Summary
البشرة الجنينية من الأجنة مرحلة متأخرة جدا ذبابة الفاكهة يوفر نظام في الجسم الحي لتحليل استجابة ثقب الجرح سريعا ويمكن دمجها مع التلاعب الجيني أو علاجات حقن مكروي الكيميائية للمضي قدما دراسات في التئام الجروح للترجمة في نماذج الثدييات.
Abstract
الجنين ذبابة الفاكهة يطور طبقة البشرة قوية يخدم على حد سواء لحماية الخلايا الداخلية من البيئة الخارجية القاسية وكذلك للحفاظ على التوازن الخلوية. إصابة ثقب الإبر مع الزجاج يوفر طريقة مباشرة لتحريك البشرة الجرح الاستجابة السريعة التي ينشط الجرح صحفيين النسخي، والتي يمكن أن تصور من قبل إشارة مراسل المترجمة في الأجنة الحية أو اليرقات. كما يوفر ثقب أو الليزر إصابة الإشارات التي تشجع على توظيف hemocytes إلى موقع الجرح. من المستغرب، شديدة (من خلال وعبر) إصابة الأجنة ثقب في مرحلة متأخرة إلا نادرا يعطل التطور الجنيني الطبيعي، وأكثر من 90٪ من هذه الأجنة الجرحى البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة البلوغ عندما يتم حقن الأجنة في المتوسط للنفط التي تقلل من تسرب الفوري لالدملمف من مواقع ثقب . الإجراء الجرح لا تتطلب المجهرية للأجنة ذبابة الفاكهة، بما في ذلك المواءمة دليل للأجنة على آغلوحات ع ونقل الأجنة إلى محاذاة المجهر الشرائح. يوفر استجابة ذبابة الفاكهة البشرة الجرح فحص نظام سريع لاختبار متطلبات الوراثية من مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية التي تعزز التئام الجروح، وكذلك وسيلة للكشف عن المركبات الكيميائية المحتملة التي تعزز التئام الجروح. دورة حياة قصيرة وسهلة زراعة الروتينية جعل ذبابة الفاكهة نموذج كائن قوية. يبدو ذبابة الفاكهة نظيفة التئام الجروح لتنسيق استجابة التجدد البشرة، مع الاستجابة المناعية الفطرية، في الطرق التي لا تزال قيد التحقيق، والذي يوفر نظام ممتاز للعثور على الحفظ التنظيمية آليات مشتركة لذبابة الفاكهة والثدييات البشرة جرح.
Introduction
التلاعب في الأجنة ذبابة الفاكهة باستخدام تقنية حقن مكروي هو مقايسة راسخة 1. أهمية أسلوب مراسل استجابة البشرة الجرح هو الجمع بين بروتوكول للثقب / حقن مكروي مع صحفيين الفلورسنت وتصور استجابة في الجسم الحي لإصابات البشرة في أجنة ذبابة الفاكهة. الهدف من هذا الأسلوب هو تمكين مجموعة أوسع من العلماء لاستخدام ذبابة الفاكهة كأداة للتحقيق في العمليات التي تنظم استجابة النسخي لإصابات البشرة ثقب. البشرة احدة الطبقات في ذبابة الفاكهة يوفر نظام بسيط لدراسة استجابة البشرة الجرح بعد إصابة ثقب 2. الجنين ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي قوية لتشريح وراثيا مراحل إصلاح الجرح، بما في ذلك الاستجابة الجرح، والالتهابات، وعودة التظهرن 3. هذا هو في جزء منه لأن العديد أو معظم لاقحي المسوخ البقاء على قيد الحياة حتى نهاية embryogenesهو وتطوير الحواجز البشرة حتى عندما يذهب الزخرفة التنموية منحرف عميقا. توصيف سابق من حفظها جيدا عامل النسخ رئيس محبب (GRH)، حدد أن الجينات المستهدفة GRH دوبا كربوكسيل (DDC) وهيدروكسيلاز التيروزين (التنوير القائل) يتم تنشيط transcriptionally حول مواقع الإصابة 4. ذبابة الفاكهة باعتباره