Summary
Her beskriver vi en in vivo-mutagenese assay for små antall av hematopoetiske celler renset ved hjelp av laci transgen musemodell. Den laci-genet kan bli isolert for å bestemme frekvensen, plasseringen og typen av DNA-mutanter spontant oppstått eller etter eksponering for genotoxins.
Abstract
I de senere årene har det blitt klart at genomisk ustabilitet er tett knyttet til mange utviklingsforstyrrelser, kreft, og aldring. Gitt at stamceller er ansvarlig for å sikre vev homeostase og reparasjon gjennom hele livet, er det rimelig å hypotese at stamcelle befolkningen er avgjørende for å bevare genomisk integritet av vev. Derfor har betydelig interesse oppstått i å vurdere virkningen av endogene og miljøfaktorer på genomisk integritet i stamceller og deres avkom, med formål å forstå etiologi av stamcellebaserte sykdommer.
Laci transgene mus som bærer et gjenvinnbart λ fag-vektor som koder for laci rapportørsystem, hvor laci-gen tjener som mutasjon reporter. Resultatet av en mutert laci-genet er produksjon av β-galaktosidase som kløyver et kromogent substrat, å dreie det blå. The Laci reporter systemet er gjennomført in alle cellene, inkludert stammen / stamceller og kan lett gjenvinnes og benyttes til senere å infisere E. coli. Etter inkubasjon infiserte E. coli på agarose som inneholder riktig underlaget, kan plaketter scores, blå plaketter indikerer en mutant Laci genet, mens klare plaketter havn villtype. Frekvensen av blått (blant klare plaques) indikerer den mutante frekvens i den opprinnelige cellepopulasjon DNA ble ekstrahert fra. Sekvensering av mutant laci-genet viser plasseringen av mutasjoner i genet og typen mutasjon.
The Laci transgen musemodell er godt etablert som en in vivo mutagenesetest. Videre, mus og reagensene for analysen er kommersielt tilgjengelige. Her beskriver i detalj hvordan denne modellen kan tilpasses for å måle frekvensen av spontant forekommende DNA-mutanter i stamcelle-anriket Lin - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) celler og andre subpopulasjoner av den hematopoetiske system.
Introduction
I de fleste vev, differensierte celler har en begrenset levetid. For å opprettholde funksjonell integritet, lang levetid, vevsspesifikke stamceller produserer kontinuerlig progenitor-celler som i sin tur gir opphav til de fullt differensierte celler som er nødvendige for funksjonen av det aktuelle vev. Stamceller også fylle sin egen rommet gjennom en prosess som kalles selvfornyelse. Dermed stamceller er ansvarlig for å opprettholde den funksjonelle integritet av vevet de bor i. Derfor er det viktig at de er utstyrt med robuste mekanismer for å sanse og potensielt reparere skadet DNA. Hvis ikke, kan de skaffe seg flere genomisk (potensielt skadelige) forstyrrelser, som kan arves av deres avkom. Forstå hvordan stamceller ivareta deres genom under levetiden til en organisme er et viktig spørsmål og kan hjelpe oss å forstå hvorfor genomisk ustabilitet er knyttet til kreft og noen andre aldersrelaterte sykdommer (anmeldt i 1,2).
3-6. Det ble funnet at, for eksempel i det hematopoetiske system, dobbeltstrenget DNA bryter kan repareres ved hjelp av homolog rekombinasjon (HR) eller ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ), hvor sistnevnte er en reparasjonsprosess med lavere nøyaktighet, og derved øker risikoen for å gjøre feil. Begge blir utnyttet i blodkreft stamceller (HSCs) 4,5, men i mus synes det det er overveiende NHEJ i HSCs mens tidlige stamceller celler benytter HR 4. En lignende observasjon ble gjort for stamceller i huden 6.. Interessant, i menneskelig HSCs HR, ikke NHEJ,synes å være reparasjonsmekanismen av valget for dobbel tråd pauser tre. Hvorvidt denne funksjonelle forskjell mellom de to artene er ekte eller bare representerer et teknologisk eller eksperimentell forskjell gjenstår å se.
En stamcelle repertoar å reparere skadet DNA er sannsynlig å inkludere andre DNA-reparasjonsmekanismer, som for eksempel grunn excision reparasjon (BER), nucleotide excision reparasjon (NER) og mismatch reparasjon (MMR). BER og NER er ansvarlig for å reparere én eller flere basepar lesjoner i enkelttrådet DNA, mens MMR fikser basen-base mismatch og innsetting / sletting sløyfer, og disse typer DNA-skader kan ikke repareres av NHEJ eller HR. Støtter denne oppfatningen er flere studier fra blodkreft systemet viser en kobling mellom endringer i en av disse banene og unormalt i HSC rommet 7-9, samt en økt risiko for å utvikle myelodysplastisk syndrom 10-16, en sykdom som oppstår iHSC og som er assosiert med økende genomisk ustabilitet som sykdommen utvikler 17. Som foreløpig har målinger av BER, NER, og MMR direkte i HSCs ikke blitt rapportert.
I tillegg til å belyse de forskjellige prosesser som styrer vev integritet ved en mekanistisk nivå, er det viktig å være i stand til å måle omfanget av mutert DNA, slik at konsekvensene av forstyrrelser i en av disse prosessene kan bli testet, for eksempel i normal versus genetisk konstruerte stamceller eller i gamle kontra unge. Imidlertid er utviklingen av en relevant analysen vanskelig på grunn av mangelen på vevsspesifikke stamceller og mangelen på dyrkningsbetingelser som bevarer "stemness". Videre bør et slikt assay er amendable til miljø-og genetiske manipulasjoner. En mulig løsning på disse begrensninger og krav er bruk av musemodeller som er spesielt konstruert for å detektere DNA-mutasjoner.
