Summary
De embryonale epidermis af meget sent Drosophila embryoner giver et in vivo system for hurtig analyse stiksår respons og kan kombineres med genetiske manipulationer eller kemiske mikroinjektion behandlinger til at fremme studier i sårheling til oversættelse til pattedyr modeller.
Abstract
Drosophila foster udvikler en robust epidermal lag, der tjener både til at beskytte de interne celler fra en barsk ydre miljø samt at opretholde cellulær homeostase. Stikskade med glas nåle giver en direkte metode til at udløse en hurtig epidermal viklet reaktion, der aktiverer sår transkriptionelle reportere, der kan visualiseres ved en lokal reporter signal i levende embryoner eller larver. Punktering eller laser skade giver også signaler, der fremmer rekrutteringen af hæmocytter til såret site. Overraskende, svær (igennem) stikskade i embryoer sene kun sjældent forstyrrer normal fosterudvikling, da mere end 90% af disse sårede embryoner overleve til voksenalderen, når embryoner injiceres i en olie medium, der minimerer øjeblikkelig lækage af hæmolymfe fra punktursteder . Såret procedure kræver mikromanipulering af Drosophila embryoner, herunder manuelle tilpasning af embryonerne på agar plader og overdragelse af de justerede embryoner til objektglas. Drosophila-epidermal såret respons assay tilvejebringer et hurtigt system til at teste de genetiske krav til en række biologiske funktioner, der fremmer sårheling, samt en måde at screene for potentielle kemiske forbindelser, der fremmer sårheling. Den korte levetid og nem dyrkning rutine gør Drosophila en kraftfuld model organisme. Drosophila ren sårheling synes at koordinere epidermal regenerative respons, med medfødt immunrespons, på måder, der stadig er under efterforskning, som giver et glimrende system til at finde conserved regulerende mekanismer fælles for Drosophila og pattedyr epidermal såring.
Introduction
Manipulation af Drosophila-embryoner ved et mikroinjektion teknik er en veletableret assay 1. Betydningen af epidermal såret respons reporter metode er at kombinere protokollen for punktering / mikroinjicering med fluorescerende journalister og visualisere et in vivo respons på epidermal skade i Drosophila embryoner. Målet med denne metode er at muliggøre et bredere sæt af forskere til at bruge Drosophila som et redskab til at undersøge de processer, der regulerer transkriptionel respons på epidermal stikskade. De enkelte lag epidermis i Drosophila giver et simpelt system til at studere en epidermal sår reaktion efter en punktering skade 2. The Drosophila embryo er en robust modelsystem til genetisk dissekere stadier af sårheling, herunder sår reaktion, inflammation og reepitelisering 3. Dette er til dels fordi mange eller de fleste zygotiske mutanter overlever til slutningen af embryogeneser og udvikle epidermale barrierer, selv når udviklingsmæssige mønster går dybt skævt. Forrige karakterisering af en velbevaret transskription faktor Kornet hoved (GRH), identificeret som GRH-target gener dopadecarboxylase (DDC) og tyrosinhydroxylase (PLE) transkriptionelt aktiveres omkring de steder i skade 4.. Drosophila som model organisme til sår svar giver en supplerende linje af undersøgelse for at fremme undersøgelser i pattedyr sårheling 5.. Efterfølgende undersøgelser har identificeret yderligere Drosophila sårinduceret gener og udviklet en "værktøjskasse" af mange fluorescerende sår journalister at overvåge in vivo epidermal sår reaktion til at rense såret 6. Nylige rapporter om regulering af Drosophila sårheling har fokuseret på sårlukning fænotype, så opdagelsen af mange veje, der regulerer celle migration 7,8. Med analysen affluorescerende sår reportere, har vores studier identificeret en roman sæt af gener, der kræves for den lokaliserede udtryk for epidermale afviklede inducerbare gener 9. En af fordelene ved såret respons reporter metode er, at resultaterne giver mere indsigt i en mekanisme for, hvordan signaler transduceres fra skadestedet til de omkringliggende celler. Men en skadevirkningen af såret respons reporter metode er, at resultaterne ikke direkte linke til fænotyper i sårheling eller reparation. Bredere anvendelse af den rene sår punktere protokol i genetiske og kemiske skærme vil give nye regulatorer af transkriptionel respons på epidermal såret at blive identificeret og fremme oversættelse af sårheling opdagelser i mammale modeller af skade behandlinger.