النموذج الحي للاستجابة الجرح يوفر خط التكميلية التحقيق للمضي قدما في دراسات الثدييات التئام الجروح 5. وقد حددت الدراسات اللاحقة ذبابة الفاكهة جينات إضافية الناجم عن الجرح ووضع "أدوات" للعديد من الصحفيين الجرح الفلورسنت لرصد المجراة البشرة استجابة لتنظيف الجرح جرح 6. وقد ركزت التقارير الأخيرة بشأن تنظيم شفاء الجرح ذبابة الفاكهة على النمط الظاهري إغلاق الجرح، مما يسمح باكتشاف العديد من مسارات تنظيم الهجرة الخلية 7،8. مع تحليلالجرح صحفيين الفلورسنت، وقد حددت الدراسات لدينا مجموعة جديدة من الجينات المطلوبة للتعبير المترجمة من البشرة الجرح محرض الجينات 9. واحدة من مزايا أسلوب مراسل استجابة الجرح هو أن النتائج تقدم المزيد من التبصر في آلية لكيفية transduced إشارات من موقع الإصابة إلى الخلايا المجاورة. ومع ذلك، واحدة من عيوب أسلوب مراسل استجابة الجرح هو أن النتائج لا تصل مباشرة إلى الظواهر في التئام الجروح أو إصلاح. وتوسيع نطاق الاستفادة من بروتوكول الجرح ثقب نظيفة في شاشات الوراثية والكيميائية سماح المنظمين جديدة للاستجابة النسخي إلى البشرة مما أسفر عن إصابة الكشف عن هويته، وتعزيز التئام الجروح ترجمة الاكتشافات في نماذج الثدييات من العلاجات الاصابة.
Protocol
بروتوكول الجرح الجنينية ذبابة الفاكهة يمكن تلخيصها في خمس خطوات: (1) جمع الأجنة، (2) إعداد الأجنة (3) إصابة الأجنة، (4) حقن مكروي الأجنة، و (5) تثبيت الأجنة.
1. الجنين كوكتيل
- جمع الذباب الكبار، بعد 2-3 أيام eclosing، إضافة 50 إناث و 25 ذكور إلى قفص جمع الأجنة.
- وضع عصير التفاح الطازج بالإضافة إلى لوحة أجار الخميرة كل صباح لمدة 3 أيام.
ملاحظات: لجمع الجنين الأمثل، ودورة الذباب على جدول زمني يومي 12 ساعة في حاضنة 25 ° C (05:00 أضواء "ON" و 17:00 أضواء "OFF")؛ الذباب الإناث الاستجابة للتغيرات في دورة الضوء و ستودع كميات أكبر من البيض خلال التحول من أضواء "ON" إلى أضواء "OFF" 10،11. - في فترة ما بعد الظهر من يوم 3، ووضع عصير التفاح الطازج بالإضافة إلى الخميرة وحة آغار على القفص وجمع الأجنة لمدة 2 ساعة. وضع لوحة جديدة على الخميرة القفص وحفظ2 لوحة جمع ساعة.
- تخزين لوحة لجمع 14 ساعة إضافية عند 25 درجة مئوية إلى سن الأجنة.
ملاحظات: يمكن أن يعاير التئام الجروح في أي مرحلة خلال تطوير ذبابة الفاكهة، وصحفيين الناجم عن الجرح النسخي وصفها في هذه الورقة لها النشاط الأمثل بين المراحل 15-16 ديسمبر. في أواخر المرحلة 17، والجنين هو قديم جدا لاختراق بسهولة بشرة الناضجة وتفعيل كفاءة صحفيين الجرح أو الجرح الناجم عن الكشف عن النسخ. لإتاحة الوقت لجمع وجرح الوقت أن يحدث خلال ساعات الذروة المختبر، ونحن نتابع جدولا زمنيا لجمع الأجنة لمدة 2 ساعة (16:00 حتي 18:00)، تبادل لوحة جمع مع لوحة جديدة في الساعة 18:00، والعمر لوحة جمع عند 25 درجة مئوية لمدة 14 ساعة (بين عشية وضحاها)، والجرح الأجنة في الساعة 08:00 (اليوم التالي).
2. إعداد الجنين
ملاحظات: يتضمن هذا البروتوكول استخدام العديد من الأدوات والأشياء التي هي حادة أو مصنوعة من زمعشوقة. التعامل مع جميع الأدوات الحادة والأجسام الزجاج مع الحرص على تجنب الإصابة الشخصية.