Multiple transgene musemodeller for mutasjon deteksjon har blitt utviklet. For eksempel laci transgene mus 18 bærer et gjenvinnbart λ fag vektor som koder for laci rapportørsystem, hvor laci-genet koder for en suppressor av Lac operatøren og tjener som mutasjonen reporter. Ved mutasjon av laci-genet, blir Lac operatøren aktivert og β-galaktosidase fremstilles. β-galaktosidase spalter det kromogene substratet X-gal (5-brom-4-klor-e-indolyl-β-D-galaktopyranosid), som omdanner det blå. COS nettsider flankerer Laci vektor gir enkel gjenoppretting av lambda proteiner og påfølgende infeksjon av E. coli. Etter inkubasjon infiserte E. coli på agarose som inneholder X-gal underlaget, kan plakk scores. Blå plakater inneholde en antatt mutant Lac-Jeg bærer fag, mens klare plaketter båtplass ikke-mutanter. Hyppigheten av blå plaketter (blant the klare seg) indikerer den mutante frekvens i den opprinnelige cellepopulasjon DNA ble ekstrahert fra. Dessuten kan λ phage vert for laci target lett sekvensert ved hjelp av PCR-teknikker for relativt høy gjennomstrømning analyse. Sekvense flere mutant Laci gener vil avdekke viktig informasjon om mutasjonen spekteret, noe som igjen kan peke på mulige mangler i spesifikke DNA-reparasjonsbaner eller til bestemte gentoksiske hendelser. The Laci transgen systemet har blitt standardisert på tvers av flere laboratorier 19 og reagenser er tilgjengelig kommersielt. En stor ulempe med Laci systemet er begrenset evne til å oppdage store slettinger eller rearrangements, og derfor andre metoder, for eksempel multi-farge fisk på metafase sprer må brukes til å kompliment denne mangel.
Innenfor λ fagvektoren av laci mus modell, er det en mye mindre genet, CII, Fåes for mutasjonsanalyse. Dens størrelse og det faktum at mutanter kan velges gjør dette til en mindre arbeidskrevende og billigere assay 20 enn laci-genet analyse. Imidlertid er laci-genet mer grundig studert for mutagenese 21 og følsomheten av genet for mutasjoner er blitt godt karakterisert, slik at det er en klar forståelse av de aminosyrerester som genererer et fenotypiske respons på et kromogent substrat 22-25.
Andre musemodeller for mutasjon påvisning omfatter anvendelse av ΦX174 eller lacZ-transgener. Den ΦX174 transgen musemodell, med den opprinnelige A: T → G: C reversion mutasjonsanalyse 26 eller den fremre mutasjonsanalyse 27 som tillater påvisning av et spekter av basepar-substitusjoner, representerer et mindre kostbart system enn laci-modellen. Men, er ikke trivielt og mutasjonen spec den mutational skjermen i termin analysentrum av ΦX174 transgenet blir ikke så godt karakterisert som for laci. I musemodeller bærer LacZ transgener, er LacZ mutational reporter utvinnes utnytte E. coli-vertsceller som er sensitive for galaktose og medium inneholdende 28 galaktose. En ulempe ved dette systemet er at gjenvinning av LacZ-målet omfatter også restriksjonsendonuklease digestion, fulgt av ligering og elektroporering i E. coli vert, og dermed gjøre det vanskelig å tilpasse systemet for et lite antall celler. Selv om det ikke er et absolutt krav for å arbeide med stammen / progenitor-cellepopulasjoner (man kan alltid starte med flere mus), hvis et stort antall celler er nødvendig (f.eks millioner eller mer), vil det raskt bli upraktisk og kost prohibitive. Også den forholdsvis store størrelse av LacZ, samtidig som det gir en sensitiv reporter mutasjons, er tungvint og mer kostbart for DNA-sekvensanalyse og determination av mutasjon spektra. En stor fordel ved denne modellen er imidlertid dens evne til å detektere store delesjoner og innføringer, samt kromosomale rearrangementer.
Ettersom alle cellene i laci, ΦX174 og lacZ-transgene musemodeller bære rapportørsystem, kan en hvilken som helst av disse musemodeller anvendes for å måle mutagenese i en hvilken som helst celletype av interesse, inkludert stamceller og progenitor-celler, så lenge de kan bli pålitelig høstes og i tilstrekkelig antall. Fordi vi hadde lang erfaring med Laci mus modell og Laci mutasjonsanalyse, bestemte vi oss for å satse på dette systemet videre for mutagenese analyse i blodkreft stilk og progenitor populasjoner.
Blodkreft vev er godt karakterisert i form av celleoverflaten fenotype av sine individuelle komponenter, inkludert langsiktige repopulating stamceller, som er gjenkjennelige til den ekstremt sjeldne bestanden av Lin - IL7R
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leukocytter fra Laci transgene mus på en C57BL / 6 bakgrunnen uttrykker ikke Sca-en (figur 1). Derfor, hvis Sca-en er en markør som brukes for celle rensing, disse musene må krysses med en passende belastning å få Sca-ett uttrykk; i denne protokollen F1 av en krysning mellom vanlige C57BL / 6 (B6) mus og Laci (C57BL / 6) transgene mus (laci) ble benyttet (Figur 1). Av cellepopulasjoner som brukes i denne protokollen, LSKs og CMPS representerer de minste bestandene i benmargen. For å rense minst 2 x 10 5 av hvert / sort, kombinere margen fra ca ti mus når høsting margen fra bare bakbena eller fra minst fire mus når også hip-, frambeina-, ryggvirvel kolonne bein, og sternum benyttes.
Gjør enkeltcellesuspensjoner fra benmarg og milt. En liten andel av benmargen brukes som den er, er de fleste vant til å kjøpe traktorify LSKs og differensierte myeloide stamceller, dvs. CMPS og granulocytisk / monocyttisk stamfedre (GMP) ved fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Isolasjon av benmargceller og FACS-rensing av disse bestandene er beskrevet andre steder 30-32. Omtrent seks uavhengige slags er pålagt å identifisere signifikante forskjeller i mutasjons frekvenser mellom populasjoner.