Protocol
Drosophila-embryonale sår protokol kan sammenfattes i fem trin: (1) Embryo Collection, (2) Embryo Fremstilling (3) Embryo sårdannelse (4) Embryo mikroinjektion, og (5) Embryo Fiksering.
1.. Embryonindsamlingsteam
- Saml voksne fluer, 2-3 dage efter eclosing, tilsættes 50 hunner og 25 hanner til et embryonindsamlingsteam bur.
- Placer en frisk æble juice agar plus gær plade hver morgen i 3 dage.
Bemærkninger: For optimal embryonindsamlingsteam, cykle fluer på en 12 hr døgnets tidsplan i et 25 ° C inkubator (05:00 lights "On" og 17:00 lys "OFF"), kvindelige fluer reagere på ændringer i lys cyklus og vil deponere større mængder æg i løbet af et skift fra lys "ON" for lys "OFF" 10,11. - Om eftermiddagen Day-3, placere en frisk æble juice plus gær agarplade på buret og indsamle embryoner til 2 timer. Placer en ny gær plade på buret og gemme2 hr opsamlingsplade.
- Opbevar opsamlingspladen i yderligere 14 timer ved 25 ° C til alder embryoner.
Noter: Sårheling kan analyseres på ethvert tidspunkt i løbet af Drosophila udvikling de sårinduceret transcriptionale journalister, der er beskrevet i dette papir har en optimal aktivitet mellem trin 15-16 december. I slutningen af 17. etape, fosteret er for gammel til nemt at gennembore modning neglebånd og effektivt aktivere såret journalister eller opdage sårinduceret transkription. At tillade indsamling tid og såret tid til at ske i løbet af peak lab timer følger vi en tidsplan for embryonindsamlingsteam i 2 timer (16:00 til 18:00), udveksle indsamling plade med en ny plade klokken 18:00, alder indsamling plade ved 25 ° C i 14 timer (natten over), og sår embryoner ved 08:00 (næste dag).
2. Embryo Forberedelse
Bemærkninger: Denne protokol omfatter brugen af mange værktøjer og objekter, der er skarpe eller lavet af glass. Håndter alle skarpe genstande og glas objekter med omhu for at undgå personskade.
- Fjern forsigtigt embryoner fra indsamlingsstederne plader med en pensel ved at tilsætte 2-3 ml vand til bord og hvirvlende. Overfør vand og embryoner fra plade til nylon mesh og indsamling rør.
- Tilføj 4-5 ml blegemiddel til hætten af en plastik petriskål plade og suge masken dækkede ende af samlingen rør, der indeholder embryoner i blegemiddel i 2 min, som fjerner den ydre æggeskallen af embryoet. Manuelt rotere opsamlingsrøret et par gange for at forhindre embryoner fra sammenklumpning i blegemiddel. Skyl embryoner med vand 10x og tør mesh dækket samling rør, der indeholder de dechorionated embryoner på et stykke køkkenrulle.
- Brug en dissekere nål til at overføre ~ 50 embryoner fra nylon mesh til en agarplade. Vi tilføjer grøn frugtfarve til agarpladen at tilføje kontrast og støtte tilpasningen foster. Under et dissektionsmikroskop, lave to parallelle rækker af ~ 25 embryoner, som bringer Embryos på det dias, så de vil være vinkelret på punkturnålen på mikroinjektion apparatet. Efterlad en lille plads (ca. 1 embryo længde) mellem embryoner til gasudveksling formål. De to parallelle rækker skal være ca 5 mm fra hinanden.
- Placer et dias med dobbeltklæbende tape på toppen af de justerede embryoner og forsigtigt trykke dias til at overføre embryoner fra den grønne plade til diaset. Så lufttørre embryoner ~ 25 min til at reducere interne pres på embryo og forhindre en byge når såret.
