Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması Published: November 13, 2013 doi: 10.3791/50734
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Spodoptera littoralis gut ile ilişkili aktif bakteriyel topluluk, piro sıralamadır bağlanmış kararlı-izotop-tarama (SIP) ile belirlenmiştir. Bu yöntemi kullanarak, toplum içinde aktif metabolik bakteri türlerinin belirlenmesi, yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile yapıldı.

Abstract

Çoğu böceklerin bağırsaklar simbiyotik patojenik bakterilerin karmaşık topluluklar tarafından iskan. Bu tür mikrobiyal topluluklar içinde bu ortakçı veya mutualistik bakteri türleri tanımlamak mümkündür. İkincisi olanlar, örneğin, diğerlerinin yanı sıra, temel amino asitler 4 sentezi de dahil olmak üzere, immün yanıtı 2, feromon üretim 3, hem de beslenme artırılması, böcek üreme 1 'de yardımcı böcek birden fazla fonksiyona hizmet ettiği gözlenmiştir.

Nedeniyle bu derneklerin önemine, birçok çabaların bireysel üyeleri aşağı toplulukları karakterize etmek için yapılmıştır. Ancak, bu çabaların çoğu ya ekimi yöntemlerine dayalı veya nihai tanımlama için dizilmiştir 16S rRNA gen parçalarının üretimi dayanıyordu edildi. Ne yazık ki, bu yaklaşım, sadece, bağırsakta mevcut olan bakteri türleri belirlenmiştir ve hiçbir informat ResimMikroorganizmaların metabolik aktivitesi üzerinde iyon.

Bir böceğin bağırsağında metabolik olarak aktif bakteri türünü karakterize etmek için, evrensel bir alt-tabaka olarak 13 C-glukoz kullanılarak in vivo (SIP) tarama ve sabit izotop kullanılır. Bu kendi özel metabolik aktivite mikrobiyal filogenilerin bağlantısını sağlayan ümit verici bir kültür-free tekniktir. Bu, DNA ve RNA 5 gibi mikrobiyal belirteçler, içine yüzeylerde istikrarlı, izotop işaretli atomları takip mümkündür. DNA, etiketlenmemiş (12 ° C) ile karşılaştırıldığında etiketlenmiş DNA yoğunluğunu arttırır içine 13 ° C arasında birleşme izotopları. Sonunda, 13C-etiketli DNA ya da RNA, 12 C-etiketli olmayan benzer bir 6 ila yoğunluk gradyanlı ultra-santrifüj ile ayrılır. Ayrılmış olan bir nükleik asit isotopomers daha sonraki moleküler analizi türlerin metabolizma aktivitesi ve kimlik arasındaki bağlantıyı sağlar.

Burada, bir kültürlü bir böcek (bizim model sistem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae) bağırsağında metabolik olarak aktif bakterileri tanımlamak için kullanılan bir protokol mevcut. DNA filogenetik analizi, böcek bağırsağı bakteri eden tanımlanmasında yüksek çözünürlük ve hassasiyet izin piro sıralamadır, kullanılarak yapıldı. Ana substrat olarak, 13 C-etiketli glikoz deneylerde kullanılmıştır. Substrat yapay bir diyet kullanılarak böcekler beslenmiştir.

Introduction

Böcek-bakteriyel sembiyotik dernekler böcek türlerine 7 çok sayıda için bilinir. Bu simbiyotik dernek, mikroorganizmalar böceklerin büyüme ve gelişmesinde önemli rol oynar. Mikroplar konakçıya böcek temel amino asitler 4 sentezi de dahil olmak üzere üretimi 1, feromon biyosentezi 3, beslenme ve sindirim ulaşılmaz gıda katkı gösterilmiştir. Gut-bakteriyel dernekleri çok çeşitli olmasına rağmen, çok az onlar böcek lehine oynamak işlevsel rolü hakkında bilinmektedir. Sadece termitlerin durumunda, lignoselüloz simbiyotik sindirim prokaryotlar, protozoa ve mantarlar tarafından yürütülen yaygın olarak 8,9 incelenmiştir. Buna zıt olarak, az kültürlü böceklerin bağırsağında pamuk yaprak kurdu yani içinde mevcut olan simbiyotik ilişkisi hakkında bilinen, Spodoptera genel nedeniyle bitki konak sıkça kayması, Ayrıca. Littoralisist böcekler ve bağırsak ilişkili bakteri toplulukları kalıcı olarak beslenme alışkanlıkları fitokimyasallar bir bolluk ile bitkileri tüketen bağlantılı yeni sorunlara maruz kalırlar. Bunun yanında lepidopteranlara olarak bağırsak ortamında, per se çünkü yüksek bağırsak pH 10 Bakterilerin büyümesi için bir sert çevre temsil eder. Özellikle S. durumunda littoralis, bu aralıkları foregut de 10.5 'den, midgut ca. 9. neredeyse 7 hindgut 11'inde, pH. Diğer yandan, bakteri toplum S. gut ile ilişkili littoralis basittir. Tang, Freitak, et al. 12, bu böcek ilişkili bakteri eden tek üyesi olarak 7 farklı bakteri türlerinin toplam ait 36 Şlotip en fazla rapor etmiştir. Bunun yanı sıra, herhangi bir karmaşık bir yetiştirme prosedürü laboratuarda böcek büyümesi için gereklidir. Ayrıca, bu ve böceğin kısa yaşam döngüsü çok g kolaylaştırmakenerational çalışmalar, bağırsak mikrop etkileşimleri çalışmak için ideal bir model sistem içine bu tür dönüm.