Den følgende protokoll for å måle den spontane in vivo mutant frekvens i rensede hematopoetiske subpopulasjoner er tilpasset fra flere Stratagene instruksjonsmanualer 33 til 35, basert på opprinnelige arbeid av Kohler et al. 18. De mest kritiske forskjeller mellom de eksisterende protokoller 33-35 og denne protokollen , kreves ved bruk av et relativt lite antall celler, omfatter forskjeller i volumer av reagenser og de tider og temperaturer som benyttes for proteinase K inkubasjon.
Etter oppsamling av de ønskede cellepopulasjoner, alikvoter celler i 1 ml sentrifugerør (for celletallet pr alikvot, se tabell 1). Sentrifuger ved 266 x g i 7 min, ved 4 ° C. Aspirer supernatanten forsiktig. Plasser rørene i flytende nitrogen i 5 min, og deretter overføre dem til en -80 ° C fryser for videre bruk. Prøvene kan lagres i minst 6 måneder.
2. Isolering av Genomisk DNA
- Ta prøvene fra -80 ° C fryser. Legg 500 pl iskald DNA lysis buffer (tabell 3) til prøverøret. Vortex rørene til 3-5 sek på middels hastighet, og plasser rørene på is i 10 min.
- Sentrifuger rør for 12 min, 4000 x g, 4 ° C. Forkaste nøye ~ 450 mL av supernatanten. Spinn ned i røret for 3-5 sek. Bruke et glass-kapillarrør å forsiktig fjerne den resterende del av den overliggende væske. Air-tørke innsiden av veggene tHan røret til det ikke lenger er synlige dråper (~ 2 min).
- Tilsett 2 mL av RNace-It ribonuklease cocktail og 10 pl av 1 M DTT til 100 ul av DNA-fordøyelse buffer (tabell 3). Juster volum i henhold til antallet prøver som skal behandles, 20 pl av denne DNA-fordøyelse løsning er nødvendig per prøve. Etter å legge 20 mL av dette til cellen pellet, prøve å gjøre pelleten løsrive seg fra bunnen, ved å banke forsiktig røret med fingeren eller en penn.
Merk: Det kan være vanskelig å se pelleten på grunn av lave celletall. - Legg 20 mL proteinase K-løsning * (Tabell 3) til hver prøve, veldig banke forsiktig på tuben igjen.
* Merk: proteinase K-løsning bør være varmet opp i en 50 ° C vannbad, 2 min før bruk for å aktivere enzymet. - Plasser røret umiddelbart i et 50 ° C vannbad. Fordøye prøven i henhold til retningslinjene i
- Klargjør DNA dialysesystemet i kjølerommet (fig. 2). Hell 600 ml TE-buffer (tabell 3) i et 600 ml begerglass, tilsett en liten magnetisk rørestav, slik at bufferen kan omrøres under dialyse og la (0,025 mM porestørrelse) membraner flyte på overflaten av bufferen. En membran per prøve, 1-4 membraner kan anvendes i en enkel dialysebegeret. Lag et merke på marginen av membranen med saks for identifikasjon av hver prøve.
- Etter den passende fordøyelse tid, tilsett nå svært viskøs genomisk DNA * nøye til sentrum av den flytende membranen (figur 2). Dekk begerglasset umiddelbart med aluminiumsfolie. Dialyser det genomiske DNA ved 4 ° C i ~ 16 til 20hr, røre bufferen forsiktig.
* Merk: Når du arbeider med viskøse DNA løsninger, bruker pipetter med en bred åpning. - Den neste dag helles 600 ml nylaget TE buffer (tabell 3) til en ren glassbeholder og overføre membranene til det nye beger med en skje meget omhyggelig, og dekker begerglasset med folie. Dialyser for en annen 2 hr.
- Fjern dialysemembran fra begeret med TE-buffer ved bruk av en skje og overføre bare de mest viskøse "klump" av DNA-løsningen på en ny, steril 1 ml tube. Oppbevar prøven ved 4 ° C. Fortsett mutagenesetest neste dag eller opp til 1,5 måneder senere. For de rensede populasjoner, vente minst en uke.
Tre. Utarbeidelse av Skåler for E. coli / Fag Kultur (Dag 1)
Hvert magasin inneholder to forskjellige lag, en agar sjikt på bunnen og en agarose lag på toppen som inneholder X-gal. Den E.coli / fag løsningen vil bli lagt til sistnevnte. Antallet og typen av celler isolert vil bestemme hvor mange skuffer som vil være nødvendig. Rådfør Tabell 1 for å beregne antall skuffer som trengs og påfølgende mengder av løsninger for denne delen av protokollen. Følgende vil generere ~ 60 skuffer, som en erfaren person kan behandle lett.
- Forbered følgende medier:
- for bunnlaget, forberede 6 x 2 L flasker med hver inneholder 1600 ml DDH 2 O. Legg NZY-pulver (21 g / L) og agar (15 g / L), bland godt.
- for det øverste laget, forberede 4 x 1 L kolber med hver inneholder 800 ml DDH 2 O. Legg NZY-pulver (21 g / L), og agarose (7,2 g / l), bland godt.
- for dyrking av E. coli, tilsett 2,5 g NZY pulver til hver av 2 x 250 ml kolber og bringe volumet til 100 ml med DDH 2 O;
- for bekreftelse skuffer som brukes i trinn 8, tilsett 8,4 g NZY pulver og 6 g agar til en 1 L kolbe og bringe volumet til 400 ml med DDH 2 O.
- Dekker åpningen av kolbene med aluminiumsfolie. Bland godt og autoklaveres dem ved 121 ° C, 15 psi i 30 min.
- Fjern kolber (veldig varmt!) Fra autoklaven. Nøye virvle kolbene å blande agar og agarose, deretter plassere dem i et 50 ° C vannbad. Når vannbadet har nådd 50 ° C igjen, helle fra de to L kolber (trinn 3.1.1) ~ 150 ml NZY agar i hver skuff (nederste lag).