- Placér 2-3 dråber halogencarbon olie mix i embryoner at forhindre yderligere dehydrering.
3. Embryo Anskydning
- Placer embryo dias i injektion mikroskop scenen. Find embryoner i synsfeltet og praksis flytte den fase af inverteret mikroskop.
Bemærkninger: Før du arbejder med nålen, fokus på midterste plan foster langs dorsoventral akse. For at muliggøre en effektiv såret afafstemt embryoner, begynder sårede rækken tættere til p-apparatet. Flyt scenen for at bringe toppen af rækken af aligned embryoner i synsfeltet. - Anbring forsigtigt og sikre en trak-nål i nåleholderen. Brug mikromanipulator at flytte nålen ned mod dias. Juster nålen med embryonet, i samme fokalplan. Når nålen er i fokus med fosteret, ikke flytte nålen med mikromanipulator.
- Flyt scenen for at punktere embryo og gennem, derefter flytte til den næste foster i rækken. Når du er færdig sårede den første række, skal du bruge mikromanipulator at flytte nålen helt op og væk fra scenen, før du flytter slide, manuelt rotere diaset 180 ° og sårer den anden række.
- Opbevar embryoner under halogencarbon olie ved stuetemperatur og fortsætte med embryo fiksering hvis gør in situ hybridisering eller antistoffarvning (se Procedure trin 5). Alternativt gemme embryoner til 4-6 hrunder halogencarbon olie og fortsætte med sår transkriptionel fluorescerende reporter visualisering (Repræsentative resultater).
Bemærkninger: Til visualisering af fluorescerende reporter, bedøver vi embryoner ved hjælp af 50% 1-phenoxy-2-propanol 13. Embryonerne fjernes fra halocarbon olie og placeres på et nyt dias. Vi lægger glasperler omkring embryoner, tilføje et par dråber af narkose, og placere et dækglas på embryoner.
4.. Embryo Mikroinjektion
Noter: Den mikroinjektion apparat, som vi bruger i protokollen er ikke automatiseret til at levere specifikke volumen under analysen. Vi tilføjer et farvestof til opløsningen for at visualisere mikroinjektion og forsøge at normalisere mængden leveret. Hvis for meget opløsning injiceres i embryonet, vil vitellinmembranen briste.
- Load nålen fra bagsiden med 1 ml af kemisk opløsning plus farvestof (fx 0,6 MH 2 O 2). Tillad kapillærhandling at trække kemisk opløsning til spidsen af nålen.
- At bryde en nål en dækglas i en vinkel på et dias og pels kant med halogencarbon olie mix. Bring monterede nål i fokus med kanten af den vinklede dækglasset og forsigtigt flytte tildækningsslip kant tværs over spidsen af nålen, indtil brudt. Lægge pres på apparatur mikroinjektion og kontrollere, at kemisk opløsning plus farvestof flyder ud nålen.
- Anbring diaset indeholder afstemt embryoner på mikroskop scenen. Fortsæt at fokusere embryo og nålen i samme plan. Samtidig punktere og microinject kemisk opløsning plus farvestof i hvert foster.
Noter: Tilstoppede nåle forekommer hyppigt, bryde en ny nål for at undgå ufuldstændig mikroinjektion. En stump nålespidsen ikke sår så rent som en vinklet nålespidsen. Justering dækglasset til en ikke-vinkel på 90 ° i brud er optimal til at frembringe en vinklet nålespidsen.
5.. Formaldehyd Fixation
Noter: De kemikalier, der anvendes i denne Drosophila fiksering er skadelige. Brug personlige værnemidler (f.eks handsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller) ved håndtering af kemikalier. Følg individuelle institutionelle retningslinjer for bortskaffelse af regulerede kemikalier.
- Efter sårdannelse vent 15, 30, 60 eller flere minutter for den transkriptionelle aktivering af sår-inducerede gener at forekomme. For at fjerne fostre fra injektions dias, omhyggeligt dræne halocarbon olie mix fra dias, læne slide mod et rack og duppes enden med en Kimwipe.
