 13 C-märkt DNA-fraktionen. Hittills har denna teknik använts för att beskriva de bakteriella samhällen som deltar i biogeokemiska processer i marken under aeroba 16,17 och anaeroba förhållanden 18,19. Vid sidan av användningen i miljövetenskap, har tekniken använts i medicinska vetenskaper som rapporterats av Reichardt, et al. 5, som beskrev den metaboliska aktiviteter av olika fylogenetiska grupper av den mänskliga tarmfloran som svar på en icke-smältbar kolhydrat.
Här använder vi 13 C-glukos till "etikett" DNA av de metaboliskt aktiva bakteriearter i tarmen. Glukos är en sockerart som används av de flesta bakteriearter längs den utbredda Entner-Doudoroff (ED) vägen, även om undantag är kända 20. Dettamotiverar användningen av 13 C-glukos som en pålitlig metabolisk sond som ger ett samband mellan metaboliter av intresse och kolkälla längs etablerade vägar. Beroende på den vetenskapliga frågan, andra substrat, dvs 13 C-metan, 13 CO2, eller växter som fötts upp under en 13 CO 2 atmosfär, kan användas för att behandla metaboliska aktiviteter.
Vid denna punkt, presenterar vi det protokoll som används i den metaboliska karakterisering av tarmen bakteriell gemenskap av en generalist insekt, nämligen S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Dessutom var den teknik kopplad till pyrosekvensering, vilket i sin tur gör det möjligt att identifiera insekts tarm bakteriell gemenskap med hög upplösning och precision. Eftersom det huvudsakliga substratet var 13 C-märkt glukos användes under experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insekt Uppfödning
- Köpa eller få ägg kopplingar av Spodoptera littoralis från din egen uppfödning. Behåll dem i sterila petriskålar i rumstemperatur (RT) till kläckning.
- Förbered artificiella dieten för insekterna föder upp enligt följande:
- Blöt 500 g malda vita bönor över natten i 100 ml vatten.
- Lägg 9,0 g askorbinsyra och 75 g agar till 1000 ml destillerat H2O och därefter koka den.
- Låt blandningen svalna och när det stelnar (till ett vitt vaxartat fast blandning) förvaras vid 4 ° C fram till användning.
- Överför nykläckta larverna till en ren plastlåda och bak dem på konstgjord diet vid 23-25 ° C under en lång dag regim med 16 timmar av belysning och 8 timmar av mörker. Byt mat varje dag tills larverna gå igenom alla sex larv instars.
2. 13 C-märkning av DNA i metaboliskt aktiva gutbakterier
- Lös 186,1 mg fullt 13 C-märkt glukos med destillerat och avjoniserat vatten (DDH 2 O) och blanda det väl med 100 g artificiell diet för SIP-experimentet. Se till en slutlig 13 C-glukoskoncentration på 10 mM i den konstgjorda diet. Detta efterliknar in situ glukoskoncentrationen i tarmen hos S. littoralis larver livnär sig på bomullsplantor enligt Shao et al. (lämnas).
- Överför 9-15 friska andra stadiets larver från uppfödning rutan till sterila plastpetriskålar (en larv per petriskål) som innehåller färska 13 C-glukos spetsade artificiell diet. Använd artificiell diet innehållande samma mängd av nativ glukos (12 C-glukos), som beskrivs, för matning av kontrollgruppen.
- Förnya den konstgjorda diet ofta under inkubationstiden (1 dag). Använd uppfödningsförhållanden som i steg 1.3.
- Samla nio larver från varje behandling för senare bearbetning (DNA-extraktion). Varjereplikera utgörs av tre personer, göra minst tre replikat per behandling.
3. Insekt Dissection
- Rengör och desinficera dissekera verktyg i början av arbetet med etanol 70% (Verktyg = Vannas sax, pincett och skalpell med fina engångsblad).
- Ta insekter med en mjuk pincett och tvätta huden ytligt med destillerat vatten. Placera dem på is under åtminstone 30 min för att söva dem.
- Medan han fortfarande sövda rum dem vid 0 ° C i 1 timme för att döda dem. Desinficera döda insekter ytligt genom att sänka ner dem i etanol (70%) för ett par minuter.