- Tillat agaren til å størkne ved romtemperatur i minst 2 timer, og deretter inverteres og åpne skuffer. Plasser bunnen av brettene på lokket, 45 ° ut av midtstilling (fig. 3), og la det tørke i 30 min. Lukk skuffene og la O / N på RT.
- I mellomtiden forbereder SCS-8 E. coli kultur for neste dag. Fra den ene av de to 250 ml kolber * (trinn 3.1.3), ta 5 ml NZY buljong (tabell 3) og overføring til et sterilt 14 ml tube. Supplement med 62,5 mL av maltose / MgSO 4-løsning og tilsett 10 pl av SCS-8 E. coli glyserol lager. Inkuber ved 37 ° C i 3-4 timer under rysting ved 250 til 300 rpm. Bruk 15 pl av denne kultur til å inokulere 95 ml NZY buljong (i en 250 ml kolbe sidearm), kultur O / N ved 37 ° C i en rysteinkubator (250 til 300 rpm).
* Merk: den annen 250 ml kolbe kan brukes senere til å justere OD av kulturen om nødvendig (trinn 4.1) - Ta en L kolbe med agar (trinn 3.1.4), og hell ~ 6-7 ml NZY agar i 60 mm retter (dette vil være nok for ~ 50 retter, som trengs for trinn 8). Tillat agar å stivne (~ 10 min), deretter snu og pakk i plast. Disse retter kan holdes ved 4 ° C i opp til en måned.
4. Utarbeidelse av Skåler for E. coli / Fag Culture (Dag 2)
- Kontroller OD av SCS-8 E. coli kultur (trinn 3,5) på spektrofotometer.Juster OD 600 til 0,6 med NZY buljong (Tabell 3) (trinn 3.1.3), og plasser kolben på isen for å stoppe veksten og holde på is til det er klart til bruk. Dette vil bli brukt til trinn 6,3 og 8,2. Denne kulturen kan oppbevares i fem dager ved 4 ° C.
- Luft tørke alle analysebrett (strømmet dagen før) i ~ 5 timer (figur 3).
5. Pakking av Genomisk DNA (Dag 2; fortsettelse)
- Ta det nødvendige antall orange Trans rør under -80 ° C fryser og plassere dem på tørris inntil de er klare for bruk, tar en orange Trans rør for hvert emballasje reaksjon som skal utføres. Merk hvert rør på riktig måte. Har genomisk DNA-prøver (trinn 2.9) klar på is.
- Dette trinnet bør utføres en tube på tiden. Avslutt komplett steg før du går videre til neste DNA-prøve. Tine en oransje tube * note 1 raskt: bruk fingrene til det meste av den er tint, og deretter settepå is. Ta den tilsvarende genomisk DNA-prøve og umiddelbart overføre 8-12 mL prøve * note 2,3 til oransje tube. Bland innholdet ved å forsiktig pipettering opp og ned 3x, samt ved å banke forsiktig røret med fingeren. Prøv ikke å innføre bobler ved blanding. Plasser røret på et 30 ° C vannbad i 90 min.
* Note 1: en rask runde i en mikro kan være nødvendig å samle alt innhold fra innsiden av veggene og hetten.
* Note 2: volum av tilsatt prøven avhenger av antall celler som brukes til å generere at prøven: 11-12 ul av prøver fremstilt 2,0 til 5,0 x 10 5 celler, 10 pl av 1,0 x 10 6 celle-prøver, og 8 mL på 1,5 x 10 6 celle-prøver.
* Note 3: DNA er fortsatt svært viskøs, for å ta ut DNA, skyver pipettespiss til bunnen av prøverøret og nøye vri rundt spissen mot den indre veggen av røret. - Ta en eller to blå Trans tubes * ut -80 ° C fryser og plassere dem på tørr is inntil videre bruk. Tine dem raskt og overføre 12 ul til hver av de oransje rør. Bland oppløsningen ved forsiktig pipettering opp og ned tre ganger. Spinn røret ned for 2-3 sek, deretter på røret med fingeren for videre miksing og umiddelbart returnere det til 30 ° C vannbad i en annen 90 min.
* Merk: Bruk en blå tube for 5-6 reaksjoner og 2 blå rør for 10-12 reaksjoner. - Etter 90 min fortynnes hver reaksjon med 970 pl SM-buffer * (tabell 3) for å stoppe reaksjonen, og vortex på middels hastighet i 5 sek. Plasser rørene på is inntil videre bruk.
* Bemerk: Dersom antall celler er ≤ 5 x 10 5, bruker 500 pl SM-buffer (tabell 3) for å stoppe reaksjonen, to rør (av samme prøve) kan deretter kombineres senere (trinn 6.4).
6. Plating Pakket Genomisk DNA (Dag 2; fortsettelse)
- Lukk invertert agar tstråler som ble åpnet for tørking i morgen. Merke skuffer for hver prøve.
- Oppløs 4,8 g av X-gal i 16,8 ml N, N-dimetylformamid (som er nødvendig for trinn 6.5). Rør umiddelbart og sette på en shaker plattform. Beskytt mot lys. Oppløsningen skal være klar i 20-30 min.
- Delmengde SCS-8 E. coli-celler. For hvert sett med skuffer * Bruk en 50 ml konisk tube. Etiketten røret med navnet på det pakkede DNA-prøve. Tilsett 2 ml av E. coli suspensjon for hvert magasin.
* Merk: For eksempel 3 x 10 5 GMPs krever et sett med 8 skuffer (se tabell 1). Dermed to mengder, krever 8 x 2 = 16 skuffer. Hold alikvoter separere og derved klargjøre to 50 ml-rør, med hver 8 x 2 = 16 ml E. coli suspensjon. - Tilsett 1 ml * av pakket DNA-prøve (fra trinn 5.4) til den aktuelle 50 ml tube inneholder SCS-8 E. coli delmengde og bland godt. Inkuber denne E. coli / fag blandingen i en ristende inkubasjonerbator (250-300 rpm) ved 37 ° C i 23 min.