- Brug et glas pipette at skylle heptan over dias og vask skyl væske i et glas petriskål. Heptan vil opløse tape og frigive embryoner. Fortsæt med at skylle indtil alle fostrene fjernes fra diaset. Fortsæt til næste dias, indtil alle embryoner fjernes fra dias.
- Overfør heptan plus embryo løsning fra glasset fadet i en 20 ml scintillation hætteglasset. Ryst hætteglasset for 2-3 min, fjern heptan og tilsættes 5 ml frisk heptan.
- Der tilsættes 5 ml frisk, fiksering opløsning (se reagenser liste for opskrift). Luk hætteglasset og tillægger en orbital platform shaker. Ryst hætteglasset indeholder embryoner til 25 min ved 220-230 rpm.
- Efter omrystning, lad boblerne på grænsefladen pop. Helt at fjerne den nederste, vandige fase med en pipette, så man undgår at trække op embryoner. Det nederste lag består af fiksering løsning og skal bortskaffes korrekt.
- Der tilsættes 5 ml methanol, cap hætteglasset og rystes kraftigt med hånden for 20-30 sek, hvirvel og placere den på bænken. Sårede embryoner bo på interfase og ikke vil synke til bunds.
Bemærkninger: Efter fiksering vitellinmembranen en læderet embryo normalt burst i dehydratiseringstrinet med methanol. Imidlertid er vitellinmembranen i en såret foster allerede brudt, og dehydreringen skridt vil ikke fjerne vitelline membRane. Hånd-devitellinzation er påkrævet for at fuldføre fiksering protokollen. - Fjern forsigtigt det øverste Heptanlaget og tilsættes 5 ml frisk methanol derefter. Ryst hætteglasset og embryoner skal synke.
- Fjern methanol plus embryo løsning med et glas overførselspipette og saml det i en nylon mesh samling rør i en glasskål.
- Fjern methanol og skyl embryoner med 1x PBS løsning.
- Overfør embryoner fra nylonnet til et æble juice plade. Spred embryoner ud langs overfladen af pladen.
- Overfør embryoner til en dobbeltklæbende tape objektglas. Dæk fostre med 1x PBS.
Bemærkninger: embryoner tendens til at klumpe grund af vitellinmembranen. Ved hjælp af et æble juice sted giver mulighed for hurtig adskillelse af klumpet embryoner. Disse embryoner skal fjernes fra pladen og overføres til en dobbeltklæbende tape objektglas fordi embryoner synke ned i agarplade når der påføres kraft for at fjerne embryo fravitellinmembranen. - Skub forsigtigt embryoner med en dissekere nål til "pop" vitellinmembranen. Fosteret skal synke i PBS.
- Brug af en glaspipette for at overføre 1x PBS plus embryoner til et 1,5 ml rør. Skyl embryoner med 1x PBS og opbevares ved 4 ° C. Fortsæt at dehydrere embryoner ved hjælp af en Ethanol: PBS-serien og fortsætter med in situ hybridisering eller immunolokalisering protokol 14.
Representative Results
For at opnå de resultater, der er vist i denne fremgangsmåde, er den åbne læseramme af grønt fluorescerende protein (GFP) fusioneret til en promotor / sårinduceret enhancersekvens fra dopa decarboxylase (DDC) og DsRed er fusioneret til et sår enhancersekvens fra tyrosinhydroxylase ( pel) 4,6. I en levende Drosophila embryo, modning af det fluorescerende såret reporter protein er optimal 4-6 timer efter sårdannelse, hvilket giver tid til akkumulering af tilstrækkelig protein til at visualisere, samt tidspunkt for det fluorescerende protein til at oxidere til fluorescerende stand 15. At observere reporter lokalisering, en forbindelse, fluorescerende mikroskop er tilstrækkelig. At observere en højere forstørrelse af reporter lokalisering, et konfokalt mikroskop er optimal til at generere en maksimal projektion af flere optiske sektioner (figur 1). Konfokal in vivo billeddannelse af Drosophila embryoner kompliceres af raPID bølger af fostrene. . En fuld-view af foster kan opnås med 20X objektiv og et nærbillede af sår site kan opnås med 40X målsætning. En top-view af epidermal sår reporter lokalisering kan filmede med 10 på hinanden følgende 1 um optiske sektioner. En lateral syn på epidermal sår reporter lokalisering kan filmede med 40 på hinanden følgende 1 um optiske sektioner.
