Summary
Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.
Abstract
Drosophila embriyo her iki sert bir dış ortamdan iç hücreleri korumak için hem de hücre homeostazının muhafaza edilmesi işlevini güçlü bir epidermal tabaka geliştirir. Cam iğne ile delinmesi yaralanma canlı embriyolar veya larva lokalize bir raportör sinyali ile görselleştirilebilir yara transkripsiyonel raportörler, aktive hızlı bir epidermal yara yanıt tetiklemek için doğrudan bir yöntem sağlar. Delinme veya lazer zedelenmesi aynı zamanda yara bölgesine hemocytes alımı teşvik sinyalleri sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, geç dönem embriyo ağır (baştan sona) ponksiyon hasarı, sadece nadiren bu yaralı embriyoların% 90 daha embriyolar delinme sitelerinden hemolimf hemen sızıntısını en aza indiren, bir yağ ortamı içinde enjekte edildiği zaman yetişkinliğe hayatta olduğu gibi, normal embriyonik gelişme bozar . Yara prosedür ag üzerinde embriyo manuel ayarlama dahil olmak üzere Drosophila embriyoların Mikromanipülasyondan, gerektirirar plakaları ve slaytları mikroskop hizalanmış embriyoların transferi. Drosophila epidermal yara tepki deney yara iyileşmesini yanı sıra, yara iyileşmesini teşvik potansiyel kimyasal bileşiklerin taranması için bir yöntem geliştirmek biyolojik fonksiyonları çeşitli genetik gereksinimlerini test etmek için hızlı bir sistem sağlar. Kısa yaşam döngüsü ve kolay bir kültür rutin Drosophila güçlü bir model organizma olun. Drosophila temiz yara iyileşmesi düzenleyici korunmuş bulmak için mükemmel bir sistem sağlar soruşturma kapsamında halen şekillerde, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ile, epidermal rejeneratif yanıtı koordine görünüyor Drosophila ve memeli epidermal yaralama ortak mekanizmaları.
Introduction
Mikroenjeksiyon tekniği kullanarak Drosophila embriyolar Manipülasyon köklü bir tahlil 1'dir. Epidermal yara yanıt raportör yöntemin önemi floresan muhabir delinmeye / mikroenjeksiyon için protokol birleştirmek ve Drosophila embriyolarda epidermal yaralanma için bir in vivo yanıt görselleştirmek için. Bu yöntemin amacı, epidermal lastik yaralanmaya transkripsiyon yanıtı düzenleyen işlemleri incelemek üzere bir araç olarak kullanmak için Drosophila bilim adamları, daha geniş bir dizi sağlamaktır. Drosophila tek katmanlı epidermis bir delinme yaralanma 2 sonra epidermal yara tepkisini incelemek için basit bir sistem sağlar. Drosophila embriyo genetik yara tepki, enflamasyon ve reepithelialization 3 de dahil olmak üzere, yara iyileşmesi aşamalarını incelemek için sağlam bir model sistem. Çok ya da çoğu zigotik mutantlar embryogenes sonuna kadar hayatta kalmak için bu kısmında bulunanve gelişimsel desenlendirme derinden ters gittiği zaman bile epidermal engelleri gelişir. GRH-hedef genler dopa dekarboksilaz (DDC) ve tirozin hidroksilaz (ple) transkripsiyonel yaralanma 4'ün siteleri etrafında aktif olduğu. Tanımlanan, iyi korunmuş bir transkripsiyon faktörü Grenli kafası (GRH) Önceki karakterizasyonu Drosophila yara tepki için bir model organizma olarak memeli yara iyileşmesinde 5 çalışmalarını ilerletmek için soruşturma tamamlayıcı bir çizgi sunuyor. Daha sonraki çalışmalar, ek Drosophila yara kaynaklı gen belirlendi ve 6 yaralama temizlemek için in vivo epidermal yara yanıtını izlemek için birçok floresan yara gazetecilere bir "araç kiti" geliştirdik. Drosophila yara iyileşmesi düzenleme üzerinde son raporlar, hücre göçü 7,8 düzenleyen birçok yolların keşfini sağlayan, yara kapama fenotip odaklanmıştır. Analizi ilefloresan yara haberciler, çalışmalarımız epidermal yara uyarımlı gen 9'un lokalize ekspresyonu için gerekli olan genlerin yeni bir dizi belirledik. Yara yanıt raportör yönteminin esası bir sonuçları sinyalleri, komşu hücrelere yaralanma sitesinden transduse nasıl bir mekanizma daha fazla bilgi sağlar olmasıdır. Ancak, yara yanıt raportör yöntemin dezavantajları biri sonuçları doğrudan yara iyileşmesi veya tamir fenotiplere bağlantı kalmamasıdır. Genetik ve kimyasal ekranlarında temiz yara delinme protokolünün daha geniş kullanımı transkripsiyonel yanıt yeni düzenleyiciler tespit edilmesi yaralama epidermal ve yaralanma tedavileri memeli modelleri içine yara iyileştirici keşifler çeviri ilerletmek için izin verecektir.
