Summary
האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.
Abstract
עובר דרוזופילה מפתחת שכבת האפידרמיס חזק המשמשת גם להגנה על התאים הפנימיים מסביבה חיצונית קשה, כמו גם לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. פציעה לנקב עם מחטי זכוכית מספקת שיטה ישירה כדי לעורר תגובת אפידרמיס פצע מהירה שמפעילה כתבי תעתיק פצע, אשר ניתן דמיינו ידי אות כתב מקומית בעוברים או זחלי חיים. פציעה לנקב או לייזר מספקת גם אותות המקדמים הגיוס של hemocytes לאתר הפצע. באופן מפתיע, פציעה לנקב חמור (ולפנים) בעוברים בשלב מאוחר רק לעתים רחוקות משבשת התפתחות עוברית נורמלית, כמו יותר מ 90% מעוברים נפצעו כזה לשרוד לבגרות, כאשר עוברים מוזרקים במדיום שמן שממזער זליגה מיידית של hemolymph מאתרים לנקב . הליך הפצע דורש המיקרומניפולציה של עוברי דרוזופילה, כוללים יישור ידני של העוברים על AGצלחות ar והעברת העוברים המיושרים לשקופיות מיקרוסקופ. Assay תגובת פצע אפידרמיס דרוזופילה מספק מערכת מהירה כדי לבדוק את הדרישות הגנטיות של מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים המקדמים ריפוי פצע, כמו גם דרך מסך עבור תרכובות כימיות פוטנציאליות המקדמות ריפוי פצע. מחזור החיים הקצר והשגרתי culturing קל לעשות דרוזופילה אורגניזם מודל רב עוצמה. ריפוי פצע נקי דרוזופילה מופיע לתאם את תגובת משובי אפידרמיס, עם התגובה החיסונית המולדת, בדרכים שנמצאות עדיין בחקירה, המספקת מערכת מצוינת למצוא שימור רגולציה מנגנונים נפוצים לדרוזופילה ופציעת אפידרמיס יונקים.
Introduction
מניפולציה של עוברי דרוזופילה בטכניקת microinjection היא assay מבוסס היטב 1. המשמעות של שיטת כתב תגובת פצע אפידרמיס היא לשלב את הפרוטוקול ללנקב / microinjection עם כתבי ניאון ולדמיין תגובת in vivo לפגיעה באפידרמיס בעוברי דרוזופילה. מטרתה של שיטה זו היא לאפשר למגוון רחב יותר של מדענים להשתמש דרוזופילה ככלי לחקור את התהליכים המווסתים את תגובת תעתיק לפציעה לנקב באפידרמיס. האפידרמיס חד שכבתי בדרוזופילה מספק מערכת פשוטה ללמוד תגובת פצע אפידרמיס לאחר פציעה לנקב 2. עובר דרוזופילה הוא מערכת מודל חזקה גנטי לנתח את השלבים של תיקון פצע, לרבות תגובת פצע, דלקת, וreepithelialization 3. מדובר בין שאר משום שרבים או zygotic רוב מוטציות לשרוד עד סוף embryogenesהוא ולפתח מחסומי אפידרמיס גם כאשר דפוסים התפתחותיים הולך עמוק השתבש. אפיון קודם של ראש נשמרים היטב גורם שעתוק מגורען (Grh), זיהה כי גנים Grh יעד decarboxylase דופא (DDC) וhydroxylase טירוזין (ple) מופעלים תעתיק מסביב לאתרים של פגיעה 4. דרוזופילה כאורגניזם מודל לתגובת פצע מספק קו משלים של חקירה כדי לקדם מחקרים בריפוי פצע יונקים 5. מחקרים מאוחרים יותר זיהו גנים הנגרמים פצע דרוזופילה נוספים ופיתחו "ארגז כלים" של רבים כתבי פצע ניאון כדי לפקח על in vivo תגובת פצע אפידרמיס לנקות פצע 6. דיווחים אחרונים על הרגולציה של ריפוי פצע דרוזופילה התמקדו בפנוטיפ סגירת פצע, ומאפשרים גילוי של מסלולים רבים המסדירים תא הגירה 7,8. עם הניתוח שלכתבי פצע ניאון, המחקרים שלנו זיהו סט רומן של גנים הנדרשים לביטוי המקומיים של גנים פצע מושרה אפידרמיס 9. אחד היתרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות מספקות תובנה רבה יותר על מנגנון של כמה אותות transduced מהאתר של פגיעה בתאים השכנים. עם זאת, אחד החסרונות של שיטת כתב תגובת הפצע הוא שהתוצאות לא לקשר ישירות לפנוטיפים בריפוי או תיקון פצע. שימוש רחב יותר של הפרוטוקול לנקב פצע הנקי במסכים גנטיים וכימיים יאפשר רגולטורים חדשים של תגובת תעתיק לאפידרמיס ופצעו להיות מזוהים ולקדם את התרגום של תגליות ריפוי פצע לתוך מודלים של יונקים של טיפולי פציעה.