Ved hjælp af standard genetiske krydsende metoder, er det muligt at kombinere sår journalister med genetiske mutationer. Et eksempel præsenteres i dette papir er Flotillin-2 (Flo-2), fordi tab af funktion (null allel genereret med P-element indsættelse) og gain-of-funktion (overekspression genereret med allestedsnærværende udtryk i alle celler) mutanter af flo-2 demonstrere Flo-2-genproduktet er nødvendig og tilstrækkelig til at inhibere lokalisering af DDC-GFP sår reportere 9 (fig. 2A og 2B). Brug af microinjection protokol, er det muligt at teste, om indførelsen af kemiske opløsninger superactivates eller inhiberer lokalisering af sår reportere. Kemisk sårede embryoer blev samtidig såret og injiceres med en 1:4 1% toluidinblå farvestof og opløste forbindelser. Toluidin blåt farvestof tilladt for visuel bekræftelse af opløste forbindelser, der sprøjtes ind i kropskaviteten. Kontrol embryoer blev såret med en knækket kanyle indeholdende 1:4 på 1% toluidinblå farvestof og opløste uden kemisk. To eksempler, der præsenteres i dette papir er hydrogenperoxid (H 2 O 2) og methyl-β-cyclodextrin (MβCD), fordi begge kemiske løsninger er tilstrækkelige til globalt at aktivere lokalisering af DDC-GFP sår reportere 9 (figur 2C og 2D) . Hydrogenperoxid (H 2 O 2) blev fortyndet i H2O til 0,6 M. methyl-β-cyclodextrin (MβCD) blev opløst i 1 mM NaOH til 3 mM. Brug embryo fiksering protokol, er det muligt at detektere transkriptionsaktiveringen af sår respons gener i et lokaliseret område, der omgiver sårstedet. Et eksempel i dette papir er in situ-hybridisering af RNA-prober til påvisning af DDC og PLE udskrifter 4,6,9 (3A og 3B).
Figur 1. DDC-GFP og ple-DsRed sår reporter lokalisering. Brightfield og fluorescerende billeder i sårede vildtype embryoner. (A) Top-view DDC-GFP sår reporter. (B) Top-view af ple-DsRed sår reporter. Alle billeder blev indsamlet på et Leica SP2 konfokal mikroskop med 20x objektiv. Pile markerer stedet for sår. Stiplede linjer i panelet datas markerer omridset af embryoner. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Lokalisering af DDC-GFP sår reporter i genetiske mutant baggrunde og kemiske mikroinjiceret embryoner. Brightfield og fluorescerende billeder af sårede Flotillin-2 (Flo-2) mutant embryoner. (A) tab af funktion Flo-2 {KG00210} mutanter, udvidelse af reporter aktivitet i alle epidermisceller. (B) Gain funktionstab Flo-2 (bæltedyr-GAL4 UAS-Flo2) mutanter, hæmning af reporter aktivitet i alle epidermisceller. (C) Hydrogenperoxid (H 2 O 2 ) opløsning mikroinjektion, udvidelse af reporter aktivitet i alle epidermisceller. (D) methyl-β-cyclodextrin (MβCD) opløsning mikroinjektion, udvidelse af reporter aktivitet i alle epidermale celler. Alle billeder blev indsamlet på et Leica SP2 konfokal mikroskop med 20x objektiv. Pile markerer stedet for sår. Stiplede linjer i data panelerne markerer omridset af embryoner. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Påvisning af sår respons gen RNA-transkripter. Fluorescerende billeder af in situ hybridisering og RNA-detektion i sårede vildtype embryoner. Ddc (A) og PLE (B) RNA-transkripter ophobes omkring sårstedet. Alle billederne var indsamted på et Leica SP2 konfokalt mikroskop med 20x objektiv. Pile markerer stedet for sår. Stiplede linjer i data panelerne markerer omridset af embryoner. Klik her for at se større billede .