PCR-tabanlı dizileme teknolojileri ile birlikte, çeşitli organizmaların (yani insan, böcek veya deniz canlıları) gut biota ile ilgili çalışmaların sayısı artmıştır. Ayrıca, sonuçlar, geçmişte olduğu gibi izolasyon ve gut barındıran bakteri yetiştirme bağımsızdır. Bakterilerin% 99'u ekilebilir değildir ve bağırsaktaki hakim çevre koşullarının simülasyonu 12. zordur. PCR kullanarak, 16S rRNA gen fragmanları (bakteriler arasında yaygın olarak kullanılan bir filogenetik geninin markör) seçici olarak dizilenmiştir bağırsak bakteri topluluklarının, karışık bir DNA şablonu amplifiye ve klonlanabilir. Bu bilgi ile, kullanıcı kamu veritabanları 13,14 sekans bilgileri aldıktan sonra bakteri türlerini tespit etmek mümkün değildir. Bununla birlikte, dizileme, bakteri tanımlamak için yaklaşımlartopluluklar nedeniyle toplum içinde bireysel türlerin içsel metabolik katkısı hakkında bilgi eksikliği yetersiz kalır.

Kararlı izotop (SIP) sondalama gelecek vaat eden bir kültür-free tekniktir. Bu genellikle belirli metabolik faaliyetlerle bağlantılı mikrobiyal filogenezlerini analiz çevre mikrobiyolojisi kullanılır. Bu, fosfolipid türetilen yağlı asitler, DNA ve RNA gibi mikrobik biyolojik 5, alt-tabakalar olarak istikrarlı, izotop işaretli atomuna takip ederek elde edilir. Nükleik asitler göz önüne alındığında, bu yöntemin yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile 6 etiketlenmemiş DNA'dan 13 C-etiketli DNA ya da RNA'nın ayrılması üzerine dayanır. Nedeniyle DNA etiket ve metabolik aktivite arasındaki doğrudan bağlantı için, nükleik asitlerin bir alt analiz moleküler türlerin tanımlar ve metabolik faaliyetleri ile ilgili bilgi sağlar. Ayrıca, DNA-ve SIP, piro sıralamadır kombinasyonu tarafından uygulananPilloni, von Netzer, et al. 15 ağır 13C-etiketli DNA fraksiyonunda mevcut olan bakteri türlerinin özellikle basit ve hassas bir şekilde tanımlanmalarına olanak sağlar. Şimdiye kadar, bu teknik, 16,17 aerobik ve anaerobik koşullar altında 18,19 toprakta biyokimyasal süreçlerde bakteriyel toplulukları tarif etmek için uygulanmıştır. Sindirilmeyen karbonhidrat tepki olarak insan intestinal mikrobiyota farklı filogenetik gruplar metabolik faaliyetleri tarif Reichardt, et al. 5 tarafından bildirilen gibi çevresel biliminde kullanım yanı sıra, teknik tıp bilimlerinde uygulanmıştır.

Burada bağırsakta metabolik olarak aktif bakteri türlerinin DNA 'etiket' için 13 C-glikoz kullanımı. Glukoz durumlar 20 bilinmesine rağmen, yaygın Entner-Doudoroff (ED) yolu boyunca pek çok bakteri türleri tarafından kullanılan bir şekerdir. Builgi metabolitleri ve kurulan yollar boyunca karbon kaynağı arasındaki bir bağlantı sağlayan güvenilir metabolik prob olarak 13 C-glikoz kullanımını haklı. Bilimsel Söz, başka alt-tabakalar, örneğin, 13 C-metan, 13 CO2, ya da bir 13 CO2 atmosferi altında yükseltilmiş bitki bağlı olarak, metabolik faaliyetleri gidermek için kullanılabilir.