* Merk: Hvis DNA ble ekstrahert fra ≤ 5 x 10 5 celler, ble 500 mL av SM buffer brukes til å stoppe reaksjonen (trinn 5.4). På dette trinnet kan rørene bli kombinert og tilsatt til en 50 ml konisk rør. - Når E. coli / fag blandingen ruger, starter forberedelsene til toppen agarose laget. Tilsett 5 ml X-gal / N, N-dimetylformamid-oppløsning (trinn 6.2) til hver 800 ml kolbe av topplaget agarose-løsning (fra trinn 3.1.2, holdt ved 50 ° C). Endelig konsentrasjon av X-gal blir 1,5 mg / ml. X-gal kan utfelles litt når tilsatt til agarose. Swirl å oppløse X-gal og sette flasken tilbake i 50 ° C vannbad.
- Ta E. coli / phage blandingen ut av inkubatoren (trinn 6.4). Hver prøve krever flere skuffer, hver skuff, krever 50 ml X-gal/agarose løsning (trinn 6.5). Hell ønsket volum av X-gal/agarose for hver prøve (dvs. 50 ml xantall brett) i et større sterile plastflaske, og legge til riktig E. coli / fag blanding. Swirl flasken for å blande. Fordel blandingen i mengder på 45 til 50 ml i 50 ml koniske rør. Antallet rør bør være det samme som antall skuffer som kreves for den prøven.
Merk: left X-gal/agarose løsningen skal brukes i trinn 8.3. Løsningen kan bli lagret i en 50 ° C vannbad inntil videre bruk. - Hell 50 ml av topp agarose blandingen over den nederste halvdelen av analysebrettet. Raskt spre agarose ved å skråstille analysebrettet svakt i en retning.
Merk: agarose vil kjøle ned svært raskt og vil bli umulig å spre seg ut over hele skuffen. Derfor må dette trinnet utføres forholdsvis raskt og med agarose som har blitt holdt ved 50 ° C. - Tillat den øverste agarose for å herde i minst 15 min. Deretter, inverteres og åpne analysebrett for å la dem lufttørke i 30 minutter (figur 3). Lukk skuffene, ruge analyse skuffer inverterte (nederst agar lags side på toppen) ved 37 ° C i 15-16 timer. Ikke stable mer enn 5 skuffer.
7. Fastsettelse av en antatt Mutant Frequency (Dag 3)
- Fjern skuffene fra 37 ° C inkubator og la dem avkjøles. Tell gjennomskinnelig plakk forming units (PFU) på hver skuff, tilfeldig velge to steder på skuffene, tegne en firkant * på 2,5 x 2,5 cm 2 eller 5 x 5 cm 2 og telle alle PFUs i hver firkant med en merkecelleteller (fig. 4A, B).
* Merk: For å tegne plassen bruk en enhet som vist i Figur 5. Hvis antall telte PFUs er ≥ 40, bruker den mindre firkantet, ellers bruker du den store. - Ta gjennomsnittet av kvadratene telles og multipliser med 96 hvis telling med en mindre firkantet, eller multiplisere dette tallet med 24 hvis telling med det store. Legg antall PFUs telles for alle skuffer fra SAmeg prøve. Dette er det totale antall PFUs generert for den prøven.
- Deretter teller den muterte plaketter i hver skuff. Magasinene har nå kjøles ned, noe som vil bidra til å finne den muterte plaketter. For ytterligere å legge til rette for spotting de blå plaketter, flytte skuffen over en rød og / eller hvit overflate; ark med rødt og hvitt papir fungerer godt. Sirkle noen blå plakett med en sprittusj. Spill formen og intensiteten i den blå fargen på hver mutant (f.eks full, sirkel, sektor, figur 4C) 36,37.
- Bestem putative mutant frekvens for hver prøve ved å dividere antall mutant PFUs (trinn 7.3) med det totale antallet av PFUs (trinn 7.2).
8. Verifisering av Antatte Mutant Plaketter (Dag 3-5)
- Ved hjelp av en Pasteur pipette, kjernen hver mutant (blå) PFU og overføre pluggen inn i 250 mL sterilt SM buffer (Tabell 3). Legg 25 mL av kloroform, vortex i 5 sek end oppbevar ved 4 ° C for å fortsette neste dag eller la stå i to timer ved RT før du fortsetter med neste trinn, for å verifisere at den muterte PFU er faktisk en mutant. Prøvene lagres ved 4 ° C i minst ett år.
- Merke en 1 ml og en 4 ml sterilt rør for hver mutant som ble plugget. I det nye 1 ml tube, fortynnes resuspendert phage frigjøres fra agar pluggen (trinn 8.1) 1:50 i sterile SM-buffer (2 ul av prøven i 100 pl SM-buffer (tabell 3)), vortex kort, settes til side. Til 4 ml sterilt rør legge 200 mL SCS-8 E. coli kultur (fra trinn 4,1) og 2 pl av den fortynnede phage fra den tilsvarende 1 ml rør, inkubere ved 37 ° C i 5-10 min.
- Legg 2,5 ml av den øverste agarose som inneholder X-gal (venstre-over fra trinn 6.6) til hver 4 ml tube, swirl tube å blande og helle på en 60-mm NZY agar plate tidligere strømmet (trinn 3,6). Permisjon for 10 min (for å la tHan toppen agarose stivne), snu fatet og ruge O / N ved 37 ° C.
- Den neste morgen, fjerne fatet fra inkubatoren og bestemme hvor stor andel av blå PFUs på hver tallerken (figur 6). Når 70% eller mer av PFUs er blå, en mutant anses bekreftet 38,39. Kjerne mutant plakk fra fatet og satt i en 1,5 ml med skru tube, som inneholder 250 mL SM buffer (Tabell 3) og 25 mL kloroform, det er nå klar for sekvensering.
- Når 50% eller mindre av det PFU er blå, er det ikke ansett som en reell mutant 38,39. Når frekvensen av blått PFUs er mellom 60-70%, se tilbake med i notene om formen på plakk, hvis formen på PFU var "full", fortsette med sekvensering.