- بلطف إزالة الأجنة من لوحات مجموعة مع الفرشاة وذلك بإضافة 2-3 مل من الماء لوحة ودوامات. نقل المياه والأجنة من لوحة لشبكة النايلون وأنبوب جمع.
- إضافة 4-5 مل من المبيض إلى غطاء من البلاستيك بيتري لوحة طبق ونقع في تغطية شبكة نهاية الأنبوب الذي يحتوي على جمع الأجنة في التبييض لمدة 2 دقيقة؛ الذي يزيل قشر البيض الخارجي للجنين. تدوير يدويا أنبوب جمع بضع مرات لمنع الأجنة من التثاقل في التبييض. شطف الأجنة مع 10x المياه وتجفيف شبكة تغطية جمع الأنبوب الذي يحتوي على أجنة dechorionated على منشفة ورقية.
- استخدام إبرة تشريح لنقل الأجنة ~ 50 من النايلون شبكة لوحة آغار. نضيف الأخضر تلوين الطعام على لوحة أجار لإضافة التباين والمساعدات في محاذاة الجنين. تحت المجهر تشريح، وجعل اثنين من صفوف متوازية من 25 ~ الأجنة، محاذاة امبريالسراج على الشريحة بحيث أنها سوف تكون في زوايا الحق في ثقب الإبرة على جهاز microinjection. ترك القليل من الفضاء (حوالي 1 طول الجنين) بين الأجنة لأغراض تبادل الغازات. يجب أن تكون صفوف متوازية اثنين حوالي 5 ملم وبصرف النظر.
- وضع الشريحة مع ضعف العصا الشريط على رأس الأجنة الانحياز والضغط بعناية الشريحة لنقل الأجنة من لوحة خضراء إلى الشريحة. ثم الهواء الجاف الأجنة ~ 25 دقيقة لتخفيف الضغط الداخلي على الجنين ومنع حدوث انفجار عند اصابة.
- وضع 2-3 قطرات من مزيج النفط الهالوكربون على الأجنة لمنع مزيد من الجفاف.
3. إصابة الجنين
- وضع الشريحة الجنين في مرحلة المجهر الحقن. العثور على الأجنة في مجال الرؤية والممارسة تتحرك مرحلة مجهر مقلوب.
ملاحظات: قبل أن تبدأ العمل مع الإبرة، والتركيز على الطائرة منتصف الجنين على طول محور ظهري بطني. للسماح للجرح الفعال للالأجنة الانحياز، تبدأ اصابة الصف أقرب إلى جهاز الإبرة. نقل المرحلة لتحقيق أعلى صف من الأجنة الانحياز في مجال الرؤية. - وضع بعناية وتأمين إبرة سحبت في حامل الإبرة. استخدام مياداة مجهرية لتحريك الإبرة إلى أسفل نحو الشريحة. محاذاة الإبرة مع الجنين، في نفس المستوى البؤري. مرة واحدة على الإبرة في التركيز مع الجنين، لا تتحرك الإبرة مع مياداة مجهرية.
- نقل المرحلة ثقب الجنين من خلال وعبر، ثم الانتقال إلى الجنين القادم في الصف. عندما تنتهي من ذلك اصابة الصف الأول، استخدم مياداة مجهرية لتحريك الإبرة تماما وحتى بعيدا من مرحلة قبل الانتقال الشريحة؛ تدوير يدويا الشريحة 180 درجة والجرح الصف الثاني.
- تخزين الأجنة تحت الهالوكربون النفط في درجة حرارة الغرفة والمضي قدما في تثبيت الجنين إذا به الموقع التهجين أو تلوين الأجسام المضادة في (راجع الخطوة الإجرائية 5). بدلا من ذلك، تخزين الأجنة لمدة 4-6 ساعةتحت الهالوكربون النفط والمضي قدما الجرح النسخي التصور مراسل الفلورسنت (ممثل النتائج).
ملاحظات: للحصول على تصور لمراسل الفلورسنت، ونحن تخدير الأجنة باستخدام 50٪ 1-فينوكسي-2-بروبانول 13. تتم إزالة الأجنة من النفط الهالوكربون ووضعها على شريحة جديدة. نضع الخرز الزجاجي حول الأجنة، إضافة بضع قطرات من مخدر، ووضع زلة تغطية على الأجنة.