Tabel 1. Resumé af epidermal sår respons journalister. Insertioner for de fire sår respons reportere (DDC, ple, msn, KKV) er tilgængelige på både anden og tredje kromosomer. Alle sår respons reportere aktivere fluorescens-genet (GFP eller DsRed) i et begrænset antal epidermale celler, der omgiver stedet for stikskade i vildtype baggrund (fx "lokale" fænotype). DDC og msn sår respons reportere kræver GRH for aktivering af fluorescence gen efter punktering skade (fx "none" fænotype). Alle de viklede reportere kræver Flo-2 for lokalisering af fluorescens-genet efter punktering skade (fx "global" fænotype). Klik her for at se større billede .
Discussion
En øjeblikkelig transskriptionsregulerende reaktion på ydre signaler tillader celler til at koordinere en lokal reaktion på ekstracellulære stimuli, hvilket kan omfatte stress, skade eller infektion. Den forkerte kontrol af en lokaliseret reaktion kan have skadelige virkninger på de omkringliggende celler, såvel som et spild af ressourcer at reparere skaden. Drosophila embryo giver et glimrende system til at udføre grundlæggende sår healing eksperimenter i en billig og nem at vedligeholde model organisme. Potentialet for samarbejde mellem forskning i andre modelorganismer og Drosophila giver en unik mulighed for at udforske mange biologiske spørgsmål.
En yderligere teknik de viklede reportere er det genetiske kombination af mutant baggrunde, der giver en effektiv metode til afprøvning af bidrag af nye gener til aktivering af den epidermale såret respons pathway. Vi har epidermal sårinduceret transcriptionale reportere available på både 2. og 3. kromosomer 5. I denne undersøgelse bruger vi UAS og GAL4 systemer overekspression 16. I undersøgelser med dødelige mutantalleler vi bestemme den genetiske baggrund ved hjælp af et fluorescerende balancer kromosom, fx Krüppel-GFP 17. Vi har analyseret såret reporter lokalisering i flere genetiske baggrunde (Tabel1).
En eventuel ændring af teknikken er at kombinere mikroinjektion og sårdannelse. Mikroinjektion kan anvendes til at indføre en kemisk opløsning i embryoet. Adskillige kemiske forbindelser er blevet testet og fundet til at regulere aktiviteten af epidermal viklede reportere 9. Denne metode til samtidig sårdannelse og mikroinjektion kan være nyttigt til at øge antallet af celler i Drosophila embryo, der reagerer et sår signal og kan anvendes direkte til at overvåge genekspression ændringer efter sårdannelse 18. En fremtidig anvendelse af mikroinjektion teknik vil være at teste nye kemikalier til regulering af epidermal såret respons.
Drosophila som model for genetiske undersøgelser tilbyder en bred vifte af simple protokoller til effektivt at behandle komplekse spørgsmål. Nylige rapporter om mulighederne for Drosophila teknikker fremhæver brugen af hemocyte migration 19 og parasitære hveps infektion 20 som et middel til yderligere at udvide virkningerne af Drosophila forskningsverdenen. I tillæg til sårheling studier giver Drosophila en klassisk model for regenerering med fantasiens disksystem 21,22. De kombinerede fremskridt i imaginal disc regenerering studier og punktering / mikroinjektion såret giver en glimrende system til at opdage velbevarede dele af væv reparation.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne protokol er blevet udviklet i samarbejde med tidligere medlemmer af McGinnis Lab, Kim A. Mace og Joseph C. Pearson. Vi takker de fortsatte bestræbelser fra Bloomington Drosophila Stock Center for deres arbejde med at organisere og distribuere værdifulde bestande. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health (R01 GM077197 og K12 GM68524) og familien af Herbert Stern. MTJ understøttes i øjeblikket af Grant Number 5G12RR003060-26 fra National Center for Forskning Ressourcer og Grant Number 8G12MD7603-27 fra National Institute on Minority Sundhed og Sundhed forskelle. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institute on Minority Sundhed og Sundhed forskelle eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