Protocol
פרוטוקול הפצע העוברי דרוזופילה ניתן לסכם בחמישה שלבים: (1) אוסף עובר, (2) עובר הכנה (3) העובר פציעה, (4) Microinjection עובר, ו( 5) קיבוע עובר.
1. אוסף עובר
- לאסוף זבובים בוגרים, 2-3 ימים לאחר eclosing, להוסיף 50 נקבות וזכרים 25 לכלוב אוסף עובר.
- הנח אגר טרי תפוחי מיץ בתוספת שמרי צלחת בכל בוקר במשך 3 ימים.
הערות: לאוסף עובר אופטימלי, מחזור הזבובים על לוח זמנים יומי שעות 12 בחממה 25 ° C (05:00 אורות "ON" ו -17:00 אורות "OFF"); זבובים נשיים להגיב לשינויים במחזור האור ו יפקיד כמויות גדולות יותר של ביצים במתג אורות "ON" לאורות "OFF" 10,11. - בשעתי אחר הצהריים של יום 3, במקום מיץ טרי תפוח בתוספת צלחת אגר שמרים על הכלוב ולאסוף עובר במשך שעה 2. הנח שמרי צלחת חדשה בכלוב ולשמור2 צלחת אוסף משאבי אנוש.
- אחסן את צלחת האוסף ל14 שעות נוספות ב ° C25 לגיל העוברים.
הערות: ריפוי פצע יכול להיות assayed בכל שלב במהלך פיתוח דרוזופילה, יש לי כתבי תעתיק מושרה הפצע המתואר במאמר זה פעילות אופטימלית בין שלבי 15-16 דצמבר. בשלב מאוחר 17, העובר הוא זקן מדי כדי לחדור בקלות לציפורן ההתבגרות וביעילות להפעיל את כתבי פצע או לזהות שעתוק מושרה פצע. כדי לאפשר את זמן האיסוף וזמן הפציעה להתרחש במהלך מעבדה שעות שיא, אנו עוקבים אחר לוח זמנים של אוסף עובר במשך שעה 2 (16:00-18:00), להחליף את צלחת האוסף עם צלחת חדשה בשעת 18:00, גיל צלחת האוסף ב25 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות (לילה), ופצע העוברים בשעה 08:00 (למחרת).
2. הכנת עובר
הערות: פרוטוקול זה כולל את השימוש בכלים רבים וחפצים שאינם חדים או עשוי gילדה. לטפל בכל המכשירים החדים וחפצי זכוכית בזהירות כדי למנוע פגיעה בגוף.
- להסיר בעדינות עוברים מצלחות אוסף עם מכחול על ידי הוספת 2-3 מיליליטר מים לצלחת ומתערבל. העבר את המים ועוברים מצלחת לרשת ניילון וצינור איסוף.