9. Sekvensering for Mutasjoner i Laci G ene
- Sett opp PCR reaksjoner i en 25 mL reaksjon volum, inkludert 1,5 μ, L av plakk supernatant (sjablon, trinn 8.4), den fremre primer SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 '), reversprimeren SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Bruk PCR extender Taq polymerase kit i henhold til produsentens instruksjoner. Sykkel betingelser er som følger: 94 ° C i 2 min, deretter 35 sykluser med 94 ° C i 20 sek, 60 ° C i 20 sek, 72 ° C i 2 min, fulgt av et slutt-trinn på 72 ° C i 5 min .
- Ta en 5 ul delmengde av hver reaksjon, og kjørt på en 0,8% agarose-gel, for å bekrefte forsterkning.
- Rydd opp PCR reaksjoner ved hjelp av Augencourt opprydding kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Quantitate Mal DNA.
- Bruk ~ 100 ng av PCR produkt som mal DNA for sekvensering. Sekvens amplicons i begge retninger ved hjelp av de samme PCR primere som sekvense primere (se ovenfor).
- Monter sekvenser og justere med Laci referansen sekvensen 40 å oppdage Mutations.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo mutagenesetest måler en sjelden hendelse (mutant PFUs) blant mange hendelser (alle PFUs). Ved å utføre analysen med et lite antall celler, er det mulig at resultatet blir betydelig påvirket av falske positive og falske negative resultater. For å løse dette problemet vi utført en seriell fortynning eksperiment med ufraksjonerte benmargceller, høstes fra tre forskjellige dyr. Vi målte mutant frekvens i benmarg hos disse dyr ved bruk av 1,4 x 10 6 7,0 x 10 5 3,5 x 10 5, og 1,75 x 10 5 celler. Resultatet (figur 7) viser et lineært forhold mellom inngangscelletallet og antallet PFU er generert. Viktigere er det muterte frekvens konsekvent, enten det måles med lave eller høye antall celler. Selv om det ikke direkte testet (på grunn av det sparsommelige celler), er det ingen grunn til å tro at dette ikke er tilfelle for LSKs og GMPs.
t "> Det viktigste skrittet i denne mutagenesetest er isolering av genomisk DNA (trinn 2). Selv om DNA-konsentrasjon bør ideelt sett være ≥ 500 ng / mL, denne protokollen fungerer godt med 40-150 ng / mL. Viktigere er på 260/280 forholdet (dette bør være> 1,8 til 2,0) og molekylvekt (bør være rundt 300 til 500 kb). anbefales når en ikke er kjent med assay for å kontrollere kvaliteten og størrelsen av det isolerte DNA . Figur 8 viser et eksempel på en elektroforese kjøring av høy molekylvekt-DNA.Markeringene av individuelle PFUs på et brett vist i Figur 4B utgjøre en rimelig og oppnåelig tetthet av plakk når man begynner med et lite antall rensede celler, et brett bør holde mellom 40-150 PFUs / liten firkant. I dette spesielle eksperiment, inneholder den lille plassen i figur 4B 103 plaques. Den andre plassen på brettet, som vises i øvre hjørne av Figur 4A 41, fordi vi bruker litt mindre brett og 12000 PFUs på disse skuffene ikke tillate oss et godt skille mellom individuelle plaketter.
Figur 4C viser eksempler på de forskjellige typer av blå plaques som kan observeres. I Laci mutagenesetest, er morfologi av plakk (dvs. full, sektor eller sirkel) en indikasjon på opprinnelsen av mutasjonen, fulle er en mutasjon fra mus opprinnelse, mens de to andre er trolig produsert i E. coli 36,37. Ved replating (se also Fig. 6), er nesten alle "full" plaques reprodusere> 70% blå plaques på nytt, mens bare en meget liten del av den sektor plaques gjøre og praktisk talt ingen av de ofte mindre, sirkulære plaques.
Tabell 2 viser reproduserbarheten av plakkdannelse med et relativt lite antall rensede celler sammenlignet med et høyt antall av benmargceller (den samme pool av celler hvor celler ble sortert fra) og miltceller.
Mutant PFUs er bekreftet, først ved replating (Figur 6 viser representative eksempler på retter for bekreftelse av primær mutant (blå) PFUs) og andre, ved sekvensering. Rettene i figur 6 som inneholder> 70% blå PFUs (to nederste) bekrefter at mutant oppsto i mus (og ikke i E. coli). Imidlertid viser øverst til venstre fatet ingen blå PFUs og derfor bør det primære PFU ikke regnes som mutant og Sequencing er ikke nødvendig. Retten fatet viser ~ 65% blå PFUs. Avhengig av formen av det primære plakk, vil denne prøven bli sendt ut for sekvensering (se trinn 8.4). Bare hvis en DNA mutasjon kan bekreftes ved sekvensering vil denne PFU bli regnet som mutant. Hvis du er usikker om formen på PFU, sekvens!
Figur 1. Sca-1 flekker på benmargceller fra villtype C57BL6 mus (B6), transgene Laci mus (Laci) og avkom av en krysning mellom disse to (B6 x Laci). Beinmargceller hos B6 mus uttrykke Sca- 1 på deres celleoverflate og denne egenskap benyttes til å rense stilk-og stamceller. Transgene Laci mus på en B6 bakgrunn, men ikke uttrykker Sca-en, og dette merket må ha gått tapt while etablere kolonien. Å gjeninnføre Sca-en inn i transgene Laci mus, ble disse musene krysset med vanlige B6 mus.
Figur 2. DNA dialysesystemet. Tre membraner som holder en viskøs DNA løsning i sentrum (farget blå for bedre visualisering) er flytende på TE buffer. De røde piler indikerer små hakk i membranen, som brukes for prøveidentifikasjon.