Bu noktada, bir genel böcek, yani S. bağırsak bakteri topluluğunun metabolik karakterizasyonunda uygulanan protokol mevcut littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Ayrıca, bu metod da yüksek çözünürlük ve hassasiyet ile böcek bağırsağı bakteri topluluğunun belirlenmesini sağlar, piro sıralamadır, bağlanmıştır. Ana tabaka olarak, 13 C-etiketli glikoz deneylerde kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Böcek Yetiştirme

  1. Satın alma veya spodoptera yumurta clutches elde kendi Yetiştiricilikten littoralis'e. Kuluçka kadar oda sıcaklığında (RT) steril Petri tabaklarında bunları muhafaza edin.
  2. Aşağıdaki gibi yetiştirme böcekler için yapay bir diyet hazırlayın:
    1. 100 ml su gecede 500 g öğütülmüş beyaz fasulye bekletin.
    2. H 2 O damıtılmış 1.000 ml 9.0 g askorbik asit ve 75 g agar ekleyin ve daha sonra kaynatın.
    3. Karışım soğumaya olsun ve (beyaz mumsu bir katı madde kanşımına) katılaştığı zaman, kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
  3. Aydınlatma 16 saat ve 8 saat karanlık ile uzun gün rejimde temiz plastik bir kutu ve 23-25 ​​° C de, suni diyet üzerinde arka bunları için yeni çıkmış larva aktarın. Larvalar altı larva instars geçmesi kadar her gün yiyecek değiştirin.

Metabolik olarak aktif Gut Bakterilerde DNA 2.. 13 C-etiketleme

  1. Damıtılmış ve iyonu giderilmiş su (GKD 2 O) ile tamamen 13C-etiketli glikoz 186,1 mg çözülür ve SIP deney için suni diyetin 100 g ile iyice karıştırın. Yapay diyet içinde 10 mM'lik bir son 13 C-glikoz konsantrasyonunu sağlamak. Bu S. bağırsakta in situ glikoz konsantrasyonunu taklit Shao et al pamuk bitkileri üzerine littoralis larvası besleme. (teslim).
  2. Transferi 9-15 taze 13 C-glikoz içeren steril plastik Petri (Petri kabı başına bir larva) için yetiştirme kutusundan sağlıklı ikinci dönem larva yapay diyet çivili. Tarif edildiği gibi, kontrol grubuna beslemek için, doğal glükoz (12 C-glukoz), aynı miktarda ihtiva eden yapay bir diyet kullanın.
  3. Kuluçka dönemi (1 gün) sırasında sık sık yapay diyet yenileyin. Adım 1.3 'de olduğu gibi yetiştirme koşulları kullanın.
  4. Daha sonra işleme (DNA ekstraksiyon) için her tedavi dokuz larvaları toplayın. Herüç kişi tarafından teşkil edilir çoğaltmak, muamele başına en az üç suret olun.

3. Böcek Diseksiyon

  1. Temiz ve etanol% 70 (Araçlar = Vannas makas, forseps ve ince tek bıçaklı bisturi) ile işin başında kesme aletleri dezenfekte.
  2. Yumuşak bir forseps ile böcekler al ve damıtılmış su ile yüzeysel olarak kendi yıkayın. Onları uyutmak için en az 30 dakika süreyle buz koyun.
  3. Hala onları öldürmek için 1 saat boyunca 0 ° C'de yer onları anestezi iken. Birkaç dakika için etanol (% 70) onları daldırarak yüzeysel ölü böcekler dezenfekte edin.
  4. PH'ı 7.4 'e ayarlayın, yaklaşık 15 ml 1 x PBS, steril bir Petri kabı (1XPBS = 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4 üzerinde biriken bir hacim içine böcek diseksiyon , otoklav). Tam solut dalmış bütün böcek vücuda sahip emin olunbütün kesme süresi boyunca iyon.
  5. Kafasına başlar ve anüs bitirmek, sağ ve böceğin sol tarafı boyunca deride bir kesi yaparak diseksiyonu başlayın. Tüm cilt, Malpighi tübüllerini ve vücut yağ çıkarın. Bağırsakları açık kesmeden önce taze tampon değiştirin. Bölüm öne-, orta-, ve hindgut de bağırsak gerekli. Dondurucuda saklayın doku (-80 -20 ° C) kadar DNA ekstraksiyon