4. الجنين حقن مكروي
ملاحظات: لم يتم الآلي وجهاز microinjection التي نستخدمها في البروتوكول لتسليم حجم محددة خلال الفحص. نضيف صبغة إلى حل لتصور حقن مكروي ومحاولة تطبيع حجم تسليمها. إذا تم حقن الكثير الحل في الجنين، والغشاء المحي تنفجر.
- تحميل الإبرة من الخلف مع 1 ميكرولتر من المحلول الكيميائي بالإضافة إلى صبغ (على سبيل المثال 0.6 MH 2 O 2). تسمح الشعريةعمل لرسم الحل الكيميائية إلى رأس الإبرة.
- لكسر إبرة، ضع الغطاء زلة في زاوية على شريحة ومعطف حافة مع مزيج النفط الهالوكربون. إحضار إبرة شنت في التركيز مع حافة الغطاء زلة الزاوية وبلطف نقل زلة تغطية حافة عبر غيض من الإبرة حتى كسر. الضغط على جهاز microinjection وتحقق من أن الحل الكيميائية بالإضافة إلى صبغ يتدفق من الإبرة.
- ضع الشريحة التي تحتوي على أجنة الانحياز على المسرح المجهر. المضي قدما في التركيز على الجنين والإبرة في نفس الطائرة. ثقب في وقت واحد والحل microinject الكيميائية بالإضافة إلى صبغ في كل الجنين.
ملاحظات: الإبر انسداد تحدث بشكل متكرر؛ كسر إبرة جديدة لتجنب حقن مكروي غير مكتملة. لا الجرح وهناك معلومات إبرة حادة كما نظيفة باعتبارها طرف الإبرة الزاوية. ضبط ساترة لغير زاوية 90 درجة خلال الكسر هو الأمثل لإنتاج طرف الإبرة الزاوية.
5. الفورمالديهايد فايxation
ويلاحظ: إن المواد الكيميائية المستخدمة في هذا التثبيت ذبابة الفاكهة الضارة. استخدام معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات، معطف المختبر، ونظارات السلامة) عند التعامل مع المواد الكيميائية. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية الفردية للتخلص من المواد الكيميائية الخاضعة للتنظيم.
- بعد جرح، انتظر 15، 30، 60، دقائق أو أكثر لتفعيل النسخي من الجينات التي يسببها الجرح تحدث. لإزالة الأجنة من حقن الشرائح، واستنزاف بعناية مزيج النفط الهالوكربون من الشرائح، تتكئ الشريحة ضد رف وصمة عار النهاية مع Kimwipe.
- استخدام ماصة الزجاج لشطف هيبتان على الشريحة وغسل السائل شطف إلى طبق بتري الزجاج. سوف هيبتان حل الشريط وإطلاق سراح الأجنة. تواصل شطف حتى يتم إزالة جميع الأجنة من الشريحة. انتقل إلى الشريحة التالية، حتى يتم إزالة جميع الأجنة من الشرائح.
- نقل هيبتان بالإضافة إلى حل الجنين من الطبق الزجاجي إلى الخيال العلمي 20 ملntillation القارورة. هز القارورة لمدة 2-3 دقيقة، وإزالة هيبتان وإضافة 5 مل من هيبتان الطازجة.
- إضافة 5 مل من الطازجة، والحل تثبيت (انظر قائمة الكواشف لصفة). قبعة القارورة ونعلق على منصة شاكر المداري. هز قارورة تحتوي على أجنة لمدة 25 دقيقة في 220-230 دورة في الدقيقة.
- بعد الهز، والسماح للفقاعات في واجهة البوب. تماما إزالة، المرحلة المائية أسفل مع ماصة، وتجنب سحب ما يصل الأجنة. تتكون الطبقة السفلية من الحل التثبيت وينبغي التخلص منها بشكل سليم.
- إضافة 5 مل من الميثانول، وكأب القارورة ويهز بقوة باليد لمدة 20-30 ثانية، دوامة ووضعه على مقاعد البدلاء. سوف الأجنة الجرحى البقاء في البيني ولن تنزل الى القاع.
ملاحظات: بعد التثبيت سوف تنفجر الغشاء المحي من الجنين المعافين عادة خلال الخطوة الجفاف مع الميثانول. ومع ذلك، هو كسر الغشاء المحي في جنين الجرحى بالفعل وسوف خطوة الجفاف تقم بإزالة MEMB المحيRANE. مطلوب اليد devitellinzation لاستكمال بروتوكول التثبيت. - إزالة بعناية طبقة هيبتان أعلى ثم قم بإضافة 5 مل من الميثانول النقي. هز القارورة ويجب أن الأجنة تغرق.