Figur 3. Effektiv måte å tørke 60 eller flere agar / agarose inneholder skuffer.
gether.within-page = "always"> 
Figur 4. Påvisning av plakk forming units (PFUs). Avbildet er (deler av) store agar skuffer (avbildet i figur 3) med primær kolonier av fag-smittet E. coli. (A) Vist er en hel plate med to små firkanter tegnet på det for telling plakk. Den røde innsatsen er vist forstørret i (B). (B) Hver enkelt sort tusj dot indikerer en klar villtype PFU på agarplate (103 totalt). (C) Ulike former av potensielt mutant PFUs. Klikk her for å se større bilde.
s/ftp_upload/50752/50752fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig5.jpg "/>
Figur 5. Pleksiglass telle firkanter. Avbildet er en liten og stor telling torget. De indre målinger av den store plassen er 5 cm x 5 cm, som av den lille firkanten 2,5 cm x 2,5 cm.
Figur 6. Bekreftelse av mutante plaque forming units (PFUs). Vist er 4 småretter inokulert dagen før med et fortynningsmiddel av en blå PFU. Den øvre venstre fatet viser ingen blå PFUs. Den øvre høyre rett viser ~ 65% blå PFUs. De to nederste skuffene viser 80-90% blå PFUs (til venstre) og 100% blått PFUs (til høyre). De røde pilene viser klart (villtype) PFUs.
re 7 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7.jpg "/>
Figur 7. Mutant frekvens i ufraksjonert benmarg. Avbildet er (A) antallet PFUs, (B) antall mutanter og (C) den mutante frekvensen målt i tre forskjellige dyr (24-26 måneder gamle), som er representert ved forskjellige farger. For hver mus, ble målingene utført på fire forskjellige eksempelstørrelser: 1.4 x 10 6, 7,0 x 10 5 3,5 x 10 5, og 1,75 x 10 5 celler. Dataene viser at i løpet av denne celle, utvalgsstørrelse ikke vesentlig påvirke muterte frekvensmålinger.
Figure åtte. Pulsed-feltet elektroforese av høy molekylvekt DNA-prøver isolert fra rensede celler. Genomisk DNA ble isolert som beskrevet i trinn 2 i protokollen og kjøre på en Bio-Rad (CHEF-DR III) system. De ulike prøvene lastet på gelen er DNA-prøver isolert fra leveren (Li, felt 1), benmargceller utarmet av modne avstamning + celler (LB, baner 2 og 14), CD34 + LSK-celler (L, felt 6), CMPS (baner 7-9), GMP (baner 11 og 12) og Sca-1 + celler (S, felt 15). Spor 4 inneholder stigen for høy molekylvekt-DNA. Bildet viser at det meste av DNA-er med høy molekylvekt (> 600 kb).
Tabell 1. Diverse parametre av renset populasjoner, hele benmarg og milt. Bruk denne tabellen er angitt i protokollen. For hver populasjon som er angitt på toppen, antall celler (10 x 5) per alikvot, DNA-fordøyelse gang, Volumet av DNA-prøveetter dialyse, blir antallet reaksjoner som kreves for hver prøve, og antall skuffer som kreves per aliquot indikert til venstre. Fordøyelsen ganger på 50 ° C er avgjørende for å lykkes med forsøket.
LSK = Lin - Sca-1 + Kit + + celler; CMP = engasjerte myeloid progenitor; GMP = granulocytisk / monocyttisk stamfar; WBM = (usortert) hele benmarg. Miltceller er usortert.
Tabell 2. Effektivitet av plakkdannelse er sammenlignbare mellom ulike cellepopulasjoner. Denne tabellen viser plakk dannelse blant de forskjellige populasjoner. Seks måneder gamle C57BL / 6 mus ble brukt for disse eksperimentene (lårben og tibiae på 10-11 mus per forsøk, seks eksperimenter totalt). Alle unntatt én av de bestander som brukes i disse forsøkene gave minst en, opp til 24, (bekreftet) mutant PFUs (Zhou et al., manuskript under utarbeidelse). PFU tallene kan variere per mus belastning.
LSK = Lin - Sca-1 + Kit + + celler; CMP = engasjerte myeloid progenitor; GMP = granulocytisk / monocyttisk stamfar; WBM = (usortert) hele benmarg * Miltceller er usortert.. SD = standardavvik.
Tabell 3. Instruksjoner for forberedelsene av flere reagenser.
§ Fra Stratagene bruksanvisningen for RecoverEase DNA Isolation Kit
¶ Fra Stratagene bruksanvisningen for Trans Emballasje Extract
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in vivo-mutagenese analysen beskrevet heri er basert på laci transgen musemodell som opprinnelig genereres av Kohler et al. 18. Modellen benytter en λ phage vektor som bærer en laci reporter gen. De to cos områder flankerer vektoren muliggjøre en relativt enkel utvinning og etterfølgende innpakking i infeksiøse fag-partikler, som brukes til å infisere E. coli. En blå plaque vil bli generert av fag-infiserte E. coli som inneholder en mutert Laci genet. Den blå plakett er satt opp mot en fargeløs bakgrunn, og dermed i stor grad forenkle oppgaven med mutant scoring. DNA-sekvenseringsteknikker kan brukes for å identifisere posisjonen og typen av mutasjon som har funnet sted, noe som kan bidra til ytterligere undersøkelser i mekanismene bak mutagenese.
Modifikasjonene vi gjort i protokollen fra dette mutagenesetest tillater en å bruke den med FACS-renset hematopoietic cellepopulasjoner. Imidlertid har vi funnet at en reproduserbar analyse fremdeles krever minst 2 x 10 5 hematopoetiske celler for å sikre at tilstrekkelige mengder av høy kvalitet DNA. Siden frekvensen av langsiktig repopulating HSCs er ekstremt lav 29, utføre en mutagenese analyse på disse HSCs er på dette punktet ikke er oppnåelig. Den stamcelle-beriket befolkningen vi bruker i denne protokollen, LSK celler, inneholder i tillegg til Flk-2 - langsiktige repopulating HSCs, også FLK-2 - kortsiktige repopulating HSCs og Flk-2 +-celler, som representerer multipotential stamfar celler (MPP) 42. Til tross for denne begrensningen føler vi at bruk av LSK celler som en lese-out for HSCs i denne mutagenesetest er rimelig siden det ble vist at LSK cellene oppfører seg mer som LSK-Flk-2 - HSCs i form av å utnytte NHEJ enn stamceller fem. Videre arbeid fra Rossi et al. 8 antyder at MPP er bedre i kopiering med DAMAGed DNA enn HSCs, spesielt når de blir eldre, fører oss til hypoteser om at antall mutanter funnet i LSK befolkningen reflekterer at av HSCs snarere enn MPP.