4. Ekstraksiyon ve DNA amplifikasyon

  1. 1.5 ml steril santrifüj tüpü içerisinde böcek doku koyun ve bir vakum konsantratör cihazında 45 ° C'de tüm örnekleri kurutun. Steril plastik bir havan tokmağı ile kurutuldu, doku ezmek.
  2. Toprak DNA ekstraksiyonu için uygun bir kit kullanılarak genomik DNA ekstrakte edin. Kitin reaksiyon tüpüne kuru doku aktarın ve üretici tarafından belirtildiği gibi talimatları takip edin.
  3. Bir spektrofotometre kullanılarak, son Yıkanarak ayrılan DNA ilk konsantrasyonunu belirleyin.
  4. Verifve 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3) - eubacterial genel primerler 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 5) kullanılarak, bir PCR teşhis tahlili hazırlayarak böcek bağırsaktan mikrobiyal metagenomic DNA ya başarılı bir şekilde uzaklaştırılması. Aşağıdaki gibi PCR reaksiyonu ayarlayın:
    1. 1x tamponu, 1.5 mM MgCI2, 10 mM, dört deoksinükleosit trifosfat (dNTP), 2.5 U Taq DNA Polymerase, her bir primerden 0.5 mM ve şablon olarak ekstre DNA 60 ng ihtiva eden bir 50 ul reaksiyon karışımı ayarlayın.
    2. 30 saniye boyunca 55 ° C 'de 45 saniye, tavlama için 94 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C'de uzatma:; 35 devir ile takip olunan, ilk 3 dakika boyunca 94 ° C' de denatürasyon aşağıdaki gibidir: bir PCR kullanılarak PCR reaksiyonları . 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma adımı kullanın.
    3. Bir% 1 agaroz başarılı PCR amplifikasyon etidyum bromid (EB) ile boyanmış jel (100 1x TAE tampon ml ve 1 ul EB ile leke agaroz 1 g çözülür) elektroforez edin. Th mevduat 5 uljel cebine 6x yükleme boyası + 1ul e PCR ürünü. (1x TAE pH 8'e ayarlamak, 40 mM Tris-Base, 20 mM buzlu asetik asit, 1 mM EDTA =).
    4. Ca için 300 V, 115 mA 1xTAE tamponu kullanılarak jel çalıştırın. Bir elektroforez odası içinde 20 dakika. Bir jel dokümantasyon odasını (bir dijital kamera ve bilgisayara bağlı UV transilluminator'de) kullanarak jel gözlemlemek ve aynı zamanda yüklenen gen işaretleyici ile nihai ürünün boyutunu karşılaştırmak, amplikonlarının doğru boyutu yaklaşık 1.5 kb olmalıdır.
  5. Tercihen, derin dondurucu koşullarda PCR ürünlerini saklamak -80 ° C, kullanıma kadar.