- إزالة الميثانول بالإضافة إلى حل الجنين مع ماصة نقل الزجاج وجمع في أنبوب جمع شبكة من النايلون في طبق زجاجي.
- إزالة الميثانول وشطف الأجنة مع الحل برنامج تلفزيوني 1X.
- نقل الأجنة من شبكة من النايلون لوحة عصير التفاح. نشر الأجنة على طول سطح اللوحة.
- نقل الأجنة إلى شريحة زجاجية مزدوجة العصا الشريط. تغطية الأجنة مع برنامج تلفزيوني 1X.
ملاحظات: الأجنة تميل إلى أجمة بسبب الغشاء المحي. باستخدام عصير التفاح مكان يسمح لفصل سريع للأجنة تجمعت. يجب إزالة الأجنة من لوحة ونقلها إلى شريحة زجاجية العصا الشريط مزدوجة لأن الأجنة تغوص لوحة آغار عندما يتم تطبيق قوة لإزالة الجنين منالمحي الغشاء. - دفع بعناية الأجنة مع إبرة تشريح ل"البوب" الغشاء المحي. الجنين يجب أن تغرق في برنامج تلفزيوني.
- استخدام ماصة الزجاج لنقل برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى الأجنة إلى أنبوب 1.5 مل. شطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني 1X وتخزينها في 4 درجات مئوية. انتقل إلى يذوى أجنة باستخدام الإيثانول: سلسلة برنامج تلفزيوني وتواصل مع الموقع التهجين أو immunolocalization البروتوكول في 14.
Representative Results
للحصول على النتائج المبينة في هذا الأسلوب، وتنصهر في إطار القراءة المفتوح للبروتين الفلورية الخضراء (GFP) إلى مروج / الجرح الناجم عن تسلسل محسن من دوبا كربوكسيل (DDC) وتنصهر DsRed لتسلسل الجرح محسن من هيدروكسيلاز التيروزين ( التنوير القائل) 4،6. في ذبابة الفاكهة الأجنة الحية، ونضوج البروتين الفلوري مراسل الجرح هو الأمثل 4-6 ساعة بعد اصابة، والذي يسمح الوقت لتراكم البروتين كافية لتصور، وكذلك الوقت المناسب لبروتين فلوري للأكسدة للدولة الفلورسنت 15. لمراقبة توطين مراسل المجهر الفلورسنت مجمع كافية. لمراقبة التكبير أعلى من توطين مراسل المجهر متحد البؤر هو الأمثل لتوليد إسقاط الحد الأقصى من المقاطع البصرية متعددة (الشكل 1). متحد البؤر التصوير في الجسم الحي من أجنة ذبابة الفاكهة تعقيدا هو راالتموجات PID الجنين. . وجهة نظر كاملة من الجنين يمكن الحصول عليها مع 20X الهدف وجهة نظر عن قرب من موقع الجرح ويمكن الحصول عليها مع 40X الهدف. وجهة نظر العلوي من البشرة مراسل الجرح التوطين ولا يمكن تصوير مع 10 أقسام متتالية البصرية 1μm. وجهة نظر الأطراف من البشرة مراسل الجرح التوطين ولا يمكن تصوير مع 40 المتتالية 1 ميكرومتر المقاطع البصرية.