Protocol
Drosophila embriyonik yara protokol beş adımda özetlenebilir: (1) Embriyo Collection, (2) Embriyo Hazırlama (3) Embriyo Yaralama, (4) Embriyo Mikroenjeksiyon, ve (5) Embriyo Fiksasyon.
1.. Embriyo Koleksiyonu
- , Yetişkin sinekleri toplayın 2-3 gün eclosing sonra, bir embriyo toplama kafesine 50 kadın ve 25 erkek ekleyin.
- 3 gün boyunca her sabah taze bir elma suyu agar artı mantar plaka koyun.
Notlar: 25 ° C inkübatör, 12 saat gündüz tarifesi optimum embriyo toplama, çevrimi için sinekler (ve 17:00 ışıklar "OFF" "ON" 05:00 ışıkları); dişi sinekler ışık döngüsü değişikliklere yanıt ve ışıkları "OFF" 10,11 "ON" ışıkları bir geçiş sırasında yumurta büyük miktarlarda yatıracaktır. - Day-3 öğleden sonra, kafes üzerinde bir taze elma suyu artı maya agar plaka koyun ve 2 saat boyunca embriyolar toplamak. Kafese yeni bir maya tabak yerleştirin ve kaydedin2 saat toplama plakası.
- Embriyoların yaş 25 ° C'de ek bir 14 saat boyunca toplama plakası saklayın.
Notlar: Yara iyileşmesi Drosophila gelişimi sırasında herhangi bir aşamada analiz edilebilir, bu yazıda bahsedilen yara ile indüklenen transkripsiyonel raportörler, 15-16 Aralık aşamaları arasında optimum aktiviteye sahiptir. Geç evre 17 tarafından, embriyo kolayca olgunlaşan manikür delmek ve verimli bir yara gazetecilere etkinleştirmek veya yara kaynaklı transkripsiyonunu tespit etmek çok eski. Toplama zamanı ve yaralama zaman yoğun laboratuvar saatlerinde meydana izin vermek için, biz, saat 18:00 'de yeni bir plaka ile toplama plakası alışverişi, 2 saat (16:00-18.00) için embriyo toplama bir program takip yaş 14 saat (bir gece) 25 ° C'de bir toplama plakası ve (bir sonraki gün) 08:00 'da embriyolar yara.
2. Embriyo Hazırlık
Notlar: Bu protokol, keskin veya g yapılmış birçok araç ve nesne kullanımını içerirkız. Yaralanmaları önlemek için itina ile tüm keskin ve cam nesneler tutun.
- Yavaşça plaka ve dönen 2-3 ml su eklenerek bir fırça ile toplama plakalardan embriyolar kaldırmak. Naylon örgü ve toplama tüpü için plaka su ve embriyolar transfer.