5. DNA Ayırma-CsCl Gradient Ultrasantrifüj

  1. Aşağıdaki gibi ultra-santrifüj için geçişlerini için reaktifler hazırlayın:
    1. Yavaş yavaş GKD 2 O CsCl 603,0 g çözülmesiyle bir 7.163 M sezyum klorür (CsCl) çözeltisi hazırlayın ve 500 ml'lik bir nihai hacme kadar doldurun.
    2. Doğru deüç kere ile üç basamaklı bir bakiye üzerinde 1.0 ml'lik bir şişe tartılarak hazırlanan CsCl çözeltinin yoğunluğunu termine. Bu genellikle 1,88 ve 1,89 g / ml 'den, oda sıcaklığında değişmektedir.
    3. 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA, 1 ml (pH 8) ve son olarak 3.75 g KCl, 50 ml birleştirerek, gradyan tamponu (100 mM Tris, 100 mM KCI, 1 mM EDTA) hazırlanması GKD 2 O. kullanarak 500 ml hacmi (0.22 mikron) filtre bu çözüm ve sterilize otoklav.
  2. DNA Ayırma
    1. Noktası 4.3 'de olduğu gibi muamele edilmiş böceklerin ölçülen bireysel DNA konsantrasyonu, tespit edildikten sonra, birlikte bir tekrarında tekabül eden ve her biri, eşit olarak toplanmış numuneye katkı sağlamak için kendi DNA konsantrasyonu normalize bu böcekler havuz. DNA 500-5,000 ng (yine nihai konsantrasyonunun ölçülmesi) içindeki bir nihai konsantrasyonu, ultra santrifüjleme işlemi 21 için uygundur.
    2. Degrade ortamı kurmak için, sayısal DNA, degrade tampon AN birleştirmekd 4,8, steril bir 15 mL vida kapaklı bir tüp (gradyan orta DNA karışımının üretimi) içinde 6.0 ml 'lik bir hacme kadar karışık birlikte 7,163 M CsCl çözeltisi ilave edildi.
    3. Dikkatli bir şırınga ve iğne kullanılarak (tüp boyun tabanına kadar doldurun) 5.1 ml ultrasantrifüjdeki tüpüne hazırlanmış degrade orta-DNA karışımı yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcıkları pompalama veya oluşturmaktan kaçının. Bir referans gradyan olarak her santrifüj vadede (yerine DNA GKD 2 O kullanarak) en az bir boş degrade içerir.
    4. Gerekli her gradient orta sonra ağırlık 10 mg olan Bakiye tüp çiftleri ilgili bir ultra santrifüj tüpüne dolduruldu. Bir "tüp Topper" ile tüp Seal ve conta sızıntısız tüp ters çevrilerek ve elle orta derecede bir basınç uygulayarak olduğundan emin olun.
    5. Ultra-santrifüj 5.1 ml tüpler ultrasantrifügasyon tutmak için sekiz kuyucuklu bir dike yakın rotor kullanın. Dikkatle rotor kuyuları mühür ve ma göre ultrasantrifüjdeki içine rotor yüknufacturer talimatları. Ultrasantrifügasyon koşulları ayarlayın: falso vakum ile 40 saat çalışma süresi 50.000 (177.000 xg civarında) rpm, sıcaklık 20 ° C, ve Ultrasantrifügasyon de. Frensiz maksimum hızlanma ve yavaşlama seçin.
    6. Tamamlandığında, dikkatlice forseps kullanarak santrifüj rotor tüpleri kaldırmak. Boruların içinde oluşturulan geçişlerini bozmadan bir rafa koyun. Kısa sürede herhangi bir difüzyon en aza indirmek için degrade fraksiyon örnekleri işleyin.
  3. Fraksiyonu tarafından İzopiknik Ayrılmış Gradyanların DNA Alma
    1. Eşit ultrasantrifüjdeki tüp üst deplasman yöntemi oluşturulan geçişlerini ayıran degrade ayırmasına, yürütmek için doğru bir HPLC pompası sistemi kullanın. GKD 2 O 1 L deplasman ile dolu şişe HPLC pompasını (% 100 akış gradyan) bağlayın ve sıkı şırınga iğnesi bir 23 G 1 açık pompa boru takmak. Yeterli b ekleo koyu mavi renk vermek için GKD 2 O mavi boya romophenol. Bu degrade orta ve GKD 2 O. yerinden arasındaki arayüz görüntülenmesini kolaylaştırır
    2. 850 | il / dk 'lık bir akış hızı için pompayı ayarlayın ve mavi renkli GKD 2 O şırınga iğnesi dışarı çıkan tek bir damla kadar sistem dengeye getirin.
    3. Dikkatli bir kıskacı için, bir ultra santrifüj tüpüne düzeltmek ve uzun bir iğne bir şırınga 23 G 1, tüpün alt kısmını delmek. Tüpün üst kısmına pompa boru bağlı iğne sokarak ultra santrifüj tüpüne pompası bağlayın ve doğrudan steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine alttan damlaları toplamak. Yaklaşık 425 fraksiyon başına ul ve degrade başına 12 fraksiyonların toplam tutarında, bir fraksiyon her 30 sn toplayın. Son fraksiyon (fraksiyon 12), genellikle değiştirmesini GKD 2 O içerir ve atılmalıdır unutmayın.
    4. Ayrışımdan sonra banaAdım 5.1.2 'de belirtildiği gibi bir analitik terazi kullanılarak ayrılan tüm kısımların yoğunluğunu ölçünüz.
    5. Birinci DNA düşük miktarda çökeltilmesi için bir taşıyıcı olarak (otoklav GKD 2 O 20 ug / ml) 1 ul glikojen ilave edilerek (425 ul civarında) her fraksiyondan DNA'nın çökeltilmesi. Inversiyon iyice karıştırın.
    6. , Polietilen glikol (PEG) çözeltisi (500 ml toplam hacim polietilen glikol 6000 150 g ve 2 GKD NaCl O 46,8 g çözülür, iki hacim (850 ul) ilave edin. Filtre, sterilize ve otoklav. PEG çözeltisi 30'dur % PEG 6000 ve 1.6 M NaCl) ve on kez ters yüz edilerek tekrar karıştırılır.
    7. (Gerekirse gece boyunca) DNA çökelmesi için en az iki saat boyunca oda sıcaklığında tüpler bırakın.
    8. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin çökeltilerin. Bir görünür pelet oluşturmalıdır.
    9. Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve% 70 etanol 500 ul pelet yıkayın. Aynı altında santrifüjTekrar 10 dakika boyunca koşulları.
    10. Süpernatantı dikkatlice atmak ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında pelet hava-kurutun.
    11. GKD 2 O 30 ul kurumuş DNA pelet içinde yeniden çözülür ve tüp hafifçe vurarak karıştırın. Adım 4.3 mağazası -20 ya da -80 ° C altında örnekler, uzun süreli depolama gerekli olduğu takdirde de her degrade fraksiyonunda DNA ölçmek.

6. Piro sıralamadır DNA Karakterizasyon

  1. 13C-etiketli DNA yaklaşık 1,720-1,735 g / ml 'lik bir yoğunluğa sahip iken, etiketlenmemiş doğal (12 C) DNA, 1,705 g / ml' den 1,720 g / ml yoğunluk aralığı kaplar emin olun. Yerli ve çevresel numunelerden ekstre 13C-etiketli DNA hem de çeşitli gradyan fraksiyonları yayılabilir unutmayın. Işık DNA fraksiyonları ve 9-11 fraksiyonları 4-6 ile ilişkili olduğu için, ağır DNA ile ilişkili bekliyoruz.
  2. Tek bir "derlenmiş" temsili kesir ac yaratmak için kilit kesirler birleştirinyoğunluk çözümlü DNA'nın spesifik piklerin tahsise Cording. Alternatif olarak, bu gradyan jel elektroforez (DGGE) gibi denatüre 23, izotop oranı kütle spektrometrisi (IRMS) 22 ya da bir parmak izi yöntemi kullanarak ayrılan fraksiyonların incelemek için diğer vasıtalar, sıralamadan önce uygun fraksiyonlar seçmek için yardımcı olabilir.
  3. Her bir gradyan derlenmiş, ağır, orta ve hafif fraksiyonlardan PCR amplifiye bakteriyel 16S rRNA gen, piro sıralamadır yapın. SIP, bu yöntem, soy tanımlanmasını ve metabolik olarak aktif bakteri türlerinin nispi bolluk kullanılması mümkündür örnekleri inkübe edildi. Aşağıdaki gibi piro gerçekleştirin:
    1. Titanyum reaktifleri ile bir Roche 454 FLX enstrüman kullanarak Amplikon piro gerçekleştirin.
    2. Th ile genişletilmiş 24,25 - (- GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3 5) ve Gray519r (GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5) Gray28F belirlenen füzyon primer kullanılarak birleştirilmek üzere barkodlu amplikonları hazırlayıne ilgili astar Adaptörü A / B ve örnek özgü multipleks tanımlayıcıları (MID).
    3. Dizileme kütüphanesi oluşturmak için, bir sıcak başlangıç ​​Taq polimeraz kullanılarak, 30 çevrim ile tek aşamalı bir PCR uygulanır.
    4. Satıcılar protokolüne dayalı amplikonları sekansı, ve tarif edildiği gibi, ileri yönde (Gray28F) okur uzanır http://www.researchandtesting.com/ .