- Utför insekt dissektion till en volym av cirka 15 ml av 1 x PBS avsatt på en steril petriskål (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4, justera pH till 7,4 , autoklav). Se till att ha hela insekten kroppen helt nedsänkt i solutjon under hela dissekera perioden.
- Begin dissektion genom att göra ett snitt i huden längs de högra och vänstra sidorna av den insekt, påbörjas på huvudet och avsluta på anus. Ta bort hela huden, Malpighian tubuli, och fett kroppen. Byt till färsk buffert innan du skär öppna tarmen. § tarmen i fören-, mid-och hindgut vid behov. Förvara vävnad i en frys (-80 till -20 ° C) tills DNA-extraktion
4. DNA-extraktion och-amplifiering
- Placera insekt vävnad i ett 1,5 ml sterilt centrifugrör och torka samtliga prover vid 45 ° C i en vakuumkoncentrator enhet. Krossa torkad vävnad med en steril plastmortelstöt.
- Extrahera det genomiska DNA med användning av en lämplig sats för jord-DNA-extraktion. Överför torr trasa till reaktionsröret i satsen och följ instruktionerna som anges av tillverkaren.
- Bestäm koncentrationen av den slutliga eluerade DNA med användning av en spektrofotometer.
- Verifya framgångsrik extraktion av den mikrobiella metagenomic DNA från insekten tarmen genom att förbereda en diagnostisk PCR-analys med hjälp eubakteriella generella primers 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) och 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Ställ in PCR-reaktion enligt följande:
- Ställ in en 50 | il reaktionsblandning innehållande 1 x buffert, 1,5 mM MgCl2, 10 mM fyra deoxinukleosidtrifosfater (dNTP), 2,5 U av Taq DNA-polymeras, 0,5 mM av varje primer och 60 ng av det extraherade DNA som mall.
- Kör PCR-reaktioner med användning av en termocykler enligt följande: initial denaturering vid 94 ° C under 3 min, följt av 35 cykler: 94 ° C under 45 sek, hybridisering vid 55 ° C under 30 sek och extension vid 72 ° C under 1 min . Använd ett slutligt förlängningssteg vid 72 ° C under 10 min.
- Verifiera den framgångsrika PCR-förstärkning i en 1% agaros elektrofores etidiumbromid (EB) färgade gel (lös upp 1 g agaros i 100 ml 1x TAE buffert och fläcken med 1 pl EB). Deposition 5 pl av the PCR-produkt + 1 pl av 6x laddningsfärg i gel fickor. (1x TAE = 40 mM Tris-bas, 20 mM ättiksyra, 1 mM EDTA, justerat till pH 8).
- Kör gelén med användning 1xTAE buffert vid 300 V, 115 mA under ca. 20 min i en elektroforeskammare. Genom att använda en gel dokumentationskammare (UV-transilluminator ansluten till en digital kamera och dator) observera gelen och jämföra storleken på din slutprodukt med den också laddad genen markör, rätt storlek på amplikonema måste vara av ungefär 1,5 kb.
- Förvara PCR-produkter under djupfrysning förhållanden, företrädesvis -80 ° C, till dess användning.
5. DNA-separation-CsCl ultracentrifugering
- Förbered reagensen för gradienterna för ultracentrifugering på följande sätt:
- Framställ en 7,163 M cesiumklorid (CsCl)-lösningen genom gradvis upplösning av 603,0 g CsCl i DDH 2 O och fylla upp till en slutlig volym av 500 ml.
- Noggrant DETermine densiteten för den framställda CsCl-lösning genom vägning av en 1,0 ml alikvot i ett tresiffrigt balans av triplikat. Denna ligger vanligen mellan 1,88 och 1,89 g / ml vid RT.
- Förbered gradient buffert (100 mM Tris, 100 mM KCl och 1 mM EDTA) genom att kombinera 50 ml av 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) och 3,75 g kaliumklorid i en slutlig volym av 500 ml med hjälp av DDH 2 O. Filter (0,22 | im) sterilisera och autoklavera denna lösning.
- DNA-separation
- Efter att ha bestämt den individuella DNA-koncentration av de behandlade insekter, mätt som i punkt 4.3, pool sådana insekter som motsvarar en kopia tillsammans och normalisera deras DNA-koncentrationen för att säkerställa att var och en bidrar lika till det poolade provet. En slutlig koncentration av 500-5,000 ng DNA (mät igen den slutliga koncentrationen) är lämplig för ultracentrifugering process 21.