- Bir plastik Petri tabağı plakasının kap ağartıcı 4-5 ml ekleyin ve 2 dakika için ağartıcı embriyoları içeren toplama borusunun kapalı ucu örgü emmek, embriyonun dış yumurtaların kaldırır. Elle toplama tüpü beyazlatıcıya kümeleyerek embriyolar önlemek için birkaç kez döndürün. Su 10x'e ile embriyolar durulayın ve bir kağıt havlu üzerine dechorionated embriyoları içeren örgüyle kaplı toplama tüpü kurulayın.
- Bir agar plaka örgü naylon ~ 50 embriyolar transfer etmek için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Biz embriyo hizada kontrast ve yardım eklemek için agar plaka yeşil gıda boyası ekleyin. Bir mikroskop altında, Embry'yi hizalama, ~ 25 embriyo, iki paralel satır yapmakslayt üzerinde os da mikroenjeksiyon aparatı üzerinde delme iğnesine doğru açıda olacak şekilde. Gaz değişimi amaçlı embriyolar arasında küçük bir boşluk (yaklaşık 1 embriyo uzunluğu) bırakın. Iki paralel sıra birbirinden yaklaşık 5 mm olmalıdır.
- Hizalanmış embriyoların üstüne çift kaset sopa ile bir slayt yerleştirin ve dikkatli bir slayt yeşil plaka embriyolar transfer slayt basın. Sonra hava embriyoların kuru ~ 25 dk embriyo üzerinde iç basıncı azaltmak ve yaralama zaman bir patlama önlemek için.
- Daha fazla su kaybını önlemek için embriyolar üzerinde halokarbonlu yağ karışımı 2-3 damla yerleştirin.
3. Embriyo Yaralama
- Enjeksiyon mikroskop aşamada taslak slayt yerleştirin. Görüş alanında embriyolar bulmak ve ters mikroskop sahne hareket uygulama.
Notlar: iğne ile çalışmaya başlamadan önce, dorsoventral ekseni boyunca embriyonun orta düzlemine odaklanmak. Verimli yaraladığı için izin vermek içinhizalanmış embriyolar, yakın iğne aparatı satır yaralama başlar. Görüş alanı içine hizalanmış embriyoların satırın üst getirmek için sahne hareket ettirin. - Dikkatlice yerleştirin ve iğne tutucu bir çekti-iğne sabitleyin. Slayt aşağı doğru iğne taşımak için mikromanipülatör kullanın. Aynı odak düzlemi, embriyo ile iğne hizalayın. Iğne embriyo ile odak sonra, mikromanipülatör ile iğne taşımak yok.
- Sonra üst üste sonraki embriyo taşımak, ve aracılığıyla embriyo delinme sahne taşıyın. İlk satırı yaralama Bittiğinde, slayt taşımadan önce aşamasından yukarı ve uzağa tamamen iğne taşımak için micromanipulator kullanmak, manuel slayt 180 ° döndürmek ve ikinci satır yara.
- Oda sıcaklığında halokarbonlu yağ altında embriyoların Mağaza ve embriyo sabitleme ile devam situ hibridizasyon veya antikor boyama yapıyor if (Prosedür adım 5). Seçenek olarak ise, 4-6 saat için embriyolar depolamakhalokarbonlu yağ altında ve yara transkripsiyon floresan muhabiri görselleştirme (Temsilcisi Sonuçlar) ile devam.
Notlar: floresan haberci görselleştirilmesi için,% 50 1-fenoksi-2-propanol ile 13 embriyolar anestezi. Embriyolar halokarbon yağdan çıkarıldı ve yeni bir lam üzerine yerleştirilir. Biz, embriyoların etrafında cam boncuklar yer anestezik birkaç damla ekleyin ve embriyolar üzerinde bir kapak kayma yerleştirin.
4. Embriyo Mikroenjeksiyon
Notlar: Biz protokol kullanmak mikroenjeksiyon aparatı tahlil sırasında belirli bir ses sunmak için otomatik değildir. Biz mikroenjeksiyon görselleştirmek ve teslim ses normalleştirmek için denemek için çözüm bir boya ekleyin. Çok fazla çözelti embriyonun içine enjekte edilir, vitellin zar patlar.