7. Piro sıralamadır Veri Analizi

  1. Ham dizisi "mikrobiyal ekoloji içine nicel anlayışlar", QIIME yazılım boru hattı 26 ile 454 piro tarafından oluşturulan okur analiz. Aşağıdaki gibi işleme uygulayın:
    1. Başlangıçta, process_sff.py komut ile FAŞTA, qual ve Flowgram dosyaları 454-makine-oluşturulan sff dosyasını dönüştürmek.
    2. (Check_id_map.py göre) eşleme dosyasını doğrulamak ve çoğaltılmış biyolojik sam okur atamakples split_libraries.py komut ile. Düşük kaliteli 50 sürgülü pencere boyutu ve 25 ortalama bir kalite kesim parametresi ile biter Trim, veri kümesi kısa belirsiz dizileri (uzunluk <200 bp) de ortadan kaldırır.
    3. Denoise_wrapper.py kullanarak 454 veri denoise.
    4. Sonra, birden OTU toplama yöntemi (pick_otus.py% 97 sekans benzerliği cut-off ile) kullanılarak yüksek kaliteli işletme taksonomik birimler (otus) içine okur küme.
    5. Pick_rep_set.py kullanarak her OTU bir temsilci dizisini seçin.
    6. Assign_taxonomy.py dayalı temsili dizi setine taksonomisini atamak. 0.80 ayarlamak rekor atama için en az güven ile Ribosomal Veritabanı Projesi (RDP) sınıflandırıcı kullanın.
    7. Algoritması PyNast (align_seqs.py kullanarak Önceden hizalanmış greengenes çekirdek 16S dizilere karşı set temsilcisi dizisini hizalayın75 için minimum sekans özdeşliği yüzde dizi).
    8. Ayrıca, identify_chimeric_seqs.py çalıştırarak fazla analiz kuruntulardan tüketmek.
    9. Önce bir filogenetik ağaç (make_phylogeny.py) bina lanemask şablonu (filter_alignment.py) ile (filogenetik çıkarım için yararlı değil) bütün boşluk pozisyonları çıkarın.
    10. Son olarak, her bir numune içinde bakteri Şlotip oluşumunu anlatan, make_otu_table.py ile OTU tabloları oluşturmak. Bakteriyel bolluk ve aktivitesini karşılaştırmak için ısı haritası oluşturmak için OTU tabloyu kullanın.
    11. Gerekirse, sırasıyla örnekler içinde ve arasında alfa ve beta çeşitliliği hesaplamak. Aynı şekilde, seyrelme eğrileri (dizileme derinliği karşı çeşitliliğin grafikleri) ve mikrobiyal topluluklar arasında ilişkileri temsil Principal Koordinat Analizi (PCoA) araziler de hazırlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Böcek bağırsağında bulunan metabolik olarak aktif bakteri, yeterli etiketleme elde etmek için, bir böcek, bir etiketlenmemiş hafif kolayca etiketli ağır fraksiyonunun ayrılmasını sağlamak için yeterli bir süre için, daha önce optimize 13 C açısından zengin bir alt tabakaya açık olmalıdır. Bizim durumumuzda, 13C-glükoz 1 gün (Şekil 1A) boyunca 10 mM'lik bir son konsantrasyonda suni diyet takviye edilmiştir. Normal glikoz (Şekil 1 B) aynı miktarda kontrol böceklerin suni diyet temin edilmiştir. Daha önce belirtildiği gibi, (hafif daha ağır), DNA fraksiyonların ayrılması tüm sürecin temelidir. Bu nedenle, ifa edilecek olan bir ilk adım, ilgi konusu doku DNA çekilmesidir, bu durumda, bakteriyel topluluk böcek gut ile ilişkili. Kalitesini onaylamak için her herhangi bir DNA Analy elde edildi olmadığını belirlemek için bir elektroforez jel çalıştırmak için önemlidirzed doku. Şekil 1C, bu olumlu DNA çıkarma teyit görüntünün üst genomik DNA güçlü bant gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, bakteriyel DNA (Şekil 1D) varlığını belirlemek için, bakteri evrensel primerler kullanılarak, bir teşhis PCR yapmak için gereklidir. Bu olumlu sonuç, daha ekstre metagenomic DNA'nın ayrılması ile devam ederseniz karar vermek önemlidir.