باستخدام أساليب معبر الجينية القياسية، فمن الممكن الجمع بين صحفيين الجرح مع الطفرات الجينية. أحد الأمثلة الواردة في هذه الورقة هو Flotillin-2 (فلو-2)، وذلك لأن كسب من بين وظيفة (ولدت من overexpression مع التعبير في كل مكان في جميع الخلايا) المسوخ الخسارة من وظيفة (أليل فارغة ولدت مع P-عنصر الإدراج) و فلو 2 تدليل على الجين المنتج فلو-2 غير الضرورية والكافية لمنع توطين DDC-GFP الجرح صحفيين 9 (أرقام 2A و 2B). باستخدام ميلبروتوكول croinjection، فمن الممكن لاختبار ما إذا كان إدخال المحاليل الكيميائية superactivates أو يحول دون توطين صحفيين الجرح. تم الأجنة جرح كيميائيا الجرحى في وقت واحد وحقنه مع نسبة 1٪ 01:04 طولويدين صبغة زرقاء والمركبات solubilized. طولويدين صبغة زرقاء يسمح لتأكيد البصرية من المركبات solubilized يجري حقنها في تجويف الجسم. أصيب الأجنة التحكم بإبرة تحتوي على كسر 1:04 نسبة 1٪ طولويدين صبغة زرقاء والمذاب دون الكيميائية. مثالين الواردة في هذه الورقة هي بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) وميثيل β-cyclodextrin (MβCD)، لأن كلا من المحاليل الكيميائية كافية لتنشيط عالميا في توطين DDC-GFP الجرح صحفيين 9 (أرقام 2C و 2D) . تم تخفيفه بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) في H 2 O إلى 0.6 م ميثيل β-cyclodextrin (MβCD) تم solubilized في 1 مM هيدروكسيد الصوديوم إلى 3 ملم. باستخدام بروتوكول الجنين التثبيت، فمن الممكن للكشف عن تفعيل النسخ من الجينات استجابة الجرح في مجال المترجمة، المحيطة موقع الجرح. أحد الأمثلة الواردة في هذه الورقة هو الموقع التهجين تحقيقات الحمض النووي الريبي لفي الكشف عن DDC والنصوص التنوير القائل 4،6،9 (أرقام 3A 3B و).
الشكل 1. DDC-GFP والتنوير القائل-DsRed الجرح مراسل التعريب. Brightfield والصور الفلورسنت في اصابة الأجنة البرية من نوع (أ) عرض للأعلى DDC-GFP مراسل الجرح. (B) عرض للأعلى التنوير القائل-DsRed الجرح المراسل. تم جمع كافة الصور على ايكا المجهر متحد البؤر SP2، مع 20X الهدف. سهام بمناسبة موقع الجرح. الخطوط المتقطعة في لوحة البياناتو بمناسبة الخطوط العريضة للأجنة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. توطين مراسل DDC-GFP الجرح في الخلفيات متحولة الوراثية والكيميائية microinjected الأجنة. Brightfield والصور الفلورسنت من الجرحى Flotillin-2 (فلو-2) الأجنة متحولة. (A) لتخفيف من وظيفة فلو-2} {KG00210 المسوخ، التوسع في النشاط الصحفي في جميع خلايا البشرة. (B) كسب من بين وظيفة فلو 2 (المدرع-GAL4، UAS-Flo2) المسوخ، وتثبيط النشاط مراسل في جميع خلايا البشرة. (C) بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2 ) حقن مكروي الحل، وتوسيع مندوبORTER النشاط في جميع خلايا البشرة. (D) ميثيل β-cyclodextrin (MβCD) حقن مكروي الحل، والتوسع في النشاط الصحفي في جميع خلايا البشرة. تم جمع كافة الصور على ايكا المجهر متحد البؤر SP2، مع 20X الهدف. سهام بمناسبة موقع الجرح. الخطوط المتقطعة في لوحات البيانات بمناسبة الخطوط العريضة للأجنة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. الكشف عن استجابة الجرح نسخ الرنا الجينات. الصور نيون من الموقع التهجين والكشف عن الحمض النووي الريبي في الأجنة في الجرحى النوع البري. DDC (A) والتنوير القائل (B) نسخ الحمض النووي الريبي تتجمع حول موقع الجرح. وكانت كل الصور جامعيتيد على ايكا المجهر متحد البؤر SP2، مع الهدف 20X. سهام بمناسبة موقع الجرح. الخطوط المتقطعة في لوحات البيانات بمناسبة الخطوط العريضة للأجنة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الجدول 1. ملخص للصحفيين ردا البشرة الجرح. الإدراج من صحفيين ردا الجرح الأربعة (DDC، التنوير القائل، ام اس ان، KKV) متوفرة على كل من الكروموسومات الثانية والثالثة. كل من صحفيين ردا الجرح تنشيط الجين مضان (GFP أو DsRed) في عدد محدود من خلايا البشرة المحيطة بموقع الإصابة ثقب في البرية من نوع الخلفية (مثل النمط الظاهري "المحلي"). DDC وام اس ان الجرح للصحفيين ردا تتطلب GRH ل تفعيل fluorescenم الجين بعد إصابة ثقب (على سبيل المثال "لا شيء" النمط الظاهري). كل من صحفيين الجرح تتطلب فلو-2 لتوطين الجين مضان بعد إصابة ثقب (مثل النمط الظاهري "العالمية"). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Discussion
استجابة فورية لالنسخي التنظيمية العظة الخارجية يسمح الخلايا لتنسيق الاستجابة للمحفزات محلية خارج الخلية، والتي يمكن أن تشمل الإجهاد، والضرر، أو العدوى. سيطرة غير السليم للاستجابة محلية يمكن أن يكون لها آثار ضارة على الخلايا المجاورة، فضلا عن هدر الموارد لإصلاح الضرر. يوفر الجنين ذبابة الفاكهة نظام ممتاز لإجراء تجارب التئام الجروح الأساسية في الحفاظ على لسهلة وغير مكلفة والنموذج الحي. إمكانية التعاون بين البحوث في الكائنات نموذج آخر وذبابة الفاكهة يوفر فرصة فريدة لاستكشاف العديد من الأسئلة البيولوجية.