- Kimyasal çözeltinin ayrıca boya 1 ul arkadan yük iğne (örn. 0,6 MH 2 O 2). Kılcal iziniğnenin ucuna kimyasal çözüm çizmek için eylemi.
- Bir iğne kırmak için, bir slayt ve ceket halokarbonlu yağ karışımı ile kenar üzerinde bir açıyla bir kapak kayma yerleştirin. Açılı kapak kayma kenarı ile odak haline monte iğne getirin ve hafifçe kırık kadar iğne ucu genelinde kapak kayma kenarına taşıyın. Mikroenjeksiyon cihazları üzerinde baskı uygulayın ve kimyasal çözüm artı boya iğne dışarı aktığını kontrol edin.
- Mikroskop sahnede hizada embriyoları içeren slayt yerleştirin. Aynı düzlemde embriyo ve iğne odak geçin. Aynı anda delinme ve Microinject kimyasal çözelti artı her embriyo içine boya.
Notlar: Tıkalı iğneler sık sık meydana gelen; eksik mikroenjeksiyon önlemek için yeni bir iğne kırmak. Bir künt bir iğne ucu kadar temiz açılı bir iğne ucu kadar yara almaz. Kırılması sırasında olmayan 90 ° açı ile lamel ayarlanması açılı bir iğne ucu üretmek için en uygunudur.
5. Formaldehit Fixation
Notlar: Bu Drosophila tespitte kullanılan kimyasallar zararlıdır. Kimyasalları kullanırken kişisel koruyucu ekipman (örn. eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük) kullanın. Düzenlenir kimyasalların atılması için bireysel, kurumsal yönergeleri izleyin.
- Yaralanma sonrasında ortaya yara-teşvik edilmiş genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için 15, 30, 60, ya da daha fazla dakika bekleyin. Enjeksiyon slaytlar embriyolar kaldırmak için, dikkatli, slaytlardan halokarbonlu yağ karışımı boşaltın rafa karşı slayt yalın ve bir Kimwipe ucunu kurulayın.
- Slayt üzerinde heptan durulama ve bir cam Petri kabı içine sıvı durulama yıkamak için bir cam pipet kullanın. Heptane bandı çözülür ve embriyolar yayınlayacak. Tüm embriyolar slayt kaldırılana kadar çalkalamaya devam edin. Tüm embriyolar slaytlar kaldırılana kadar, bir sonraki slayta geçin.
- 20 ml'lik bir bilim içine cam çanak heptan çözeltisi artı embriyo transferntillation flakon. 2-3 dakika boyunca çalkalayınız, heptan kaldırmak ve taze heptan 5 ml ekleyin.
- Taze, fiksasyon solüsyonu 5 ml ekleyin (tarifi için reaktifler listesine bakınız). Kapatılır ve orbital çalkalama platformunda ekleyin. 220-230 rpm'de 25 dakika boyunca embriyoları içeren şişe çalkalayın.
- Çalkalanmış, arayüz pop da kabarcıklar sağlar. Tamamen embriyolar çekerek kaçınarak, bir pipet ile alt, sulu faz kaldırın. Alt tabaka, sabitleme çözeltisi oluşmaktadır ve uygun şekilde atılmalıdır.
- , Metanol 5 ml ekleyin, şişeyi kap ve 20-30 sn, girdap için elle kuvvetlice çalkalanır ve tezgah üzerine yerleştirin. Yaralı embriyolar interfaz kalacak ve dibe batar olmayacaktır.
Notlar: Tespit edildikten sonra bir yaralı olmayan embriyo vitellin zar normal olarak metanol ile dehidrasyon aşaması esnasında patlar. Ancak, yaralı embriyo vitellin zar zaten kırılmış ve dehidratasyon adım vitellin memb kaldırmazrane. El devitellinzation tespit protokolü tamamlamak için gereklidir. - Dikkatli bir şekilde üst heptan tabakayı kaldırmak ve sonra taze metanol 5 ml ekleyin. Şişeyi çalkalayın ve embriyolar lavabo olmalıdır.