- För att ställa in lutning mediet, kombinera den kvantifierade DNA, lutning buffert end 4,8 ml 7,163 M CsCl lösning tillsammans med en blandad volym av 6,0 ml i en steril 15 ml skruvkork rör (generering av en gradient medel DNA-blandning).
- Placera försiktigt den preparerade gradient medel DNA-blandningen in i en 5,1 ml ultracentrifugrör (fyll i tills basen av röret nacken) med användning av en spruta och nål. Undvik att pumpa eller bilda några luftbubblor. Ta med minst en tom lutning (med DDH 2 O i stället för DNA) i varje centrifug körning som referens gradient.
- Vågröret spar till inom 10 mg i vikt efter varje erforderlig lutning mediet fylles i respektive ultracentrifugrör. Förslut röret med en "Tube Topper" och se till att tätningen är läckagefritt genom att vända röret och applicera måttligt tryck för hand.
- Använd en nära vertikal rotor med åtta brunnar för att hålla 5,1 ml ultracentrifugering rör för ultracentrifugering. Täta omsorgsfullt rotorbrunnar och ladda rotorn i ultracentrifugen enligt maverkaren instruktioner. Ställ in ultracentrifugeringsförhållanden: centrifugering vid 50000 rpm (cirka 177.000 xg), temperatur vid 20 ° C, och ultracentrifugering drifttid för 40 h med vakuum. Välj maximal acceleration och retardation utan broms.
- När du är klar, försiktigt bort rören från centrifugen rotor med pincett. Placera dem i ett rack utan att störa de bildade gradienter i rören. Process gradienten fraktione proverna så snart som möjligt för att minimera spridning.
- Hämtning av DNA från isopyknisk Separerade övertoningar genom fraktione
- Använd ett korrekt HPLC pumpsystem för att utföra lutning fraktionering, som lika separerar de bildade gradienter från ultracentrifugrör topp förskjutningsmetod för. Anslut HPLC-pump (100% flöde gradient) till flaskan fylld med ett L förskjutning DDH 2 O och tätt fästa till det öppna pumpslangen med en 23 G 1 i sprutnål. Lägg tillräckligt med bromophenol blått färgämne i DDH 2 O för att ge det en mörkblå färg. Detta underlättar visualisering av gränssnittet mellan gradienten mediet och förskjutningen av DDH 2 O.
- Ställ pumpen till en flödeshastighet av 850 ul / min och jämvikta systemet tills en enda droppe av det blå-färgad DDH 2 O framträder ur sprutan nål.
- Noggrant fixera ultracentrifugrör till en klämma stativ och tränga igenom botten av röret med en spruta 23 G 1 i lång nål. Koppla pumpen till ultracentrifugrör genom insättning av nål fäst vid pumpslangen in i toppen av röret, och samla upp droppar från botten direkt i sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör. Samla en bråkdel var 30 sekund, som uppgår till ca 425 l per fraktion och totalt 12 fraktioner per lutning. Observera att den sista fraktionen (fraktion 12) innehåller vanligtvis förskjutningen DDH 2 O och bör kasseras.
- Efter fraktionering, migasure tätheten av alla separerade fraktioner med hjälp av en analysvåg som nämns i steg 5.1.2.
- Fällning DNA från varje fraktion (omkring 425 | il) genom att först tillsätta en il glykogen (20 ug / ul i DDH 2 O, autoklaverat) som en bärare för utfällning av låg mängd av DNA. Blanda väl genom att vända.
- Lägg två volymer (850 fil) av polyetylenglykol (PEG)-lösning (lös upp 150 g polyetylenglykol 6000 och 46,8 g NaCl i DDH 2 O till en total volym av 500 ml. Filter, sterilisera och autoklav. PEG-lösning är 30 % PEG 6000 och 1,6 M NaCl), och blanda igen genom att vända upp tio gånger.
- Lägg rören vid RT under åtminstone två timmar (om nödvändigt, över natten) för att fälla ut DNA.
- Centrifugera fällningar vid 13.000 xg under 30 min vid rumstemperatur. En synlig pellets bör ingå.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och tvätta pelleten med 500 | il av 70% etanol. Centrifugera under sammaVillkoren för 10 min igen.