تقنية إضافية للصحفيين الجرح هو مزيج من الخلفيات الوراثية متحولة، وتوفير وسيلة فعالة لاختبار الجينات مساهمة جديدة لتفعيل المسار استجابة البشرة الجرح. لدينا البشرة الناجم عن الجرح صحفيين النسخي AVailable على كل من الثانية 2 و 3 الكروموزومات الثالثة 5. في هذه الدراسة التي نستخدمها UAS ونظم GAL4 من 16 من overexpression. للدراسات مع الأليلات الطافرة قاتلة نحدد الخلفية الجينية باستخدام كروموسوم موازن الفلورسنت، على سبيل المثال Kruppel-GFP 17. قمنا بتحليل توطين مراسل الجرح في عدة خلفيات وراثية (TABLE1).
وهناك تعديل محتمل للتقنية هو الجمع بين حقن مكروي وجرح. حقن مكروي يمكن استخدامها لتقديم حل الكيميائية إلى الجنين. وقد تم اختبار العديد من المركبات الكيميائية وعثر لتنظيم نشاط للصحفيين البشرة الجرح 9. هذا الأسلوب من جرح وحقن مكروي في وقت واحد يمكن أن يكون مفيدا لزيادة عدد الخلايا في الجنين ذبابة الفاكهة التي تستجيب إشارة الجرح، ويمكن استخدامها مباشرة لرصد التغيرات في التعبير الجيني بعد اصابة 18. وسوف تطبيقها في المستقبل من تقنية حقن مكروي يكون لاختبار المواد الكيميائية الرواية لتنظيم استجابة البشرة الجرح.
ذبابة الفاكهة كنظام نموذج للدراسات الجينية يقدم مجموعة واسعة من بروتوكولات بسيط لمعالجة المسائل المعقدة بكفاءة. التقارير الأخيرة حول جدوى تقنيات ذبابة الفاكهة يسلط الضوء على استخدام الهجرة كرية دموية 19 وإصابة 20 دبور الطفيلية كوسيلة لتوسيع تأثير مجتمع البحوث ذبابة الفاكهة. بالإضافة إلى دراسات إصلاح الجرح، ويوفر ذبابة الفاكهة نموذجا الكلاسيكية للتجديد مع نظام القرص تخيلي 21،22. التقدم جنبا إلى جنب في الدراسات القرص تجديد تخيلي وثقب / حقن مكروي جرح يوفر نظام ممتاز لاكتشاف مكونات حفظها جيدا من إصلاح الأنسجة.
Disclosures
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تطوير هذا البروتوكول بالتعاون مع أعضاء السابقة للمختبر مغينس، كيم A. الصولجان وجوزيف جيم بيرسون. نشكر الجهود المتواصلة من قبل المركز الأسهم ذبابة الفاكهة بلومنجتون لعملهم لتنظيم وتوزيع أسهم القيمة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM077197 وK12 GM68524) وعائلة هربرت شتيرن. معتمد حاليا من قبل MTJ غرانت عدد 5G12RR003060-26 من المركز الوطني للبحوث الموارد والمنح عدد 8G12MD7603-27 من المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني في الأقلية الصحة والصحة التفاوت أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