- Bir cam aktarım pipet ile metanol artı embriyo çözüm çıkarın ve bir cam tabak içinde, naylon örgü toplama tüpü içinde toplar.
- Metanol çıkarın ve 1x PBS çözeltisi ile embriyolar yıkayın.
- Bir elma suyu plaka için naylon mesh embriyolar transfer. Levhanın yüzeyi boyunca embriyolar yayıldı.
- Bir çift sopa bant cam slayt embriyolar transfer. 1x PBS ile embriyolar örtün.
Notlar: Embriyolar nedeniyle vitellin membran gelme eğilimindedir. Bir elma suyu kullanarak yer topaklaşmış embriyoların hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. Kuvvet embriyo kaldırmak için uygulandığı zaman embriyolar agar plakası gömülmek için embriyolar, levhadan kaldırılır ve bir çift çubuk bant cam slayt aktarılmalıdırvitellin membran. - Dikkatle vitellin membran "pop" bir diseksiyon iğne ile embriyolar itin. Embriyo PBS içinde lavabo olmalıdır.
- Bir 1.5 ml tüp 1x PBS ve embriyo transferi için bir cam pipet kullanın. 4 ° C'de 1x PBS ve mağaza ile embriyolar durulayın PBS serisi ve in situ hibridizasyon veya bağışık protokolü 14 devam: Bir Etanol kullanılarak embriyolar kurutmak geçin.
Representative Results
Bu yöntemde de gösterilen sonuçlar elde etmek için, yeşil floresan proteini (GFP) ve açık okuma çerçevesi dopa dekarboksilaz (DDC) ve DsRed (tirosin hidroksilaz Bir yara arttırıcı sekansına kaynaştırıldığı bir yükseltici / arttırıcı yara kaynaklı sekansına kaynaştırılır ple) 4,6. Canlı bir Drosophila embriyo olarak, floresan yara raportör proteininin uygun olgunlaşma 4-6 yeterli protein birikimi görselleştirmek için zaman sağlar: yaralama sonra saat, hem de floresan durumuna 15 oksitlemek için flüoresan protein için zamanı. Muhabir yerelleştirme gözlemlemek için, bir bileşik floresan mikroskop yeterlidir. Raportör lokalizasyonu daha yüksek bir büyütme gözlemlemek için, konfokal mikroskop birden fazla optik bölme maksimum çıkıntı (Şekil 1) oluşturmak için en uygunudur. Drosophila embriyoların in vivo görüntüleme konfokal ra karmaşıklaşırEmbriyonun pid düzensizlikleri. . Embriyonun tam bir görüş 20X objektif ile elde edilebilir ve yara yerinin bir close-up görünümü 40X amacı ile elde edilebilir. Epidermal yara muhabiri lokalizasyonu bir üst-bakış 10 ardışık 1 Pm'lik optik bölümleri ile görüntülü olabilir. Epidermal yara muhabiri lokalizasyonu lateral-view 40 ardışık 1 mikron optik bölümleri ile görüntülü olabilir.