- Försiktigt kassera supernatanten och lufttorka pelleten vid RT under 15 min.
- Lös åter upp torkades DNA-pelleten i 30 | il av DDH 2 O och blanda väl genom att försiktigt knacka på röret. Kvantifiera DNA i varje lutning fraktion som i steg 4.3 Store av proverna under -20 eller -80 ° C vid längre förvaring krävs.
6. DNA Karakterisering av Pyrosequencing
- Säkerställ att den omärkta nativa (12 C)-DNA upptar densitetsintervallet från 1,705 g / ml till 1,720 g / ml, medan 13 C-märkt DNA har en densitet av omkring 1,720 till 1,735 g / ml. Notera att både den nativa och 13 C-märkt DNA från miljöprover kan sträcka sig över flera gradientfraktioner. Expect ljuset DNA som skall associeras med fraktionerna 9-11 och den tunga DNA som skall associeras med fraktionerna 4-6.
- Kombinera nyckel fraktioner för att skapa en enda "sammanställt" representativ del acligt specifik topp fördelning av densiteten upplöst DNA. Alternativt kan andra metoder för att undersöka de separerade fraktionerna med hjälp av isotopförhållandet masspektrometri (IRMS) 22 eller ett fingeravtryck metod, såsom denaturerande gradientgel-elektrofores (DGGE) 23, hjälper till att välja lämpliga fraktionerna före sekvensering.
- Utför Pyrosequencing av PCR-förstärkta bakteriella 16S rRNA gener från de kompilerade tunga, medelljusa och ljusa fraktioner av varje enskild lutning. Med hjälp av denna metod, identifiering av härstamning och relativ förekomst av metaboliskt aktiva bakteriearter i SIP inkuberade proverna är möjlig. Utför pyrosequencing på följande sätt:
- Utför amplikon pyrosequencing hjälp av en Roche 454 FLX instrument med Titanium reagenser.
- Förbered streckkodade amplikoner för multiplexering med användning av fusions primeruppsättning Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) och Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 förlängas med the respektive primer Adapter A / B och provspecifika multiplex identifierare (MID).
- Applicera ett en-stegs PCR med 30 cykler, med användning av en Hot Start Taq-polymeras, för att generera sekvensbibliotek.
- Sekvensera amplikoner baserade på leverantörens protokoll och förlänga läser från den framåtgående riktningen (Gray28F) såsom beskrivits i http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyrosequencing Data Analysis
- Analysera rå sekvensen läser genereras av 454 pyrosequencing med de "kvantitativa insikter i mikrobiell ekologi", QIIME programvara rörledning 26. Utför behandlingen enligt följande:
- Inledningsvis omvandla 454-maskingenererade SFF-fil till FASTA, QUAL och Flowgram filer med process_sff.py manus.
- Validera kartläggningen filen (baserat på check_id_map.py) och tilldela multiplex läser till biologiska sampel med split_libraries.py skriptet. Trimma låg kvalitet avslutas med ett skjutfönsterstorlek på 50 och en genomsnittlig kvalitet cutoff parameter 25, eliminerar också korta tvetydiga sekvenser (den längd <200 bp) från datamängden.
- Denoise de 454 data med hjälp av denoise_wrapper.py.
- Därefter kluster hög kvalitet läser till operativa taxonomiska enheter (Otus) med hjälp av multipla OTU plocka metod (pick_otus.py med 97% sekvenslikhet cut-off).
- Välj ett representativt sekvens från varje OTU använder pick_rep_set.py.
- Tilldela taxonomi till den representativa sekvensuppsättning baserad på assign_taxonomy.py. Använd Ribosomal Databasprojektet (RDP) klassificerare med minst självförtroende att spela uppdrag satt till 0,80.
- Rikta den representativa sekvens som mot de prealigned Greengenes kärn 16S-sekvenser med hjälp av algoritmen PyNast (align_seqs.pymed minsta sekvensidentitet procentuell sättning till 75).
- Dessutom bryter chimärer från vidare analys genom att köra identify_chimeric_seqs.py.
- Ta bort alla gap positioner (ej användbara för fylogenetisk inferens) med lanemask mallen (filter_alignment.py) innan bygga ett fylogenetiskt träd (make_phylogeny.py).
- Slutligen genererar OTU tabeller med make_otu_table.py beskriver förekomsten av bakteriella phylotypes inom varje prov. Använd OTU tabellen att konstruera heatmap för jämförelse av den bakteriella förekomst och aktivitet.