Siden små antall av sorterte cellene blir oppnådd ved hvert eksperiment, ved et viktig punkt vurdere ved planleggingen av dette in vivo-mutagenese assay, er prøvestørrelsen (dvs. det totale antall plaques pr prøve) er nødvendig for å oppnå statistisk signifikans. Med andre ord, når målet er å, for eksempel, sammenligne mutasjon hyppigheten av manipulerte LSK celler til villtype kontroll LSK celler, hvor mange plaketter totalt er nødvendig for hver LSK befolkningen til å oppdage en to eller tre ganger forskjell i mutasjon frekvens? Til opplysning kan det totale antall plaques kombineres fra alle forsøkene, da vi har funnet ingen signifikant forskjell mellom sorteringsforsøk, i det minste i villtype-celler, basert på en negativ binomial regresjonsanalyse 43.. Plakk numlemmer er viktig å vite fordi det vil avgjøre hvor mange av former som må utføres (~ 10 000 for WBM og GMPs og ~ 7000 for Spleen, LSKs og CMPS). Siden mutasjon frekvenser er liten i vill-type vev 44, er den normale tilnærmelse statistisk sammenligning av disse ikke er nøyaktige. Av denne grunn bruker vi Poisson-fordelingen, siden den er tilnærmet lik den sanne binomial fordeling (av mutasjonen frekvens) når denne frekvens er liten, og prøvestørrelsen er relativt stor, Huffman 45 gir en formel (Ligning 4) til å beregne prøvestørrelse basert på Poisson fordeling. Da gjaldt hypotetiske mutasjon frekvenser på 2,5, 4 og 7 mutasjoner per 100 000 celler i kontrollcellene 44, krever vi 456 949 plagene, 285 592 og 163 196, henholdsvis, for å oppdage en betydelig to-fold forskjell (to sample test med to tailed betydning på 0,05 og kraft 0,80). Færre plaketter er pålagt å påvise en tre-foldForskjellen: 122148, 76342, og 43 624, henholdsvis. Således er antallet plaques som kreves for hver populasjon av interesse (og således antall av former for å skaffe nok celler) er avhengig av den mutasjonsfrekvens som kan forventes i kontrollcellepopulasjon og den predikerte fold-endring i forhold populasjonen.
Det viktigste skrittet i denne mutagenesetest er isolering av genomisk DNA (trinn 2). Selv om det er viktig å starte denne protokollen med høy kvalitet DNA-prøver (se "representative resultater"), når du arbeider med sorterte celler, celle tall er ofte begrenset og kan ikke kastes bort på å bestemme DNA konsentrasjon eller størrelse. Vi har funnet at en god indikator for kvaliteten av DNA-prøven er dens viskositet, ved trinn 2.9 prøven bør være meget viskøs og vanskelig å arbeide med. Det krever litt øvelse å få dette trinnet riktig. Derfor anbefales det å trene protokollen med store celle tall, for eksempel med hele benmarg eller sortert Sca-1 + celler, og bli komfortabel med å isolere DNA fra disse prøvene og lære hvordan man skal bedømme kvaliteten på DNA ved sin viskositet.
Kvaliteten og størrelsen av DNA påvirker antallet PFUs generert. Når DNA-isoleringstrinnet perfeksjonert, er det neste viktig element optimalisere assay tettheten av PFUs per skuffen. Tabell 1 viser den anbefalte antall skuffer som skal brukes for hver type prøve som tilsvarer et optimalt antall celler for den prøven. Ved hjelp av disse retningslinjene bør resultere i skuffer der individuelle plaketter kan fortsatt bli preget, men er ikke spredt for tynt. Et brett bør holde mellom 40-120 PFUs per liten firkant; eksemplet vist i Figur 4B representerer en rimelig tetthet. Med disse optimaliserings aspekter utdrevet, er antall PFUs generert per prøve svært effektiv og reproduserbar (tabell 2).
"> Den laci transgen musemodell har blitt brukt sammen med en rekke andre vev, men ikke i forbindelse med forholdsvis små antall av høy-rene populasjoner. Når anvendt på andre (enn hematopoetiske) vev-bundne stamcelle-anrikede populasjoner, er det anbefalt å ta hensyn til den bestemte DNA isolert prosedyre,. de kan skille seg fra celletype til celle-type og innstilling til hematopoetiske celler trenger ikke nødvendigvis fungere for andre vev celletyper De kritiske faktorer, slik som mengden av reagenser, den temperatur ved hvilken det proteinase K fordøyelsen må finne sted og, viktigst av alt, vil det proteinase K fordøyelsen tid må utarbeides for hver celletype, denne protokollen kan tjene som et utgangspunkt.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke David R. Rodriguez, MA for grafisk design og fotografering i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) og Cancer Center Support Grant (P30CA054174) til UTHSCSA flowcytometrisystemer Kjerne anlegget og UTHSCSA Avansert nukleinsyrer Kjerne Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | ||
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 | |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 | |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 | |
| 0.025 mM Pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 Bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 | |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 | |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/Coulter | A63880 |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
- Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).
- Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).
- Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
- Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).
- Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).
- Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).
- Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).
- Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).
- Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).
- Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).
- Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).
- Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).
- Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).
- Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).
- Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).
- Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327 (1-2), 57-66 (1995).
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).
- Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).
- Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).
- Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).
- Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).
- Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).
- Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. , (2001).
- Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. , (2009).
- Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. , (1992).
- Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).
- Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
- Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).
- Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).
- de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).
- Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).
- Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).
- Hilbe, J. M. Negative Binomial Regression. second edn. , Cambridge University Press. (2011).
- de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).
- Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).