Standart genetik geçiş yöntemleri kullanılarak, genetik mutasyonlar ile yara gazetecilere birleştirmek mümkündür. Bu çalışmada sunulan bir örnek flotillin-2 (Flo-2), çünkü (P-element ekleme ile oluşturulan boş alel) zarar işleve ve kazanç fonksiyon-(tüm hücrelerde her yerde ifade ile üretilir fazla ifade) mutanları flo-2 Flo-2 gen ürünü gazetecilere 9 yara DDC-GFP lokalizasyonunu inhibe etmek için gerekli ve yeterli olduğunu göstermektedir (Şekil 2A ve 2B). MI kullanmacroinjection protokol, kimyasal çözeltiler superactivates tanıtımı veya yara gazetecilere lokalizasyonu inhibe olmadığını test etmek mümkündür. Kimyasal-yaralanmış embriyolar, aynı zamanda yaralı ve% 1 toluidin mavisi ve çözündürülmüş bileşiklerin bir 1:4 oranında enjekte edilmiştir. Toluidin mavisi boya vücut boşluğu içine enjekte edilen çözündürülmüş bileşiklerin görsel doğrulanması için izin verdi. Kontrol embriyolar kimyasal olmadan% 1 toluidin mavi boya ve çözünen 1:4 oranını içeren bir kırık iğne ile yaralandı. Bu çalışmada sunulan iki örnek hidrojen peroksit (H 2 O 2) ve metil-β-siklodekstrin (MβCD), hem de kimyasal çözümler küresel Ddc-GFP lokalizasyonu gazetecilere yara aktifleştirmek için yeterli çünkü 9 (Şekil 2C ve 2D) . Hidrojen peroksit (H 2 O 2) H içerisinde seyreltildi 2 O M. metil-β-siklodekstrin (MβCD) 0.6 1 m içinde solubilize edildiM NaOH 3 mm. Embriyo tespit protokolü kullanılarak, bir yara alanını çevreleyen, bir lokalize etki yara tepki genlerinin transkripsiyon aktivasyonunu tespit etmek mümkündür. Bu çalışmada sunulan bir örnek, ddC ve ple transkript 4,6,9 (Şekiller 3A ve 3B) tespit etmek için RNA sondalarının in situ hibridizasyon bulunmaktadır.
Şekil 1. DDC-GFP ve ple-DsRed (B). (A) Ddc-GFP yara muhabiri Top-görünümü. Yaralı vahşi tip embriyolar muhabiri yerelleştirme. Aydınlık ve floresan görüntüleri yara ple-DsRed Top-görünümü muhabiri yara. Tüm görüntüler 20X amacı ile, bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde toplanmıştır. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panelinde Kesik çizgilers embriyoların ana hatlarını işaretlemek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Genetik mutant geçmişleri ve kimyasal mikroenjeke embriyoları. Aydınlık ve yaralı flotillin-2 (Flo-2) mutant embriyo floresan görüntüler de Ddc-GFP muhabiri yara lokalizasyonu. (A) Kayıp fonksiyon-Flo-2 {} KG00210 mutantlar, Tüm epidermal hücreleri boyunca raportör etkinliğinin genişlemesi. (B) Kazanç fonksiyon-Flo-2-(armadillo-GAL4, UAS-Flo2) mutantları, her epidermal hücreleri boyunca raportör etkinliğinin engellenmesi. (C) hidrojen peroksit (2 H O 2 ) çözeltisi mikroenjeksiyon, rep genişlemesiÖrter aktivitesi tüm epidermal hücreleri boyunca. (D) Metil-β-siklodekstrin (MβCD) çözeltisi mikro enjeksiyon, epidermal hücreleri boyunca her raportör etkinliğinin genişlemesi. Tüm görüntüler 20X amacı ile, bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde toplanmıştır. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panellerde kesik çizgiler embriyoların ana hatlarını işaretlemek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Yara tepki gen RNA transkriptlerinin saptanması. Yaralı vahşi tip embriyoların in situ hibridizasyon ve RNA tespiti floresan ve görüntüler. Ddc (A) ve ple (B) RNA transkriptleri yara etrafında birikir. Tüm görüntüler toplama vardı20X amacı ile bir Leica SP2 konfokal mikroskop üzerinde ted. Oklar yara siteyi işaretleyin. Veri panellerde kesik çizgiler embriyoların ana hatlarını işaretlemek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Tablo 1. Epidermal yara tepki gazetecilere özeti. Dört yara tepki gazetecilere (Ddc, ple, msn, KKV) ve Eklemeler hem ikinci ve üçüncü kromozom mevcuttur. Yara tepki habercilerin tüm yabani tip arka (örneğin, "lokal" fenotip) in lastik yaralanma alanını çevreleyen epidermal hücrelerin sınırlı sayıda floresan gen (GFP veya DsRed) aktive eder. Ddc msn ve yara tepki muhabir için gerekli GRH FLORESAN aktivasyonudelinme yaralanma (örneğin, "none" fenotip) sonra ce gen. Yara gazetecilere tüm delinme yaralanma (örneğin "küresel" fenotip) sonra floresan genin lokalizasyonu için Flo-2 gerektirir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Discussion
Dış işaretlere acil transkripsiyonel düzenleyici tepki hücreleri stres, hasar veya enfeksiyonu içerebilir dışı uyaranlara lokalize bir yanıtı koordine sağlar. Yerelleştirilmiş bir yanıtın uygun olmayan kontrol hasarı onarmak için zarar komşu hücreler üzerindeki etkilerinin yanı sıra, ziyan edilmiş bir kaynak olabilir. Drosophila embriyo, ucuz ve kolay muhafaza model organizma temel yara iyileştirici deneyler için mükemmel bir sistem sağlar. Diğer model organizmalar araştırma ve Drosophila işbirlikleri için potansiyel pek çok biyolojik soruları keşfetmek için eşsiz bir fırsat sunuyor.