- Om det behövs, beräkna alfa-och beta mångfald inom och mellan prover, respektive. På samma sätt kan förtunning kurvor (grafer av mångfald kontra sekvense djup) och Principal Koordinater Analysis (PCoA) tomter som representerar relationer mellan mikrobiella samhällen vara också förberedd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att uppnå tillräcklig märkning av de metaboliskt aktiva bakterier som finns i insekts tarmen måste insekten att exponeras för de 13 C-rika substrat för ett tidigare optimerade period som är tillräcklig för att möjliggöra separation av det märkta tyngre fraktionen lätt från den omärkta ljusare en. I vårt fall var 13 C-glukos kompletterat i den konstgjorda dieten vid en slutlig koncentration av 10 mM under 1 dag (Figur 1A). Samma mängd normal glukos (Figur 1B) tillfördes i den konstgjorda dieten av kontroll insekter. Som tidigare nämnts, är grunden för hela processen separation av DNA-fraktioner (tyngre från ljusare). Därför är det första steget som skall utföras är extraktion av DNA från vävnaden av intresse, i detta fall, den bakteriella gemenskap associerad med insekts tarmen. För att bekräfta dess kvalitet är det viktigt att köra en elektroforesgel att bestämma om någon DNA alls erhölls från analyzed vävnad. I fig. 1C är det observerbara ett starkt band av genomiskt DNA vid den övre delen av bilden som bekräftar den positiva DNA-extraktion. Dessutom är det nödvändigt att utföra en diagnostisk PCR, med användning av bakteriella universella primrar, för att bestämma närvaron av bakteriellt DNA (figur 1D). Detta positiva resultat är det viktigt att bestämma om ytterligare fortsätta med separationen av det extraherade metagenomic DNA.
Efter ultracentrifugering, när mängden av DNA i varje separerade fraktionen är bekräftad, och mätningen av densiteten sker, plotta den genomsnittliga fraktionen densiteten i g / ml över fraktionsnummer för att bekräfta den korrekta gradient bildning i rören, vilken normalt täcker en densitetsintervallet från 1,690 g / ml (för fraktion 12 eller 11) till 1,760 g / ml (Till fraktion 1). Kvantitativ pyrosequencing utförs direkt på de representativa SIP lutningar att avslöja arten härstamning och relativ förekomst (Figur 2 13 C-glukos ändrade prov och omärkt kontroll, som tjänade för profilering aktiva populationer i samhället. Efter sekvensering, totalt 120045 högkvalitativ läser med en genomsnittlig längd av 404 nukleotider genererades. Pyrosequencing profilen visade en ökad förekomst av vissa arter, inklusive Enterococcus och Pantoea i märkta provet (13 C-märkt DNA, figur 3) i jämförelse med den i kontrollgruppen (12 C Control DNA, figur 3). Dessa bakterier anses därför vara metaboliskt aktiva, och förtjänar vidare studier.
Figur 1. 13 C-glukos utfodringsexperiment DNA-extraktion och PCR-amplifiering av den bakteriella 16S rRNA-gen e. (A) 13 C-glukos ändrade artificiell diet konsumeras av Spodoptera littoralis larver. (B) Infödd glukos (12 C-glukos) ändrades artificiell diet konsumeras av larver från samma parti insekter som används i (A), som tjänar som kontroll . (C) Typisk metagenomic DNA-extrakt från tarmen vävnad av larver i 13 C-glukos behandlingsgruppen och i den 12 C-glukos kontrollgrupp. Tre biologiska replikat (spår 1, 2 och 3) ingår i varje grupp. M står för 1 kb DNA-markör. (D) PCR-amplifiering med en universell bakterie primeruppsättning alstrar de korrekta 1,5 kb 16S rRNA-genprodukter genom att använda den extraherade metagenomic DNA som templat. Lanes 1 är ett PCR-positiv kontroll. Lane 2 och 3 representerar den 13 C-glukos behandlade provet och 12 C-glukoskontroll, respektive. jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Disposition av en Pyro-SIP experiment med CsCl densitetsgradient ultracentrifugering och fraktion karakterisering med pyrosekvensering av det separerade DNA. H = högre överflöd, L = lägre överflöd. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Bakteriell diversitet och relativ förekomst i de tunga fraktionerna av den nativa glukos matades larver (12 C-kontroll-DNA) och 13 C-glukos matades larver (13 C-märkt DNA)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarmen hos de flesta insekter hyser en rik och komplex mikrobiella, typiskt 10 7 -10 9 prokaryota celler lämna där, outnumbering värdens egna celler i de flesta fall. Således är insekten tarmen en "hot spot" för olika mikrobiella aktiviteter, som representerar flera aspekter av mikrobiella relationer, från patogenes att obligat mutualism 27. Även om många studier har beskrivit ett fantastiskt utbud av insekts tarmen mikrobiella samhällen, karaktärisering av den metaboliska aktiviteten hos tarmfloran är sällsynt. Stabila isotop sondering metoder erbjuder nu en möjlighet för att skilja de aktiva medlemmarna från en komplex mikrobiota bakgrund oberoende av odling och även in vivo. Vi tillämpat denna värdefullt verktyg för att studera tarmfloran i ett insektsmodellsystem, bomull blad mask (Spodoptera littoralis). Eftersom glukos är den dominerande socker i tarmen av bomulls leafworm, i denna demonstration vi matade LARVae med en konstgjord diet spetsade med en extra men fysiologisk dos av 13 C-glukos för att spåra de metaboliskt aktiva bakterier i tarmfloran. En identisk inkubation upprättas med infödda glukos ges en kritisk styr för senare jämförelse för att säkerställa att alla uppenbara märkning av nukleinsyra inte var en artefakt av själva metoden, såsom hög G+ C-halten i DNA bidrar till separation. Den nära in situ koncentration av glukos dessutom minskat experimentell partiskhet. Andra synpunkter avseende en rigorös experimentuppställning av DNA-SIP studie har diskuterats på andra ställen 28,29. Tarmbakterier normalt är metaboliskt mycket aktiv och har kort generationstid jämfört med mikroorganismerna från de flesta land-och vattenmiljöer. Således en 24 tim kontinuerlig matning orsakade redan en betydande märkning. Lägg märke till att en stor mängd värd genomiskt DNA var också extraheras samtidigt från tarmvävnader, vilka bör med hänsynbeaktande när man diskuterar resultaten.
Den typiska gradienten fraktion karakterisering åberopar lågupplösta fingeravtrycksmetoder, såsom terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), och tidskrävande klon bibliotek konstruktion för att länka data. Det är först nyligen som tillkomsten av hög genomströmning andra generationens sekvensering möjliggör snabb, kostnadseffektiv, och detaljerad analys av komplexa mikrobiella samhällen. Här har vi tillämpat denna nya teknik för att direkt överblicka den genetiska sammansättningen av densitet gradientfraktioner och identifiera metaboliskt aktiva bakterier, som gav ökad känslighet jämfört med gelelektrofores baserade metoder, och underlättat senare fylogenetiska klassificeringen. Genom att jämföra likvärdiga tunga fraktioner från både 13 C-märkt och 12 C-kontrollprover, finner vi att Pantoea och Enterococcus blev märkta på isotop sondering. När metabolically aktiva bakterier har identifierats, kan andra analyser, t.ex. fluorescens in situ hybridisering (FISH) med hjälp av specifika prober och metagenomic analys av den märkta DNA återhämtat sig från aktiva samhällsmedlemmar utföras för att ge en heltäckande inblick i de verkliga symbionter förknippas med värden . Baserat på den etablerade systemet här kan även andra 13 C-märkta kolkällor också matas in i värden för att dissekera de bakterier som är involverade i den målsökta gut metaboliska vägen, till exempel, märkning av cellulosa för att identifiera aktiva bakterier involverade i värdrötningsprocessen. Med utvecklingen av sådana nya metoder, kommer betydelsen av insektstarmfloran blir tydligare än idag.
Kollektivt det protokoll som beskrivs här representerar en enkel, snabb och effektiv metod för bestämning av metaboliska aktiviteter av tarmfloran, vilket ytterligare skulle kunna användas för att bedöma den specifika rollen av bakteriellrial symbionter i värd näring, avgiftning, och försvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Angelika Berg för laboratorieassistans. Detta arbete stöddes och finansierades av Max Planck-sällskapet och Jena Skolan för Microbial Communication (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