Her bir ayrılmış fraksiyonunda DNA'nın miktarı teyit edilir ve yoğunluk ölçümü yapılır kez Ultrasantrifüje edildikten sonra, normal olarak kapsayan tüpler içinde düzgün bir gradyan oluşumunu doğrulamak için g / ml fraksiyon sayısı üzerinden ortalama bir parça çizmek yoğunluğu 1,690 den g / ml (fraksiyon 12 veya 11) için 1,760 g / ml yoğunluk aralığı (Fraksiyon 1). Kantitatif piro tür soy ortaya temsilcisi SIP geçişlerini doğrudan yapılır ve göreceli bolluk (Şekil 2 edilir 13 C-glikoz değiştirilmiş örnek ve toplum içinde aktif nüfusa profil için hizmet etiketsiz kontrolü, hem ağır fraksiyonları sıralandı. Dizilemesi sonra, 120.045, yüksek kaliteli bir toplam 404 nükleotidlik bir ortalama uzunluğu ile oluşturulan okur. Piro sıralamadır profili etiketlenmiş numunede Enterococcus ve Pantoea kontrol grubuna (12 C kontrol DNA, Şekil 3) ile karşılaştırıldığında (13C-etiketli DNA, Şekil 3) de dahil olmak üzere bazı türlerin artan bir bolluk göstermektedir. Bu nedenle o bakterilerin metabolik aktif olarak kabul ve liyakat fazla çalışma vardır.

Şekil 1
Şekil 1. 13C-glükoz besleme deneyi, DNA izolasyonu ve bakteriyel 16S rRNA gen PCR amplifikasyonu e. (A) 13 C-glikoz spodoptera tarafından tüketilen yapay diyet larvaları littoralis'e değiştirilmiştir. (B) Yerli glukoz (12 C-glikoz) kontrol olarak hizmet veren (A) kullanılan böceklerin aynı partiden, larva tarafından tüketilen yapay diyet değiştirilmiştir 13C-glükoz tedavi grubunda ve 12 C-glikoz, kontrol grubunda larvalarının bağırsak dokusundan. (C) tipik metagenomic DNA özütü. Üç replika biyolojik (yol 1, 2 ve 3) her bir grup dahil edilmiştir. M 1 kb DNA işaretleyici anlamına gelir. (D) PCR amplifikasyonu, evrensel bir bakteri primer kümesi şablon olarak ekstre metagenomic DNA kullanarak doğru 1.5 kb 16S rRNA gen ürünlerini oluşturur ile. Geçitler 1 PCR pozitif kontrol. Şerit 2 ve 3, sırasıyla, C-13 ile muamele edilen numune glikoz ve 12 C-glikoz kontrolü temsil eder. jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. Ayrılmış DNA piro ile CsCI yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme ve fraksiyon karakterizasyonu içeren bir Pyro-SIP deney Anahat. H yüksek bolluk, L = düşük bolluk. = büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Bakteriyel çeşitlilik ve yerel glikoz beslenen larvaların (C-12 kontrol DNA) ve 13 C-glukoz beslenen larvaların (13C-etiketli DNA) ağır fraksiyonlar içinde, nispi bolluktur./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Çoğu böceklerin bağırsak zengin ve karmaşık bir mikrobiyal topluluğu barındırır; genellikle 10 7 -10 9 prokaryotik hücrelerin çoğu durumda konağın kendi hücrelerini outnumbering, orada Köşkü. Böylece, böcek bağırsak karşılıkçılığını 27 yükümlülük altına patogenezden mikrobiyal ilişkilerin birden yönlerini temsil eden çeşitli mikrobiyal faaliyetler için bir "sıcak nokta", olduğunu. Birçok çalışma böcek bağırsak mikrobiyal toplulukların şaşırtıcı bir çeşitlilik, tarif olmasına rağmen gut mikrobiyotasının metabolik aktivitesinin karakterizasyonu nadirdir. Kararlı izotop sondalama yaklaşımlar ekimi bağımsız ve hatta in vivo bir kompleks Mikrobiyota kökenli aktif üyeleri ayırt için bir imkanı sunuyoruz. Biz böcek model sistemi, pamuk yaprak kurduna (Spodoptera littoralis) olarak bağırsak mikrobiyotasını incelemek için bu değerli aracı uygulanmıştır. Glikoz pamuk yaprak kurdu bağırsağında baskın şeker olduğu için, bu gösteri biz lar beslenenyapay bir diyet ile VAE bağırsak florasında metabolik olarak aktif bakteri izlemek için 13 C-glikoz ilave fakat fizyolojik bir doz ile tutturuldu. Doğal glükoz ile kurulan özdeş bir inkübasyon nükleik asidin herhangi bir açık etiketleme gibi ayırma katkıda DNA yüksek G+ C içeriğine yönteme kendisinin bir dışlayıcı değil, olmasını sağlamak için daha sonra karşılaştırma için önemli bir kontrol sağlamıştır. Glükoz in situ konsantrasyon yakın ek deneysel sapma azalır. DNA-SIP çalışma sıkı bir deneysel kurulum ilişkin diğer hususlar başka 28,29 tartışılmıştır. Bağırsak bakterileri normal metabolik son derece aktif ve en karasal ve sucul ortamlarda mikroorganizmaların kıyasla kısa nesil zaman var. Sürekli besleme Böylece 24 saat zaten önemli bir etiketleme neden oldu. Ev sahibi genomik DNA'nın büyük bir miktarı da içine almak gerekir bağırsak dokuları, ikinci coextracted olduğu notdikkate sonuçlarını tartışırken.