Yara muhabir ek bir teknik epidermal yara tepki yolunun aktivasyonuna, yeni genlerin katkısı test etmek için etkili bir yöntem sağlamaktadır, mutant arka genetik kombinasyonudur. Biz, epidermal yara kaynaklı transkripsiyonel raportörler, av var2 nci ve 3 üncü kromozom 5 hem AILABLE. Bu çalışmada biz UAS ve aşırı ekspresyonunun 16 GAL4 sistemlerini kullanabilirsiniz. Ölümcül mutant allelleri ile çalışmalar için biz bir floresan dengeleyici kromozomu, örneğin Kruppel-GFP 17 kullanılarak genetik arka plan belirler. Biz birkaç genetik geçmişleri (Tablo 1) de yara muhabir yerelleştirme analiz ettik.
Tekniğin muhtemel modifikasyon mikroenjeksiyon ve yaralama birleştirmektir. Mikroenjeksiyon embriyo bir kimyasal solüsyon tanıtmak için kullanılabilir. Birçok kimyasal bileşikler test edilmiş ve epidermal yara muhabir 9 aktivitesini düzenleyen bulunmuştur. Eş zamanlı yaralanmalar ve mikroenjeksiyon Bu yöntem, bir yara sinyal yanıt ve doğrudan 18 yaralama sonra gen ekspresyonu değişiklikleri izlemek için kullanılabilir Drosophila embriyo hücrelerinin sayısını arttırmak için yararlı olabilir. Mikroenjeksiyon tekniğin bir yönelik uygulama epidermal yara cevabının düzenlenmesi için yeni bir kimyasal test etmek olacaktır.
Genetik çalışmalar için bir model sistemi olarak Drosophila verimli bir şekilde karmaşık soruları için basit protokoller geniş bir yelpazede sunuyor. Drosophila tekniklerinin fizibilitesi ile ilgili son raporlar daha Drosophila araştırma topluluğunun etkisini genişletmek için bir araç olarak hemocyte göç 19 ve parazitik yabanarısı enfeksiyon 20 kullanımını vurgulamaktadır. Yara onarım çalışmalarına ek olarak, Drosophila hayali disk sistemi 21,22 ile yenilenme için bir klasik model sağlar. Hayali disk rejenerasyon çalışmaları ve delinme / mikroenjeksiyon yaralanmasıyla kombine gelişmeler doku onarımının iyi korunmuş bileşenleri keşfetmek için mükemmel bir sistem sağlar.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu protokol McGinnis Lab, Kim A. Mace ve Joseph C. Pearson önceki üyeleri ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Biz değerli hisse senetleri düzenlemek ve dağıtmak çalışmaları için Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi tarafından devam çabalarını teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM077197 ve K12 GM68524) ve Herbert Stern aileden fon tarafından desteklenmiştir. MTJ anda Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların üzerinde Ulusal Enstitüsü Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve Hibe Numarası 8G12MD7603-27 Hibe Numarası 5G12RR003060-26 tarafından desteklenmektedir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Azınlık Sağlık Ve Sağlık Farklılıkların veya Sağlık Ulusal Enstitüleri üzerinde Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