- להוסיף 4-5 מיליליטר של אקונומיקה לכובע של צלחת פטרי צלחת פלסטיק ולספוג סוף המכוסה הרשת של צינור האוסף המכיל את העוברים באקונומיקה למשך 2 דקות, אשר מסיר את קליפת הביצה החיצונית של העובר. באופן ידני לסובב את צינור האיסוף כמה פעמים כדי למנוע מעוברים שהלם באקונומיקה. יש לשטוף את העוברים עם 10x מים ולייבש את צינור איסוף הרשת מכוסה המכיל את עוברי dechorionated על מגבת נייר.
- השתמש באיזמל מנתחים להעביר ~ 50 עוברים מרשת הניילון לצלחת אגר. אנו מוסיפים צבע מאכל ירוק לצלחת אגר להוסיף קונטרסט וסיוע ביישור עובר. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות שתי שורות מקבילות של ~ 25 עוברים, יישור אמברימערכת הפעלה בשקופית, כך שהם יהיו בזווית ישרה למחט לנקב על מנגנון microinjection. השאר מעט מקום (כ 1 עובר אורך) בין העוברים לצורכי חילוף גזים. שתי שורות מקבילות צריכים להיות כ 5 מ"מ זה מזה.
- מקום שקופית עם קלטת כפולה מקל על גבי העוברים המיושרים ובזהירות לחץ על השקופיות להעברת עוברים מהצלחת הירוקה לשקופית. ואז אוויר יבש עובר ~ 25 דקות כדי להפחית את הלחץ פנימי על העובר ולמנוע פרץ כשפצע.
- הנח 2-3 טיפות של תערובת שמן halocarbon על העוברים על מנת למנוע התייבשות נוספת.
3. עובר פציעה
- מניחים את שקף העובר בשלב מיקרוסקופ ההזרקה. מצא את העוברים בשדה הראייה ולתרגל להזיז את הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה.
הערות: לפני העבודה עם המחט, להתמקד במישור אמצע העובר לאורך ציר dorsoventral. כדי לאפשר לפציעתם יעילה שלעוברים מיושרים, מתחילים פוצעים השורה קרובה יותר למנגנון המחט. הזז את הבמה כדי להביא את החלק העליון של השורה של עוברים מיושרים לשדה הראייה. - בזהירות במקום ולהבטיח את משך מחט בבעל המחט. השתמש micromanipulator להזיז את המחט לכיוון שקופיות. יישר את המחט עם העובר, באותו מישור מוקד. ברגע שהמחט נמצאת בפוקוס עם העובר, לא להזיז את המחט עם micromanipulator.
- הזז את הבמה כדי לנקב את העובר ולפנים, ולאחר מכן לעבור לעובר הבא בשורה. כאשר נעשה פצעו את השורה הראשונה, השתמש בmicromanipulator להזיז את המחט לגמרי, הרחק מהבמה לפני שעברתי את השקופית; ידני לסובב את השקופית 180 ° ופצע בשורה השנייה.
- אחסן את העוברים תחת שמן halocarbon בטמפרטורת חדר ולהמשיך עם קיבעון עובר אם עושה הכלאה באתרו או מכתים נוגדן (ראה שלב נוהל 5). לחלופין, לאחסן את העוברים ל4-6 שעותתחת שמן halocarbon ולהמשיך בויזואליזציה פצע תעתיק כתב ניאון (נציג תוצאות).
הערות: לקבלת ההדמיה של כתב הניאון, אנחנו מרדימים את העוברים באמצעות 50% 1-phenoxy-2-propanol 13. העוברים יוסרו משמן halocarbon והניחו בשקופית חדשה. אנחנו שמים חרוזי זכוכית סביב העוברים, להוסיף כמה טיפות של חומר ההרדמה, ולמקם את תלוש לכסות על העוברים.
4. Microinjection עובר
הערות: מנגנון microinjection שאנו משתמשים בפרוטוקול אינו אוטומטי כדי לספק נפח מסוים במהלך assay. אנו מוסיפים צבע לפתרון כדי להמחיש את microinjection ולנסות לנרמל את הנפח נמסר. אם יותר מדי פתרון מוזרק לתוך העובר, קרום vitelline יתפוצץ.
- מחט עומס מאחור עם 1 μl של תמיסה כימית בתוספת צבע (למשל 0.6 MH 2 O 2). לאפשר נימיםפעולה כדי לצייר את הפתרון הכימי לקצה המחט.
- לשבור את מחט, במקום להחליק כיסוי בזווית בשקופית ומעיל הקצה עם תערובת שמן halocarbon. להביא את המחט רכוב אל מוקד עם קצה להחליק את המכסה בזווית ובעדינות להעביר קצה לכסות להחליק על פני קצה המחט עד שבורה. להפעיל לחץ על מנגנון microinjection ולבדוק כי הפתרון הכימי בתוספת הצבע זורם החוצה את המחט.
- מניחים את השקף המכיל עובר מיושרים על הבמה מיקרוסקופ. המשך למקד את העובר ואת המחט באותו המטוס. במקביל לנקב ותמיסה כימית microinject בתוספת צבע לתוך כל עובר.
הערות: מחטי סתימה מתרחשות בתדירות גבוהה; לשבור מחט חדשה, כדי למנוע microinjection שלם. קצה מחט בוטה אינו פצע כמו נקי ככל קצה מחט בזווית. התאמת coverslip להלא 90 ° זווית במהלך השבירה היא אופטימלית לייצר קצה מחט בזווית.
5. Fi פורמלדהידxation
הערות: הכימיקלים המשמשים לקיבוע דרוזופילה זה מזיקים. יש להשתמש בציוד מגן אישי (למשל, כפפות, מעיל מעבדה, ומשקפי בטיחות) בעת טיפול בכימיקלים. פעל לפי הנחיות מוסדיות פרט לסילוק של כימיקלים מוסדרים.
- לאחר פציעתו, חכה 15, 30, 60, או יותר דקות להפעלת תעתיק של גנים מושרה פצע כדי להתעורר. כדי להסיר עוברי משקופיות הזרקה, לנקז בזהירות את תערובת שמן halocarbon מהשקופיות, להישען השקופיות נגד מתלה ולמחוק את הסוף עם Kimwipe.
- השתמש פיפטה זכוכית לשטוף heptane על השקופית ולשטוף את נוזל השטיפה לתוך צלחת פטרי זכוכית. Heptane יהיה לפזר את הקלטת ולשחרר את העוברים. תמשיך לשטוף עד שכל העוברים יוסרו מן השקופיות. המשך לשקופית הבאה, עד שכל העוברים יוסרו משקופיות.
- העבר את heptane בתוספת פתרון עובר מצלחת הזכוכית למדע 20 מיליליטרבקבוקון ntillation. נער את הבקבוקון ל2-3 דקות, להסיר את heptane ולהוסיף 5 מיליליטר של heptane הטרי.
- הוסף 5 מיליליטר של תמיסה טרי, קיבעון (ראה רשימת חומרים כימיים למתכון). מכסה את הבקבוקון ולצרף ייקר פלטפורמה מסלולית. נער את הבקבוקון המכיל את העוברים ל25 דקות ב220-230 סל"ד.
- אחרי שלחץ, בואו הבועות בפופ הממשק. להסיר לחלוטין את השלב התחתון, מימית עם טפטפת, הימנעות מושכת את העוברים. השכבה התחתונה מורכבת מפתרון הקיבעון וצריכה להיות מסולקת כראוי.
- הוסף 5 מיליליטר של מתנול, מכסה את הבקבוקון ולנער במרץ ביד ל20-30 שניות, מערבולת ולמקם אותו על הספסל. עוברים פצועים יישארו בשלבי ביניים ולא לשקוע בתחתית.
הערות: לאחר קיבוע קרום vitelline של עובר unwounded יהיה בדרך כלל פרץ במהלך שלב ההתייבשות עם מתנול. עם זאת, קרום vitelline בעובר פצוע כבר נשבר וצעד ההתייבשות לא יסיר את memb vitellineRANE. יד devitellinzation נדרש כדי להשלים את פרוטוקול הקיבעון. - מוציא בזהירות את שכבת heptane העליונה ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של מתנול הטרי. נער את הבקבוקון ואת העוברים צריכים לשקוע.
- הסר את מתנול בתוספת פתרון עובר עם טפטפת העברת זכוכית ולאסוף בצינור איסוף רשת ניילון בצלחת זכוכית.
- הסר את מתנול ולשטוף את העוברים עם פתרון 1x PBS.
- מעביר את העוברים מרשת הניילון לצלחת מיץ תפוחים. מורחים את העוברים החוצה על פני השטח של הצלחת.
- מעביר את העוברים לשקופית זכוכית סרט דו מקל. כסה את העוברים עם 1x PBS.
הערות: העוברים נוטים גוש בגלל קרום vitelline. שימוש במקום מיץ תפוחים מאפשר הפרדה מהירה של העוברים בכבדות. העוברים יש להסיר מן הצלחת והועברו לשקופית זכוכית קלטת מקל כפול משום שעוברים לשקוע בצלחת אגר כאשר הכוח מוחל כדי להסיר את העובר מןקרום vitelline. - לדחוף בזהירות את העוברים עם מחט לנתח ל" פופ "קרום vitelline. העובר צריך לשקוע בPBS.
- השתמש פיפטה זכוכית להעביר PBS 1x בתוספת עובר לצינור 1.5 מיליליטר. יש לשטוף את העוברים עם 1x PBS ולאחסן ב 4 ° C. המשך ליבש את העוברים באמצעות אתנול: סדרת PBS וימשיך עם הכלאה באתר או בפרוטוקול immunolocalization 14.
Representative Results
כדי להשיג את התוצאות שמוצגים בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא קבעה את אמרגן / מושרה פצע רצף משפר מדופא decarboxylase (DDC) וDsRed הוא קבע את רצף משפר פצע מhydroxylase טירוזין ( ple) 4,6. בעובר דרוזופילה חי, התבגרות של חלבון כתב פצע הניאון היא 4-6 שעות אופטימליות אחרי פציעתם, המאפשרת זמן להצטברות של חלבון מספיק כדי להמחיש, כמו גם זמן לחלבון פלואורסצנטי לחמצן למדינת הניאון 15. כדי לבחון את לוקליזציה הכתב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם מספיק. כדי לצפות בהגדלה גבוהה יותר של לוקליזציה הכתב, מיקרוסקופ confocal הוא אופטימלי כדי ליצור הקרנה המרבית של חלקים אופטיים מרובים (איור 1). Confocal בתחום ההדמיה vivo של עוברי דרוזופילה הוא מסובך ידי raגליות PID של העובר. . ניתן להשיג מלא מבט של עובר עם 20X אובייקטיבי וניתן לקבל מבט מקרוב על אתר פצע עם 40X אובייקטיבי. העליון נוכח לוקליזציה כתב פצע אפידרמיס ניתן הדמיה עם 10 סעיפים אופטיים 1μm רצופים. לרוחב תצוגה של לוקליזציה כתב פצע אפידרמיס ניתן הדמיה עם 40 1 מיקרומטר סעיפים אופטיים רצופים.
שימוש בשיטות מעבר גנטי סטנדרטיות, ניתן לשלב כתבי פצע עם מוטציות גנטיות. דוגמא אחת שהוצגה במאמר זה היא Flotillin-2 (Flo-2), כי פסד של פונקציה (אלל null שנוצר עם כניסה P-אלמנט) ומוטציות לזכות-of-פונקציה (ביטוי יתר שנוצר עם ביטוי בכל מקום בכל התאים) של Flo-2 להדגים את מוצר גן Flo-2 הוא הכרחי ומספיק כדי לעכב את הלוקליזציה של DDC-GFP פצע כתבים 9 (2A דמויות ו2B). שימוש במיילפרוטוקול croinjection, ניתן לבחון האם כניסתה של superactivates פתרונות כימיים או מעכבת את הלוקליזציה של כתבי פצע. עוברים כימיים פצועים נפצעו בו זמנית והוזרקו להם ביחס של 1:4 של 1% צבע הכחול toluidine ותרכובות solubilized. צבע הכחול Toluidine אפשר לאישור חזותי של תרכובות solubilized שהוזרקו לתוך חלל הגוף. עוברי בקרה נפצעו במחט שבורה המכילה 1:04 יחס של 1% צבע כחול toluidine ומומס ללא כימי. שתי דוגמאות שהוצגו במאמר זה הן מי חמצן (H 2 O 2) ותיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD), משום שהפתרונים הכימיים שני יש בם כדי גלובלי להפעיל הלוקליזציה של DDC-GFP פצע כתבים 9 (2C דמויות ו2D) . מי חמצן (H 2 O 2) היה מדולל בH 2 O ל0.6 מ 'מתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD) היה solubilized ב1 מ'M NaOH עד 3 מ"מ. באמצעות פרוטוקול קיבעון עובר, ניתן לזהות את הפעלת השעתוק של גנים תגובת פצע בתחום מקומי, המקיף את אתר פצע. דוגמא אחת שהוצגה במאמר זה היא הכלאה באתר של בדיקות RNA כדי לזהות DDC ותמלילי ple 4,6,9 (3A דמויות ו3B).
איור 1. DDC-GFP וple-DsRed פצע כתב לוקליזציה. Brightfield ותמונות ניאון בעוברי סוג בר פצועים. Top-אור כתב פצע DDC-GFP (). (ב) Top-אור ple-DsRed פצע עיתונאי. כל התמונות נאספו על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם 20X אובייקטיבי. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בנתוני הפנלs לסמן את קווי המתאר של עוברים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. לוקליזציה של כתב DDC-GFP פצע ברקע מוטציה גנטי ועוברים כימיים microinjected. Brightfield ותמונות ניאון של עוברים נפצעו Flotillin-2 (Flo-2) שעברו מוטציה. () הפסד-of-פונקצית Flo-2 מוטציות {KG00210}, התרחבותה של פעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. (ב) רווח של פונקצית Flo-2 (ארמדיל-GAL4, כטב"מ-Flo2) מוטנטים, עיכוב של פעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. (ג) מי חמצן (H 2 O 2 ) Microinjection פתרון, הרחבה של נציגORTER פעילות לאורך כל תאי האפידרמיס. (ד ') מתיל-β-ציקלודקסטרין (MβCD) microinjection פתרון, הרחבת הפעילות עיתונאית בכל תאי האפידרמיס. כל התמונות נאספו על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם 20X אובייקטיבי. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בלוחות נתונים לסמן את קווי המתאר של עוברים. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. זיהוי של מולקולות RNA גן תגובת פצע. תמונות ניאון של הכלאה באתר וזיהוי RNA בעוברים פצועים סוג בר. DDC () וple (ב) תעתיקי רנ"א לצבור סביב אתר הפצע. כל התמונות היו קולקטיביתטד על מיקרוסקופ confocal לייקה SP2, עם מטרת 20X. חצים מסמנים את אתר של פצע. קווים מקווקווים בלוחות נתונים לסמן את קווי המתאר של עוברים. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
טבלת 1. סיכום של כתבי תגובת הפצע באפידרמיס. הוספות של ארבעה כתבי תגובת פצע (DDC, ple, MSN, kkv) זמין בשני כרומוזומים השניה והשלישי. כתבי תגובת DDC ופצע msn כל כתבי תגובת הפצע להפעיל את גן הקרינה (GFP או DsRed) במספר מצומצם של תאי האפידרמיס המקיפים את האתר של פציעה לנקב ברקע הסוג בר (פנוטיפ לדוגמא: "המקומי"). דורשים Grh עבור הפעלה של fluorescenגן ce לאחר פציעה לנקב (פנוטיפ לדוגמא: "אף אחד"). כל כתבי הפצע דורשים Flo-2 ללוקליזציה של גן הקרינה לאחר פציעה לנקב (פנוטיפ לדוגמא: "הגלובלי"). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
תגובת רגולציה תעתיק מיידית לרמזים חיצוניים מאפשרת לתאים כדי לתאם את תגובה מקומית לגירויים תאיים, אשר יכול לכלול מתח, נזק, או זיהום. השליטה לא נכונה של תגובה מקומית יכולה להיות השפעה מזיקה על תאי שכנים, כמו גם בזבוז של משאבים כדי לתקן את הפציעה. עובר דרוזופילה מספק מערכת מצוינת לבצע ניסויי ריפוי פצע בסיסיים באורגניזם מודל-to-לשמור קל זול ו. הפוטנציאל לשיתופי פעולה בין המחקר באורגניזמים מודל אחרים ודרוזופילה מספק הזדמנות ייחודית לחקור שאלות רבות ביולוגיות.
טכניקה נוספת של כתבי הפצע היא שילוב הגנטי של רקע מוטציה, המספקת שיטה יעילה לבדיקת תרומתם של גנים חדשים להפעלה של מסלול תגובת הפצע באפידרמיס. יש לנו כתבי תעתיק מושרה פצע אפידרמיס אבailable בשני nd 2 ו 3 rd כרומוזומים 5. במחקר זה אנו משתמשים בכלי טייס ומערכות GAL4 של ביטוי יתר 16. ללימודים עם אללים מוטציה קטלניים אנו קובעים רקע הגנטי באמצעות כרומוזום איזון ניאון, למשל Kruppel-GFP 17. יש לנו ניתחנו את לוקליזציה כתב פצע בכמה רקע גנטי (טבלה 1).
שינוי אפשרי של הטכניקה הוא לשלב microinjection ופציעתם. Microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הפתרון כימי לעובר. כמה תרכובות כימיות נבדקו ונמצאו להסדיר את פעילותם של כתבי פצע אפידרמיס 9. שיטה זו של פציעה וmicroinjection בו זמנית יכולה להיות שימושית כדי להגדיל את מספר התאים בעובר דרוזופילה שיגיב אות פצע וניתן להשתמש בם ישירות כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גנים לאחר פצע 18. יישום עתידי של טכניקת microinjection יהיה לבחון כימיקלים חדשניים לויסות תגובת הפצע באפידרמיס.
דרוזופילה כמערכת מודל למחקרים גנטיים מציעה מגוון רחב של פרוטוקולים פשוטים כדי לטפל ביעילות בשאלות מורכבות. הדיווחים אחרונים על ההיתכנות של טכניקות דרוזופילה מדגיש את השימוש של הגירת hemocyte 19 וזיהום הצרעה טפילית 20 כאמצעי להרחבת השפעתה של קהילת מחקר דרוזופילה נוספת. בנוסף ללימודי תיקון פצע, דרוזופילה מספקת מודל קלאסי להתחדשות עם מערכת הדיסק דמותי 21,22. ההתקדמות בשילוב במחקרי התחדשות דיסק דמותי ופציעה לנקב / microinjection מספקת מערכת מצוינת לגלות רכיבים נשמרים היטב של תיקון רקמות.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם חברים קודמים של המעבדה מקגיניס, קים א מייס ויוסף ג פירסון. אנו מודים להמשך מאמצים על ידי מרכז מניות דרוזופילה Bloomington עבור עבודתם לארגן ולהפיץ מניות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM077197 וK12 GM68524) ומשפחתו של הרברט שטרן. MTJ נתמכת כיום על ידי גרנט מספר 5G12RR003060-26 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר וגרנט מספר 8G12MD7603-27 מהמכון הלאומי לבריאות מיעוט ופערים בבריאות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי על פערים בבריאות ובריאות מיעוט או המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