Tipik degrade fraksiyonu karakterizasyonu tür terminal kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmi (T-RFLP) gibi düşük çözünürlüklü parmak izi yöntemleri, dayanır ve veri bağlantı zaman alıcı klon kütüphane yapım. Bu yüksek verimli ikinci nesil dizileme tekniği gelişiyle kompleks mikrobiyal toplulukların hızlı, düşük maliyetli ve detaylı analiz için izin ancak son zamanlarda. Burada doğrudan yoğunluk gradyan fraksiyonların genetik bileşimini anket ve jel elektroforezi-tabanlı yöntemler ile karşılaştırıldığında artmış duyarlılığı verdi metabolik olarak aktif bakterileri tanımlamak için bu yeni teknolojiyi uygulamalı ve sonraki phylogenic sınıflandırma kolaylaştırdı. 13 C-etiketli ve 12 C-kontrol örneklerinde hem de eşdeğer ağır fraksiyonları karşılaştırarak, Pantoea ve Enterococcus sondalama izotop üzerine etiketli oldu bulmak. Bir kez Metabolically aktif bakteri tespit edilmiştir, bu spesifik problar ve etiketlenmiş DNA metagenomic analizi aktif Topluluğu elemanından geri kullanılarak in situ hibridizasyon floresan (FISH) gibi diğer analiz ev sahibi ile ilgili gerçek simbiont kapsamlı bir anlayış temin etmek üzere yapılabilir . Burada kurulmuş sistemine bağlı olarak, diğer 13-işaretli karbon kaynakları da konakçı sindirim sürecinde yer alan aktif bakteri tespit etmek selüloz etiketleme, örneğin, hedeflenen bağırsak metabolik sentez yoluna katılan bakteri incelemek için bir ev sahibinin içine beslenebilir. Bu tür yeni yaklaşımların geliştirilmesi ile, böcek bağırsağı Mikrobiyota rolü halen daha fazla belirgin hale gelecektir.

Toplu olarak, burada açıklanan protokol daha bakterileri spesifik etkisini değerlendirmek için uygulanabilir gut Mikrobiyota, metabolik faaliyetleri belirlemek için bir basit, hızlı ve etkili bir yöntem temsil ederkonak beslenme, detoks ve savunma riyali bütünleşiğizdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz laboratuvar yardım için Angelika Berg teşekkür ederim. Bu çalışma Max Planck Derneği ve Mikrobiyal İletişim (JSMC) için Jena Okulu tarafından desteklenen ve finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Mirror Finish Forceps Fine Science Tools 11251-23  
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00  
Speed Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Germany 5305 000.304  
Plastic pestle Carl Roth GmbH Co. Germany P986.1  
NanoVue spectrophotometer GE HealthCare, UK 28-9569-58  
Mastercycler pro/thermocycler Eppendorf Germany 6321 000.515  
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber Biometra Discontinued  
Ultracentrifuge (Optima L-90K) Beckman A20684  
Ultracentrifuge rotor (NVT 90) Beckman 362752  
HPLC pump Agilent 1100  
Quick-Seal, Polyallomer tube Beckman 342412  
Transilluminator UVstar 15  Biometra  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
  2. Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
  3. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
  4. Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
  5. Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
  6. Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
  7. Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
  8. Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
  9. Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
  10. Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
  11. Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
  12. Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
  13. Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
  14. Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
  15. Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
  16. Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
  17. Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
  18. Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
  19. Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
  20. Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
  21. Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
  22. Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
  23. Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
  24. Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
  25. Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
  26. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
  27. Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
  28. Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
  29. Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).

Tags

Mikrobiyoloji Sayı 81 Böcekler Dizi Analizi Genetik Mikrobiyal Bakteri Pulkanatlılar, Pyro-sıralama (SIP) kararlı izotop-tarama gut Mikrobiyota bakteri
Kültürlü ve Gut metabolik Aktif Bakterilerin Tanımlanması<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; DNA Kararlı İzotop yoluyla kullanma Probing<sup&gt; 13</sup&gt; C = Glukoz
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M.,… More

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M., Boland, W. Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose. J. Vis. Exp. (81), e50734, doi:10.3791/50734 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter