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Immunology and Infection

शुद्ध hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में डीएनए म्यूटेशन की पहचान

Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/50752
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 4,5, 2, 2,5, 1,2,5
1Greehey Children's Cancer Research Institute, UT Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cellular and Structural Biology, UT Health Science Center at San Antonio, 3Department of Pathology, UT Health Science Center at San Antonio, 4Department of Microbiology, UT Health Science Center at San Antonio, 5Cancer Therapy and Research Center, UT Health Science Center at San Antonio

Summary

यहाँ हम Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग कर शुद्ध रक्त कोशिकाओं की कम संख्या के लिए एक Vivo में mutagenesis परख का वर्णन. Laci जीन डीएनए म्यूटेंट की आवृत्ति, स्थान, और प्रकार अनायास पैदा हुई या genotoxins से संपर्क के बाद निर्धारित करने के लिए अलग किया जा सकता है.

Abstract

हाल के वर्षों में, यह जीनोमिक अस्थिरता कसकर कई विकासात्मक विकारों, कैंसर, और उम्र बढ़ने से संबंधित है कि स्पष्ट हो गया है. स्टेम कोशिकाओं को जीवन भर ऊतक homeostasis और मरम्मत सुनिश्चित करने के लिए जिम्मेदार हैं कि यह देखते हुए, यह स्टेम सेल की आबादी के ऊतकों के जीनोमिक अखंडता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है कि परिकल्पना को उचित है. इसलिए, महत्वपूर्ण ब्याज स्टेम सेल आधारित रोगों के एटियलजि समझने के लिए लक्ष्य, जीनोमिक स्टेम कोशिकाओं में अखंडता और उनकी संतान पर अंतर्जात और पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का आकलन करने में उत्पन्न हो गई है.

Laci ट्रांसजेनिक चूहों Laci जीन उत्परिवर्तन पत्रकार के रूप में कार्य करता है जिसमें Laci संवाददाता प्रणाली, एन्कोडिंग एक वसूली λ फेज वेक्टर ले. एक उत्परिवर्तित Laci जीन का परिणाम है कि cleaves नीले यह अब एक वर्णजनीय सब्सट्रेट, β-galactosidase का उत्पादन होता है. Laci संवाददाता प्रणाली किए मैं हैस्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं सहित और आसानी से बरामद किया और बाद में ई. को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है n सभी कक्षों, कोलाई. संक्रमित ई. incubating के बाद सही सब्सट्रेट होता है कि agarose पर कोलाई, सजीले टुकड़े रन बनाए जा सकते हैं, स्पष्ट सजीले टुकड़े जंगली प्रकार बंदरगाह जबकि ब्लू प्लैक्स, एक उत्परिवर्ती Laci जीन का संकेत मिलता है. सजीले टुकड़े (स्पष्ट) के बीच में नीले रंग की आवृत्ति डीएनए से निकाला गया था मूल सेल की आबादी में उत्परिवर्ती आवृत्ति इंगित करता है. उत्परिवर्ती Laci जीन अनुक्रमण जीन में उत्परिवर्तन के स्थान और उत्परिवर्तन के प्रकार दिखाएगा.

Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल एक Vivo में mutagenesis परख के रूप में अच्छी तरह से स्थापित है. इसके अलावा, परख के लिए चूहों और अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. यहाँ हम इस मॉडल को अनायास स्टेम सेल समृद्ध लिन में डीएनए म्यूटेंट होने वाली की आवृत्ति को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे विस्तार से वर्णन - IL7R - SCA-1 + cKit + + (रासकश्मीर) कोशिकाओं और hematopoietic प्रणाली के अन्य subpopulations.

Introduction

सबसे ऊतकों में, विभेदित कोशिकाओं को एक सीमित जीवन काल है. कार्यात्मक अखंडता बनाए रखने के लिए, लंबे समय रहते, ऊतक विशेष स्टेम सेल लगातार बारी में है कि विशेष रूप से ऊतक के समारोह के लिए आवश्यक पूरी तरह से विभेदित कोशिकाओं को जन्म दे कि पूर्वज कोशिकाओं का उत्पादन. स्टेम कोशिकाओं को भी आत्म नवीकरण नामक एक प्रक्रिया के माध्यम से अपने स्वयं के डिब्बे की भरपाई होगी. इस प्रकार, स्टेम सेल वे इसलिए अंदर निवास ऊतक के कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं, यह वे क्षतिग्रस्त डीएनए भावना और संभावित सुधार के लिए मजबूत तंत्र से लैस हैं कि जरूरी है. यदि नहीं, तो वे अपनी संतान से विरासत में मिला जा सकता है जो कई जीनोमिक (संभवत: हानिकारक) perturbations, प्राप्त कर सकते हैं. स्टेम कोशिकाओं को एक जीव के जीवन काल के दौरान उनके जीनोम सुरक्षित गार्ड समझ कैसे एक महत्वपूर्ण सवाल है और जीनोमिक अस्थिरता कैंसर और (1,2 में समीक्षा) कुछ अन्य उम्र से संबंधित बीमारियों के साथ जुड़ा हुआ है यही कारण है हमें यह समझने में मदद कर सकते हैं.

3-6 में सीधे डीएनए की मरम्मत के कुछ प्रकार के उपाय संभव है कि प्रदर्शन किया है. यह उदाहरण के लिए hematopoietic प्रणाली में, डबल कतरा डीएनए को तोड़ता (NHEJ), बाद कम निष्ठा की मरम्मत की प्रक्रिया की जा रही है और बनाने के इस प्रकार खतरा बढ़ शामिल होने के मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) या गैर मुताबिक़ अंत तक ठीक हो सकता है, पाया गया कि त्रुटियों. दोनों hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) 4,5 में उपयोग किया जा रहा है, हालांकि, चूहों में यह जल्दी progenitors कोशिकाओं ऑफिस 4 का उपयोग जबकि यह HSCs में मुख्य रूप से NHEJ है लगता है. इसी प्रकार का एक अवलोकन त्वचा 6 में स्टेम कोशिकाओं के लिए बनाया गया था. दिलचस्प है, मानव HSCs ऑफिस में, नहीं NHEJ,डबल भूग्रस्त टूटता 3 के लिए पसंद की मरम्मत तंत्र हो रहा है. दो प्रजातियों के बीच इस कार्यात्मक अंतर वास्तविक है या महज एक तकनीकी या प्रयोगात्मक अंतर का प्रतिनिधित्व करता है चाहे देखने की बात है.

क्षतिग्रस्त डीएनए की मरम्मत के लिए एक स्टेम सेल के प्रदर्शनों की सूची इस तरह के आधार छांटना मरम्मत (हिट), न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत (एनईआर) और बेमेल मरम्मत (एमएमआर) जैसे अन्य डीएनए की मरम्मत तंत्र, शामिल होने की संभावना है. डीएनए की क्षति के इन प्रकार NHEJ या मानव संसाधन द्वारा मरम्मत नहीं की जा सकती, एमएमआर को हल करता आधार आधार बेमेल और सम्मिलन / विलोपन छोरों जबकि प्रासंगिकता और एनईआर, एकल असहाय डीएनए में एक या कई आधार जोड़ी घावों की मरम्मत के लिए जिम्मेदार हैं. इस समर्थन धारणा HSC डिब्बे 7-9 में इन रास्ते और असामान्यताएं में से एक में परिवर्तन के बीच एक कड़ी का प्रदर्शन hematopoietic प्रणाली है, साथ ही myelodysplastic सिंड्रोम 10-16, में निकलती है कि एक बीमारी के विकसित होने का एक बढ़ा जोखिम से कई अध्ययन कर रहे हैंHSC और उस बीमारी 17 प्रगति के रूप में जीनोमिक अस्थिरता में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है. अभी तक के रूप में, सीधे HSCs में हिट, एनईआर, और एमएमआर की माप की सूचना नहीं किया गया है.

एक यंत्रवत स्तर पर ऊतक अखंडता को नियंत्रित करने वाली विभिन्न प्रक्रियाओं elucidating के अलावा, यह इन प्रक्रियाओं में से एक में aberrations के परिणामों को आनुवंशिक रूप से बनाम सामान्य में जैसे, परीक्षण किया जा सकता है, ताकि उत्परिवर्तित डीएनए की सीमा को मापने के लिए सक्षम होने के लिए आवश्यक है इंजीनियर स्टेम सेल या युवा बनाम पुराने में. हालांकि, एक प्रासंगिक परख के विकास की वजह से ऊतक विशेष स्टेम कोशिकाओं की कमी और "stemness" को बरकरार रखता है कि संस्कृति की स्थिति की कमी की वजह से मुश्किल है. इसके अलावा, इस तरह के एक परख पर्यावरण और आनुवंशिक जोड़तोड़ को सुधारने योग्य होना चाहिए. इन सीमाओं और आवश्यकताओं के लिए एक संभव समाधान विशेष रूप से डीएनए उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए इंजीनियर हैं कि माउस मॉडल का इस्तेमाल होता है.

एमयूएलउत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए टिपल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, Laci ट्रांसजेनिक चूहों 18 Laci जीन लाख ऑपरेटर के एक शमन encodes और उत्परिवर्तन पत्रकार के रूप में कार्य करता है जिसमें Laci संवाददाता प्रणाली, एन्कोडिंग एक वसूली λ फेज वेक्टर ले. Laci जीन के उत्परिवर्तन होने पर, लाख ऑपरेटर सक्रिय है और β-galactosidase उत्पादन किया जाता है. β-galactosidase cleaves यह नीला पड़ जाता है जो वर्णजनीय सब्सट्रेट एक्स लड़की (5 ब्रोमो-4-क्लोरो ए indolyl-β-D-galactopyranoside),. Laci वेक्टर flanking क्योंकि साइटों लैम्ब्डा फेज प्रोटीन और ई. के बाद के संक्रमण से आसान वसूली की अनुमति देता है कोलाई. संक्रमित ई. incubating के बाद कोली एक्स लड़की सब्सट्रेट होता है कि agarose पर, सजीले टुकड़े रन बनाए जा सकते हैं. स्पष्ट सजीले टुकड़े गैर म्यूटेंट बंदरगाह जबकि ब्लू प्लैक्स, लाख, मैं फेज ले जाने के एक ख्यात उत्परिवर्ती होते हैं. वें के बीच ब्लू प्लैक्स की आवृत्ति (ई स्पष्ट वाले) डीएनए से निकाला गया था मूल सेल की आबादी में उत्परिवर्ती आवृत्ति इंगित करता है. इसके अलावा, Laci लक्ष्य की मेजबानी λ फेज आसानी से अपेक्षाकृत उच्च throughput विश्लेषण के लिए पीसीआर तकनीक का उपयोग कर अनुक्रम किया जा सकता. कई उत्परिवर्ती Laci जीन अनुक्रमण बारी में विशिष्ट डीएनए की मरम्मत रास्ते में संभव कमियों को या विशिष्ट genotoxic घटनाओं के लिए बात कर सकते हैं, जो उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम, के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का खुलासा करेंगे. Laci ट्रांसजेनिक प्रणाली कई प्रयोगशालाओं 19 के पार मानकीकृत किया गया है और अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. Laci प्रणाली का एक बड़ा नुकसान बड़े विलोपन या rearrangements पता लगाने के लिए सीमित क्षमता है, इसलिए मेटाफ़ेज़ फैलता है पर अन्य विधियों, जैसे बहु रंग मछली इस कमी तारीफ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

Laci माउस मॉडल की λ फेज वेक्टर के भीतर, एक बहुत छोटे जीन, सीआईआई है, उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए उपलब्ध. इसका आकार और म्यूटेंट चुना जा सकता है कि तथ्य यह Laci जीन विश्लेषण से एक कम श्रम प्रधान और सस्ता परख 20 में आता है. एक वर्णजनीय सब्सट्रेट 22-25 पर एक प्ररूपी प्रतिक्रिया उत्पन्न कि अमीनो एसिड के अवशेष का एक स्पष्ट समझ है कि वहाँ इतना हालांकि, Laci जीन अधिक बड़े पैमाने पर mutagenesis के 21 और परिवर्तन करने के लिए जीन की संवेदनशीलता के लिए अध्ययन किया है अच्छी तरह से बताया गया है.

उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए अन्य माउस मॉडल ΦX174 या lacZ transgenes का उपयोग शामिल है. टी → जी: मूल एक साथ ΦX174 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, सी प्रत्यावर्तन उत्परिवर्तन परख 26 या आधार जोड़ी प्रतिस्थापन की एक स्पेक्ट्रम का पता लगाने, Laci मॉडल की तुलना में एक कम महंगा प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है की अनुमति देता है कि आगे उत्परिवर्तन परख 27. हालांकि, आगे परख में उत्परिवर्तनीय स्क्रीन तुच्छ और उत्परिवर्तन कल्पना नहीं हैΦX174 transgene की Trum रूप Laci के रूप में अच्छी तरह से विशेषता नहीं है. LacZ transgenes ले जाने के माउस मॉडल में, lacZ उत्परिवर्तनीय संवाददाता ई. उपयोग बरामद galactose और galactose 28 युक्त मध्यम के प्रति संवेदनशील हैं कि कोलाई मेजबान कोशिकाओं. इस प्रणाली का एक दोष lacZ लक्ष्य की वसूली भी ई. के बंधाव और electroporation द्वारा पीछा प्रतिबंध endonuclease पाचन शामिल है कोली जिससे यह मुश्किल कोशिकाओं की कम संख्या के लिए प्रणाली अनुकूलन, जिससे मेजबान. यह स्टेम / पूर्वपुस्र्ष सेल आबादी के साथ काम करने के लिए एक परम आवश्यकता (एक हमेशा अधिक चूहों के साथ शुरू कर सकते हैं) नहीं है हालांकि कोशिकाओं की संख्या में (जैसे लाखों या अधिक) के लिए आवश्यक हैं, तो यह जल्दी से अव्यावहारिक और लागत निषेधात्मक बन जाएगा. एक संवेदनशील उत्परिवर्तनीय संवाददाता प्रदान करते हुए इसके अलावा, lacZ के अपेक्षाकृत बड़े आकार, बोझिल और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण और determ के लिए और अधिक महंगा हैउत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा की ination. इस मॉडल का एक बड़ा फायदा हालांकि, इसकी बड़ी विलोपन और सम्मिलन पता लगाने की क्षमता है, साथ ही गुणसूत्र rearrangements है.

Laci, ΦX174 और lacZ ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में सभी कक्षों संवाददाता प्रणाली ले जाने के बाद, इन माउस मॉडल के किसी भी रूप में वे मज़बूती से काटा जा सकता है, के रूप में स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं सहित, ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार में mutagenesis मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पर्याप्त संख्या में. हम Laci माउस मॉडल और Laci उत्परिवर्तन परख के साथ व्यापक अनुभव था, इसलिए हम hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष आबादी में mutagenesis के विश्लेषण के लिए आगे इस प्रणाली को आगे बढ़ाने का फैसला किया.

hematopoietic ऊतक लिन की अत्यंत दुर्लभ आबादी के रूप में पहचाने जाने योग्य हैं जो लंबी अवधि के repopulating स्टेम कोशिकाओं सहित अपनी व्यक्तिगत घटकों, की कोशिका की सतह phenotype के संदर्भ में अच्छी तरह से विशेषता है - IL7R + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - कोशिकाओं 29. . यह डीएनए की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए आता है जब कोशिकाओं को अभी भी HSCs के लिए अच्छा प्रतिनिधि हैं और सबसे आदिम प्रतिबद्ध माइलॉयड पूर्वज (सीएमपी) की आबादी से काफी अलग - Mohrin एट अल 4 LSK/Flk2 के थोड़ा बड़ा जनसंख्या का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, जब HSC समृद्ध LSK (FLK-2 + और ​​FLK-2 -) - IL7R - कोशिकाओं लिन की तुलना में थे Sca-1-cKit + + (रास कश्मीर पूर्वज कोशिकाओं), में एक महत्वपूर्ण अंतर अभी भी वहाँ था कम शुद्ध के बीच NHEJ क्षमता 5, सेल समृद्ध LSK आबादी और पूर्वज स्टेम कोशिकाओं. इस सेल नंबर बेहद मुश्किल है, हम कम से कम 2 x 10 5 कोशिकाओं इस mutagenesis परख में संगत, विश्वसनीय परिणाम के लिए आवश्यक हैं कि पाया क्योंकि कोशिकाओं - हमारे अध्ययन में हम LSK (FLK-2 + और ​​FLK -2) HSC समृद्ध उपयोगCD150 + CD48 आबादी या भी LSK/Flk2 - - जनसंख्या (चूहों, लागत और व्यावहारिकता के मामले में) एक LSK/Flk2 प्रकार जब प्राप्त करने के लिए. मूल रूप से Kohler एट अल. 18 द्वारा विकसित एक के आधार पर इस प्रोटोकॉल, सहज डीएनए उत्परिवर्ती आवृत्ति विभेदित माइलॉयड कोशिकाओं की आबादी के साथ ही unseparated अस्थि मज्जा और तिल्ली कोशिकाओं LSK कोशिकाओं में निर्धारित और परिभाषित किया जा सकता है कि कैसे विस्तार से वर्णन किया गया है.

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Protocol

एक C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर Laci ट्रांसजेनिक चूहों से leukocytes Sca -1 (चित्रा 1) व्यक्त नहीं करते. Sca -1 सेल शुद्धि के लिए इस्तेमाल एक मार्कर है, इसलिए, इन चूहों Sca -1 अभिव्यक्ति हासिल करने के लिए एक उचित तनाव के साथ पार कर जाने की जरूरत है, इस प्रोटोकॉल में नियमित C57BL / 6 (बी -6) चूहों और Laci के बीच एक क्रॉस की एफ 1 (C57BL / 6) ट्रांसजेनिक चूहों (Laci) (चित्रा 1) का इस्तेमाल किया गया था. इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता सेल आबादी की, LSKs और CMPs अस्थि मज्जा में सबसे छोटी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं. केवल hindlegs से या कम से कम चार चूहों से मज्जा कटाई जब कम से कम 2 प्रत्येक के x 10 5 / प्रकार, लगभग दस चूहों से मज्जा गठबंधन को शुद्ध करने के क्रम में जब भी कूल्हे, सामने पैर, कशेरुका स्तंभ हड्डियों, और उरोस्थि उपयोग किया जाता है.

अस्थि मज्जा और तिल्ली से एकल कक्ष निलंबन बनाओ. अस्थि मज्जा की एक छोटे से अनुपात के रूप में है, बहुमत पुर के लिए प्रयोग किया जाता है प्रयोग किया जाता हैछंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा LSKs और विभेदित माइलॉयड कोशिकाओं पूर्वज, यानी CMPs और granulocytic / monocytic progenitors (GMPs) Ify. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के अलगाव और इन आबादियों के FACS शुद्धि कहीं 30-32 में वर्णित है. लगभग छह स्वतंत्र प्रकार की आबादी के बीच उत्परिवर्तन आवृत्तियों में काफी अंतर की पहचान करने के लिए आवश्यक हैं.

शुद्ध रक्त subpopulations में सहज vivo में उत्परिवर्ती आवृत्ति को मापने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल Kohler एट अल. 18 से मूल कृति पर आधारित कई Stratagene अनुदेश मैनुअल 33-35, से अनुकूलित है मौजूदा प्रोटोकॉल 33-35 और इस प्रोटोकॉल के बीच सबसे महत्वपूर्ण मतभेद कक्षों की अपेक्षाकृत कम संख्या का उपयोग करते समय आवश्यक, अभिकर्मकों की मात्रा में अंतर और टाइम्स और proteinase कश्मीर ऊष्मायन के लिए प्रयोग किया जाता तापमान में शामिल हैं.

1 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में वांछित सेल आबादी, विभाज्य कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद (विभाज्य प्रति सेल नंबर के लिए, 1 टेबल देखें). 4 डिग्री सेल्सियस पर, 7 मिनट के लिए 266 XG पर अपकेंद्रित्र ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate. 5 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूब डाल दिया और फिर आगे उपयोग के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर को हस्तांतरण. नमूनों में कम से कम 6 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.

2. जीनोमिक डीएनए के अलगाव

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने लेने. नमूना ट्यूब को ठंडा डीएनए lysis बफर (तालिका 3) के 500 μl जोड़ें. भंवर मध्यम गति पर 3-5 सेकंड के लिए और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों की जगह ट्यूब.
  2. 12 मिनट के लिए ट्यूबों, 4000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र ध्यान ~ सतह पर तैरनेवाला के 450 μl त्यागें. 3-5 सेकंड के लिए ट्यूब स्पिन. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के शेष दूर करने के लिए एक गिलास केशिका ट्यूब का प्रयोग करें. टी के अंदर की दीवारों हवा शुष्कवह ट्यूब कोई बूंदों (~ 2 मिनट) अब और दिखाई दे रहे हैं जब तक.
  3. डीएनए पाचन बफर (तालिका 3) के 100 μl को RNace यह ribonuclease कॉकटेल के 2 μl और 1 एम डीटीटी के 10 μl जोड़ें. कार्रवाई की जाएगी कि नमूनों की संख्या के अनुसार मात्रा में समायोजित, यह डीएनए पाचन समाधान के 20 μl नमूना प्रति आवश्यक है. सेल गोली इस की 20 μl जोड़ने के बाद, गोली धीरे अपनी उंगली या एक कलम के साथ ट्यूब दोहन से, नीचे से खुद को अलग करने की कोशिश.
    नोट: यह क्योंकि कम सेल नंबर की गोली को देखने के लिए मुश्किल हो सकता है.
  4. बहुत धीरे फिर ट्यूब नल, प्रत्येक नमूने के 20 μl proteinase कश्मीर समाधान * (तालिका 3) जोड़ें.
    * नोट: proteinase कश्मीर समाधान के लिए एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गरम किया जाना चाहिए, 2 मिनट एंजाइम सक्रिय करने के लिए उपयोग करने से पहले.
  5. एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तुरंत ट्यूब रखें. में दिशा निर्देशों के अनुसार नमूना डाइजेस्ट नोट: कक्षों की ऐसी छोटी संख्या के साथ, नहाने के पानी के तापमान और पाचन बार सफलतापूर्वक उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से गंभीर हैं.
  6. ठंडे कमरे में डीएनए डायलिसिस प्रणाली (चित्रा 2) तैयार करें. , एक 600 मिलीलीटर कांच बीकर में 600 मिलीलीटर ते बफर (तालिका 3) डालो बफर डायलिसिस के दौरान हड़कंप मच किया जा सकता है तो एक छोटे चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ने के लिए और (0.025 मिमी आकार ताकना) झिल्ली बफर की सतह पर तैरने लगते करते हैं. नमूना प्रति एक झिल्ली, 1-4 झिल्ली एक भी डायलिसिस बीकर में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक नमूने की पहचान के लिए कैंची के साथ झिल्ली के मार्जिन पर एक निशान बना.
  7. उचित पाचन समय के बाद, अब बहुत चिपचिपा जीनोमिक डीएनए * ध्यान से चल झिल्ली के केंद्र के लिए (चित्रा 2) जोड़ें. तुरंत एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर कवर. ~ 16-20 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जीनोमिक डीएनए dialyzeघंटा, धीरे बफर हलचल.
    * नोट: चिपचिपा डीएनए समाधान के साथ काम करते हैं, एक व्यापक खोलने के साथ विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें.
  8. अगले दिन एक साफ ग्लास बीकर हौसले से तैयार ते बफर (तालिका 3) के 600 मिलीलीटर डालना और बहुत ध्यान से एक चम्मच के साथ नई बीकर झिल्ली हस्तांतरण, और पन्नी के साथ बीकर को कवर किया. एक और 2 घंटे के लिए dialyze.
  9. एक चम्मच का उपयोग ते बफर के साथ बीकर से डायलिसिस झिल्ली निकालें और एक नया, बाँझ 1 मिलीलीटर ट्यूब को डीएनए समाधान का ही सबसे चिपचिपा "पेड़ों का झुरमुट" हस्तांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर अगले दिन mutagenesis परख जारी या अप करने के लिए 1.5 महीने बाद. शुद्ध आबादी के लिए, कम से कम 1 सप्ताह प्रतीक्षा करें.

3. ई. के लिए ट्रे की तैयारी कोली / फेज संस्कृति दिवस (1)

प्रत्येक ट्रे दो अलग परतों में शामिल होंगे; तल पर एक अगर परत और एक्स लड़की शामिल है कि शीर्ष पर एक agarose परत. ई.कोली / फेज समाधान उत्तरार्द्ध में जोड़ दिया जाएगा. अलग कक्षों की संख्या और प्रकार की आवश्यकता होगी कितने ट्रे का निर्धारण करेगा. जरूरत ट्रे और प्रोटोकॉल के इस हिस्से के लिए समाधान के बाद राशियों की संख्या की गणना करने के लिए 1 टेबल से परामर्श करें. निम्नलिखित ~ एक अनुभवी व्यक्ति आसानी से कर सकते हैं प्रक्रिया जो 60 ट्रे, उत्पन्न होगा.

  1. निम्नलिखित मीडिया तैयार:
    1. नीचे की परत के लिए, प्रत्येक DDH 2 1600 मिलीलीटर ओ को रोकने के साथ 6 एक्स 2 एल बोतल तैयार NZY पाउडर (21 जी / एल) और अगर (15 जी / एल) जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से.
    2. ऊपर परत के लिए, प्रत्येक 800 मिलीलीटर DDH 2 ओ को रोकने के साथ 4 एक्स 1 एल बोतल तैयार NZY पाउडर (21 जी / एल) और agarose (7.2 छ / एल) जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से.
    3. ई. संवर्धन के लिए कोली, 2 एक्स 250 मिलीलीटर बोतल में से प्रत्येक के लिए NZY पाउडर के 2.5 ग्राम जोड़ने और DDH 2 हे के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा लाने;
    4. चरण 8 पर इस्तेमाल किया पुष्टि ट्रे के लिए, NZY पाउडर के 8.4 ग्राम और आगा की 6 ग्राम जोड़आर 1 एल कुप्पी और DDH 2 ओ के साथ 400 एमएल मात्रा लाओ
  2. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बोतल के उद्घाटन के कवर. अच्छी तरह मिक्स और 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई पर उन्हें आटोक्लेव.
  3. आटोक्लेव से (बहुत गर्म!) बोतल निकालें. ध्यान से अगर मिश्रण करने के लिए बोतल चक्कर आने और agarose, तब एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उन्हें जगह है. नहाने के पानी फिर 50 डिग्री सेल्सियस पर पहुंच गया है, ~ एल 2 बोतल (कदम 3.1.1) से प्रत्येक ट्रे (नीचे की परत) में NZY अगर की 150 मिलीलीटर डालना.
  4. फिर पलटना और ट्रे खोलने, अगर कम से कम 2 घंटे के लिए आरटी पर दृढ़ करने की अनुमति दें. ढक्कन पर ट्रे के नीचे रखें, 45 (चित्रा 3) केंद्र बंद ° और 30 मिनट के लिए सूखी. ट्रे को बंद करें और आर टी ओ / एन छोड़ दें.
  5. इस बीच, अनुसूचित जातियों -8 ई. तैयार अगले दिन के लिए कोलाई संस्कृति. दो 250 मिलीलीटर बोतल में से एक से * (कदम 3.1.3), 5 एमएल NZY शोरबा (तालिका 3) लेने के लिए और एक बाँझ 14 मीटर करने के लिए स्थानांतरणएल ट्यूब. 62.5 maltose / 4 MgSO समाधान के μl और अनुसूचित जातियों -8 ई. के 10 μl जोड़ने के साथ पूरक कोली ग्लिसरॉल स्टॉक. 250-300 rpm पर मिलाते हुए 3-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. एक मिलाते इनक्यूबेटर (250-300 आरपीएम) में 37 डिग्री सेल्सियस पर, (एक 250 मिलीलीटर sidearm कुप्पी में) संस्कृति हे / एन NZY शोरबा के 95 मिलीलीटर टीका लगाना करने के लिए इस संस्कृति के 15 μl का प्रयोग करें.
    * ध्यान दें: अन्य 250 मिलीलीटर कुप्पी यदि आवश्यक (4.1 कदम) संस्कृति के आयुध डिपो को समायोजित करने के लिए बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है
  6. अगर (कदम 3.1.4) के साथ 1 एल कुप्पी ले लो, और (इस चरण 8 के लिए आवश्यक ~ 50 व्यंजन, के लिए पर्याप्त होगा) 60 मिमी व्यंजन में NZY अगर की ~ 6-7 मिलीलीटर डालना. अगर (~ 10 मिनट) कड़ा करने की अनुमति दें, तो पलटना और प्लास्टिक में लपेट. ये बर्तन एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.

4. ई. के लिए ट्रे की तैयारी कोली / फेज संस्कृति (2 दिन)

  1. अनुसूचित जातियों -8 ई. के आयुध डिपो की जाँच करें स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर कोलाई संस्कृति (3.5 कदम).NZY शोरबा (तालिका 3) (कदम 3.1.3) के साथ 0.6 ओवर ड्राफ्ट 600 समायोजित करें, और वृद्धि को रोकने और उपयोग के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर रखने के लिए बर्फ पर कुप्पी जगह है. इस कदम 6.3 और 8.2 के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. इस संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए रखा जा सकता है
  2. एयर सब परख ट्रे सूखी ~ 5 घंटा (चित्रा 3) के लिए (पहले दिन डाला).

5. जीनोमिक डीएनए की पैकेजिंग (2 दिन, जारी)

  1. नारंगी Transpack की अपेक्षित संख्या लो बाहर ट्यूबों -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और उपयोग के लिए तैयार है जब तक सूखी बर्फ पर उन्हें जगह, प्रदर्शन किया जा करने के लिए प्रत्येक पैकेजिंग प्रतिक्रिया के लिए एक नारंगी Transpack ट्यूब ले. उचित रूप से प्रत्येक ट्यूब लेबल. बर्फ पर तैयार जीनोमिक डीएनए के नमूने (कदम 2.9) है.
  2. यह कदम समय में एक ट्यूब किया जाना चाहिए. अगले डीएनए नमूने पर जाने से पहले पूरा कदम खत्म करो. जल्दी से एक नारंगी ट्यूब * नोट 1 पिघलना: इसका सबसे thawed है जब तक अपनी उंगलियों का इस्तेमाल, फिर लगाबर्फ पर. इसी जीनोमिक डीएनए का नमूना लेने के लिए और तुरंत नारंगी ट्यूब 8-12 μl नमूना * नोट 2,3 हस्तांतरण. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 3x, साथ ही धीरे से अपनी उंगली से ट्यूब दोहन द्वारा द्वारा सामग्री मिलाएं. जब मिश्रण बुलबुले परिचय नहीं की कोशिश करें. 90 मिनट के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब रखें.
    * नोट 1: एक microcentrifuge में एक त्वरित स्पिन के अंदर की दीवारों से सभी सामग्री और टोपी इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
    * नोट 2:, 1.0 x 10 6 सेल के नमूने, और 8 μl के 10 μl 2.0-5.0 x 10 5 कोशिकाओं से तैयार नमूनों की 11-12 μl: जोड़ा नमूने की मात्रा है कि नमूना उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है 1.5 x 10 6 सेल नमूनों की.
    * नोट 3: डीएनए अभी भी बहुत चिपचिपा है, डीएनए बाहर ले नमूना ट्यूब के नीचे pipet टिप धक्का और ध्यान से ट्यूब की अंदरूनी दीवार के खिलाफ चारों ओर टिप मोड़ करने के लिए.
  3. 1 या 2 नीले Transpack तू ले लोbes -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर बाहर * और आगे उपयोग करें जब तक सूखी बर्फ पर उन्हें जगह है. उन्हें जल्दी से पिघलना और नारंगी ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए 12 μl हस्तांतरण. धीरे यह ऊपर और नीचे pipetting 3 बार द्वारा समाधान मिश्रण. फिर आगे की मिक्सिंग के लिए अपनी उंगली से ट्यूब नल और तुरंत एक और 90 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए यह वापसी, 2-3 सेकंड के लिए नीचे ट्यूब स्पिन.
    * नोट: 10-12 प्रतिक्रियाओं के लिए 5-6 प्रतिक्रियाओं और 2 नीले ट्यूब के लिए इस्तेमाल की 1 नीले ट्यूब.
  4. 90 मिनट के बाद 5 सेकंड के लिए मध्यम गति पर प्रतिक्रिया और भंवर को रोकने के लिए 970 μl एसएम बफर * (तालिका 3) के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया पतला. आगे उपयोग तक बर्फ पर ट्यूब डाल दिया.
    * नोट: कक्षों की संख्या ≤ 5 एक्स 10 5 है, तो प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 500 μl एसएम बफर (3 टेबल) का उपयोग करें, (एक ही नमूने के) 2 ट्यूबों तो (कदम 6.4) बाद में जोड़ा जा सकता है.

6. जीनोमिक डीएनए (; लगातर दिवस 2) डिब्बाबंद चढ़ाना

  1. उल्टे अगर टी बंद करेंसुबह में सुखाने के लिए खोल दिए गए थे कि किरणों. प्रत्येक नमूने के लिए ट्रे लेबल.
  2. एन के 16.8 मिलीलीटर में एक्स लड़की की 4.8 ग्राम भंग, एन dimethylformamide (कदम 6.5 के लिए आवश्यक). तुरंत हलचल और एक प्रकार के बरतन मंच पर डाल दिया. प्रकाश के खिलाफ की रक्षा करना. समाधान 20-30 मिनट में स्पष्ट होना चाहिए.
  3. अनुसूचित जातियों -8 ई. विभाज्य कोलाई कोशिकाओं. ट्रे के प्रत्येक सेट के लिए *, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें. पैक डीएनए नमूने के नाम के साथ ट्यूब लेबल. ई. के 2 मिलीलीटर जोड़ें प्रत्येक ट्रे के लिए कोलाई निलंबन.
    * नोट: उदाहरण के लिए 3 एक्स 10 5 GMPs 8 ट्रे का एक सेट (देखें तालिका 1) की आवश्यकता है. इस प्रकार, दो aliquots, 8 एक्स 2 = 16 ट्रे की आवश्यकता होती है. Aliquots प्रत्येक = 16 मिलीलीटर 8 एक्स 2 ई. के साथ, दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों को अलग है और इस तरह तैयार रखें कोली निलंबन.
  4. अनुसूचित जातियों -8 ई. युक्त उचित 50 मिलीलीटर ट्यूब (कदम 5.4 से) पैक डीएनए नमूने के 1 मिलीलीटर * जोड़ें कोली विभाज्य और अच्छी तरह मिला लें. इस ई. सेते एक मिलाते incu में कोली / फेज मिश्रणBator (250-300 आरपीएम), 23 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर.
    * नोट: डीएनए ≤ 5 x 10 5 कोशिकाओं से निकाला गया था, तो एस.एम. बफर के 500 μl प्रतिक्रिया (कदम 5.4) को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस चरण में, ट्यूब जोड़ा जा सकता है और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ा.
  5. जब ई. कोली / फेज मिश्रण शीर्ष agarose परत के लिए तैयारी शुरू, incubating है. एक्स लड़की / एन के 5 मिलीलीटर जोड़ें, ऊपर परत agarose समाधान के प्रत्येक 800 मिलीलीटर कुप्पी एन dimethylformamide समाधान (6.2 कदम) (कदम 3.1.2 से 50 डिग्री सेल्सियस पर रखा). एक्स लड़की के अंतिम एकाग्रता 1.5 मिलीग्राम / एमएल किया जाएगा. Agarose में जोड़ा जब एक्स लड़की एक छोटे से वेग सकता है. एक्स लड़की को भंग करने और वापस 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में बोतल डालने के लिए भंवर.
  6. ई. लो इनक्यूबेटर से बाहर कोलाई / फेज मिश्रण (6.4 कदम). प्रत्येक नमूना कई ट्रे की आवश्यकता है, प्रत्येक ट्रे, 50 मिलीलीटर X-gal/agarose समाधान (कदम 6.5) की आवश्यकता है. (यानी 50 मिलीलीटर एक्स प्रत्येक नमूने के लिए X-gal/agarose की मात्रा डालोट्रे की संख्या) एक बड़ा बाँझ प्लास्टिक की बोतल में और उचित ई. जोड़ कोली / फेज मिश्रण. मिश्रण करने के लिए बोतल भंवर. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 45-50 मिलीलीटर की aliquots में मिश्रण विभाजित करते हैं. ट्यूबों की संख्या कि नमूने के लिए आवश्यक ट्रे की संख्या के रूप में ही किया जाना चाहिए.
    नोट: बचे हुए X-gal/agarose समाधान कदम 8.3 में उपयोग किया जाएगा. समाधान आगे उपयोग करें जब तक एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में संग्रहित किया जा सकता है.
  7. परख ट्रे के नीचे आधा भर में शीर्ष agarose मिश्रण की 50 मिलीलीटर डालो. जल्दी से एक दिशा में थोड़ा परख ट्रे झुकने से agarose फैल गया.
    नोट: agarose बहुत जल्दी ठंडा हो जाएगा और ट्रे पर बाहर फैल करने के लिए असंभव हो जाएगा. इसलिए, इस चरण अपेक्षाकृत तेजी से और 50 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है कि agarose के साथ प्रदर्शन की जरूरत
  8. शीर्ष agarose कम से कम 15 मिनट के लिए कड़ा करने की अनुमति दें. फिर, पलटना और उन्हें हवा शुष्क 30 मिनट (चित्रा 3) के लिए जाने के लिए परख ट्रे खुला. , ट्रे को बंद 15-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस नीचे (अगर परत ओर शीर्ष पर) उल्टे परख ट्रे सेते हैं. अधिक से अधिक 5 ट्रे ढेर न करें.

7. एक ख्यात उत्परिवर्ती फ्रीक्वेंसी का निर्धारण (3 दिन)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से ट्रे निकालें और उन्हें शांत करते हैं. प्रत्येक ट्रे पर पारदर्शी पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) गिनती, बेतरतीब ढंग से, ट्रे पर 2 साइटों का चयन 2.5 x 2.5 सेमी 2 या 5 एक्स 5 सेमी 2 के एक वर्ग * आकर्षित और एक अंकन सेल काउंटर के साथ हर वर्ग के सभी PFUs गिनती (चित्रा -4 ए, बी).
    * नोट: चित्रा 5 में दिखाया गया है वर्ग उपयोग एक युक्ति आकर्षित करने के लिए. गिना PFUs की संख्या 40 ≥ किया जाता है, अन्यथा बड़ा उपयोग, छोटे वर्ग का उपयोग करें.
  2. गिना चौकों की औसत ले और एक छोटे वर्ग के साथ गिनती यदि 96 से गुना, या बड़े से एक साथ गिनती यदि 24 द्वारा इस संख्या को गुणा कर दें. PFUs की संख्या SA से सभी ट्रे के लिए गिना जोड़ेंमुझे नमूना. यह है कि नमूने के लिए उत्पन्न PFUs की कुल संख्या है.
  3. अगला, प्रत्येक ट्रे में उत्परिवर्ती सजीले टुकड़े गिनती. ट्रे अब उत्परिवर्ती सजीले टुकड़े का पता लगाने में मदद मिलेगी, जो नीचे ठंडा है. इसके अलावा, ब्लू प्लैक्स खोलना की सुविधा एक लाल और / या सफेद सतह पर ट्रे करने के लिए कदम, लाल और सफेद कागज के पत्र अच्छी तरह से काम करते हैं. एक मार्कर पेन के साथ किसी भी नीले रंग पट्टिका चक्र. 36,37, प्रत्येक उत्परिवर्ती के नीले रंग का आकार और तीव्रता (चित्रा 4C जैसे पूरा, चक्र, सेक्टर) रिकार्ड.
  4. PFUs की कुल संख्या (कदम 7.2) द्वारा उत्परिवर्ती PFUs की संख्या (कदम 7.3) विभाजित करके प्रत्येक नमूने के लिए ख्यात उत्परिवर्ती आवृत्ति निर्धारित करते हैं.

8. ख्यात उत्परिवर्ती सजीले दिवस (3-5) का सत्यापन

  1. एक पाश्चर पिपेट, कोर प्रत्येक उत्परिवर्ती (नीला) pfu का प्रयोग और 250 μl बाँझ एसएम बफर (तालिका 3) में प्लग हस्तांतरण. 5 सेकंड एक के लिए क्लोरोफॉर्म, भंवर के 25 μl जोड़ें4 डिग्री सेल्सियस पर डी दुकान अगले दिन जारी रखने या उत्परिवर्ती pfu वास्तव में एक उत्परिवर्ती है कि सत्यापित करने के लिए अगले कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले आरटी पर 2 घंटे के लिए छोड़ दें. नमूनों में कम से कम 1 वर्ष के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
  2. एक 1 मिलीग्राम और खामियों को दूर किया गया था कि प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए एक 4 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब लेबल. नई 1 मिलीलीटर ट्यूब में, अगर प्लग संक्षिप्त बाँझ एसएम बफर में (कदम 8.1) 1:50 (100 μl एसएम बफर (तालिका 3) में नमूना के 2 μl), भंवर, अलग सेट से जारी resuspended फेज पतला. 4 एमएल बाँझ ट्यूब अनुसूचित जातियों -8 ई. 200 μl जोड़ने कोली (4.1 कदम से) संस्कृति और संगत 1 मिलीलीटर ट्यूब से पतला फेज के 2 μl, 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. एक 60 मिमी NZY अगर प्लेट पर मिश्रण और डालना प्रत्येक 4 मिलीलीटर ट्यूब, ज़ुल्फ़ ट्यूब (कदम 6.6 से बाएं से अधिक) एक्स लड़की युक्त शीर्ष agarose के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें पहले चरण (3.6) डाला. 10 मिनट के लिए छोड़ दो (जाने के लिए टीवह शीर्ष agarose) जमना, पकवान पलटना और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते
  4. अगली सुबह, इनक्यूबेटर से पकवान हटाने और प्रत्येक पकवान पर नीले PFUs का अनुपात (चित्रा 6) निर्धारित करते हैं. PFUs का 70% या उससे अधिक नीला कर रहे हैं, एक उत्परिवर्ती 38,39 पुष्टि की माना जाता है. कोर उत्परिवर्ती पकवान से पट्टिका और एक 1.5 मिलीलीटर में डाल 250 μl एसएम बफर (तालिका 3) और 25 μl क्लोरोफॉर्म, जिसमें शीर्ष ट्यूब पेंच, यह अब अनुक्रमण के लिए तैयार है.
  5. Pfu का 50% या उससे कम नीला है, यह एक असली उत्परिवर्ती 38,39 नहीं माना जाता है. , Pfu का आकार "पूरा" था अगर अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ना, नीले PFUs की आवृत्ति 60-70% के बीच है, जब पट्टिका का आकार के बारे में नोट के साथ वापस जाँच करें.

9. Laci जी ene में परिवर्तन के लिए अनुक्रमण

  1. 1.5 μ सहित, एक 25 μl प्रतिक्रिया मात्रा में पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट अप; पट्टिका पर तैरनेवाला (टेम्पलेट, कदम 8.4) के एल, आगे प्राइमर SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT -3 ') और रिवर्स प्राइमर SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA -3'). निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर भरनेवाला Taq पोलीमरेज़ किट का प्रयोग करें. इस प्रकार के रूप साइकिल चालन की स्थिति इस प्रकार हैं: 94 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए, फिर 20 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 20 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के अंतिम चरण के द्वारा पीछा .
  2. प्रत्येक प्रतिक्रिया का एक 5 μl विभाज्य ले लो और एक 0.8% agarose जेल पर चलने, प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए.
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Augencourt सफाई किट का उपयोग पीसीआर प्रतिक्रियाओं को साफ.
  4. टेम्पलेट डीएनए quantitate.
  5. अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट के रूप में डीएनए पीसीआर उत्पाद के ~ 100 एनजी का प्रयोग करें. (ऊपर देखें) अनुक्रमण प्राइमरों के रूप में ही पीसीआर प्राइमरों का उपयोग दोनों दिशाओं में अनुक्रम amplicons.
  6. दृश्यों इकट्ठा और mutati पता लगाने के लिए Laci संदर्भ अनुक्रम 40 से तालमेलons.

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Representative Results

vivo में mutagenesis परख एक दुर्लभ घटना कई घटनाओं के बीच (उत्परिवर्ती PFUs) (सभी PFUs) के उपाय. कोशिकाओं की छोटी संख्या के साथ परख प्रदर्शन करके, यह परिणाम काफी सकारात्मक झूठे और झूठी नकारात्मक परिणामों से प्रभावित है कि संभव है. इस मुद्दे के समाधान के लिए हम तीन अलग जानवरों से काटा unfractionated अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के साथ एक धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रयोग किया. हम, 1.4 x 10 6, 7.0 x 10 5 का उपयोग कर इन जानवरों की अस्थि मज्जा में 3.5 x 10 5 उत्परिवर्ती आवृत्ति मापा, और 1.75 x 10 5 कोशिकाओं. परिणाम (चित्रा 7) इनपुट कक्ष संख्या और Pfu के उत्पन्न की संख्या के बीच एक रैखिक संबंध दिखाते हैं. महत्वपूर्ण बात है, उत्परिवर्ती आवृत्ति कोशिकाओं का कम या अधिक संख्या से मापा जाता है, चाहे संगत है. सीधे (कारण कोशिकाओं की कमी करने के लिए) का परीक्षण नहीं किया है, इस LSKs और GMPs के लिए ऐसा नहीं है कि विश्वास करने का कोई कारण नहीं है.

टी "> इस mutagenesis परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए एकाग्रता आदर्श 500 एनजी / μl ≥ जाना चाहिए हालांकि, इस प्रोटोकॉल 40-150 एनजी / μl के साथ अच्छी तरह से काम करता है. अधिक महत्वपूर्ण है. जीनोमिक डीएनए (चरण 2) का अलगाव है एक अलग डीएनए का आकार और गुणवत्ता की जांच परख से परिचित नहीं है जब 260/280 अनुपात (इस> 1.8-2.0 होना चाहिए) और आणविक वजन (लगभग 300-500 केबी) होना चाहिए. यह सिफारिश की है . चित्रा 8 उच्च आणविक वजन डीएनए की एक वैद्युतकणसंचलन रन की एक उदाहरण दिखाता है.

चित्रा 4 बी में दिखाया गया है एक ट्रे पर व्यक्तिगत PFUs के एक निशान के शुद्ध कोशिकाओं के एक छोटे समूह के साथ शुरू होता है जब सजीले टुकड़े की एक उचित और प्राप्त घनत्व प्रतिनिधित्व करते हैं, एक ट्रे 40-150 PFUs / छोटे वर्ग के बीच धारण करना चाहिए. यह विशेष रूप से प्रयोग में, 4B चित्रा में छोटे वर्ग 103 सजीले टुकड़े शामिल हैं. चित्रा -4 ए के ऊपरी कोने में दिखाया ट्रे पर अन्य वर्ग, 41 से सिफारिश 12,000 PFUs की तुलना में कम है.

चित्रा 4C मनाया जा सकता है कि ब्लू प्लैक्स के विभिन्न प्रकार के उदाहरण से पता चलता है. Laci mutagenesis परख में, सजीले टुकड़े (यानी पूर्ण, क्षेत्र या वृत्त) की आकारिकी उत्परिवर्तन की उत्पत्ति का एक संकेत है, पूर्ण माउस मूल से एक परिवर्तन है, अन्य दो की संभावना ई. में उत्पादित कर रहे हैं, जबकि कोली 36,37. Replating पर (ए एल एस देखनाओ चित्रा 6), लगभग सभी "पूरा" सजीले टुकड़े क्षेत्र सजीले टुकड़े के केवल एक बहुत छोटा सा हिस्सा है जबकि, फिर> 70% ब्लू प्लैक्स प्रतिलिपि और लगभग अक्सर छोटे, परिपत्र सजीले टुकड़े की नहीं.

तालिका 2 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की उच्च संख्या (कोशिकाओं से हल किया गया जहां कोशिकाओं का एक ही पूल) और तिल्ली कोशिकाओं के साथ उस की तुलना में शुद्ध कोशिकाओं की अपेक्षाकृत कम संख्या के साथ पट्टिका गठन के reproducibility से पता चलता है.

उत्परिवर्ती PFUs पहले replating से, इस बात की पुष्टि कर रहे हैं (चित्रा 6 प्राथमिक उत्परिवर्ती (नीला) PFUs की पुष्टि के लिए व्यंजन के प्रतिनिधि उदाहरणों से पता चलता है) और दूसरा, अनुक्रमण द्वारा. > 70% नीले PFUs (नीचे दो) युक्त चित्रा 6 में व्यंजन उत्परिवर्ती (और नहीं ई. कोलाई में) माउस में शुरु की पुष्टि करें. हालांकि, ऊपर छोड़ दिया पकवान कोई नीले PFUs से पता चलता है और इसलिए, प्राथमिक pfu के रूप में नहीं गिना जाना चाहिए उत्परिवर्ती और sequencing आवश्यक नहीं है. सही पकवान ~ 65% नीले PFUs से पता चलता है. प्राथमिक पट्टिका के आकार पर निर्भर करता है, यह नमूना (कदम 8.4 देखें) अनुक्रमण के लिए बाहर भेजा जाएगा. एक डीएनए उत्परिवर्तन अनुक्रमण से इसकी पुष्टि की जा सकती है तभी इस pfu उत्परिवर्ती के रूप में गिना जाएगा. Pfu के आकार के बारे में अनिश्चित हैं, तो अनुक्रम!

चित्रा 1
चित्रा 1. Sca -1 जंगली प्रकार C57BL6 चूहों (बी -6), ट्रांसजेनिक Laci चूहों (Laci) और बी -6 चूहों के इन दोनों (Laci एक्स -6). अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के बीच एक क्रॉस की संतानों से अस्थि मज्जा की कोशिकाओं पर धुंधला व्यक्त Sca- उनके कोशिका की सतह और इस विशेषता पर 1 स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक बी -6 पृष्ठभूमि पर ट्रांसजेनिक Laci चूहों, तथापि, एससीए -1 व्यक्त नहीं करते, इस मार्कर क खो गया होगाकॉलोनी की स्थापना इले. ट्रांसजेनिक Laci चूहों में Sca -1 reintroduce करने के लिए, इन चूहों नियमित बी -6 चूहों के साथ पार कर रहे थे.

चित्रा 2
चित्रा 2. डीएनए डायलिसिस प्रणाली. (बेहतर दृश्य के लिए नीले रंग का) केंद्र में एक चिपचिपा डीएनए समाधान पकड़े तीन झिल्ली ते बफर पर चल रहे हैं. लाल तीर नमूना पहचान के लिए उपयोग किया जाता है जो झिल्ली में छोटे nicks संकेत मिलता है.

चित्रा 3
60 या अधिक अगर / agarose युक्त ट्रे सुखाने के लिए चित्रा 3. कारगर तरीका.

gether.within पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 4
पट्टिका गठन इकाइयों का आंकड़ा 4. जांच (PFUs). चित्रित कर रहे फेज संक्रमित ई. के प्राथमिक कालोनियों के साथ (3 चित्र में दिखाया गया) बड़े अगर ट्रे (आंशिक) कोलाई. (ए) दिखाया सजीले टुकड़े गिनती के लिए उस पर खींचा 2 छोटे वर्गों के साथ एक पूरी थाली है. लाल डालने (बी) में बढ़े हुए दिखाया गया है. (ख) प्रत्येक व्यक्ति काला मार्कर डॉट अगर प्लेट (कुल 103) में एक स्पष्ट जंगली प्रकार pfu इंगित करता है. संभावित उत्परिवर्ती PFUs (सी) अलग अलग आकार. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 5. Plexiglas गिनती वर्गों. चित्रित एक छोटी और बड़ी गिनती वर्ग हैं. बड़े वर्ग की आंतरिक माप एक्स 5 सेमी 5 सेमी, छोटे वर्ग 2.5 सेमी x 2.5 सेमी की है कि कर रहे हैं.

चित्रा 6
उत्परिवर्ती पट्टिका गठन इकाइयों (PFUs) की चित्रा 6. पुष्टि. दिखाया 4 छोटे बर्तन एक नीले pfu की एक मंदक के साथ पहले दिन inoculated हैं. ऊपरी बाएँ पकवान कोई नीले PFUs से पता चलता है. ऊपरी सही पकवान ~ 65% नीले PFUs से पता चलता है. दो कम ट्रे 80-90% नीले PFUs (बाएं) और 100% नीले PFUs (दाएं) दिखा. लाल तीर स्पष्ट (जंगली प्रकार) PFUs संकेत मिलता है.

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Unfractionated अस्थि मज्जा में चित्रा 7. उत्परिवर्ती आवृत्ति. चित्रित (ए) PFUs की संख्या, (बी) म्यूटेंट की संख्या और (सी) (24-26 महीने पुरानी है) तीन अलग जानवरों में मापा उत्परिवर्ती आवृत्ति, प्रतिनिधित्व कर रहे हैं जो कर रहे हैं विभिन्न रंगों से. 1.4 x 10 6, 7.0 x 10 5, 3.5 x 10 5, और 1.75 x 10 5 कोशिकाओं: प्रत्येक माउस के लिए, माप चार अलग नमूना आकार पर प्रदर्शन किया गया. डेटा कोशिकाओं की इस सीमा के भीतर, नमूने का आकार काफी उत्परिवर्ती आवृत्ति माप को प्रभावित नहीं करता है.

8 चित्रा
अंजीरशुद्ध कोशिकाओं से अलग उच्च आणविक वजन डीएनए नमूनों की ure 8. स्पंदित क्षेत्र वैद्युतकणसंचलन. जीनोमिक डीएनए प्रोटोकॉल के चरण 2 में वर्णित के रूप में अलग और एक जैव रेड (महाराज डॉ तृतीय) सिस्टम पर चलाया गया था. (; लेन 1 ली), परिपक्व वंश + कोशिकाओं के समाप्त अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (पौंड, गलियों 2 और 14), CD34 + LSK कोशिकाओं (एल, 6 लेन), CMPs जेल पर लोड विभिन्न नमूने जिगर से अलग डीएनए नमूने हैं (गलियों 7-9), GMPs (गलियों 11 और 12) और एससीए -1 + कोशिकाओं (एस; लेन 15). लेन 4 उच्च आणविक वजन डीएनए के लिए सीढ़ी मानती है. तस्वीर डीएनए के बहुमत उच्च आणविक भार (> 600 KB) पता चलता है कि.

तालिका 1. शुद्ध किया आबादी के विविध नमूना पैरामीटर, पूरे अस्थि मज्जा और तिल्ली. प्रोटोकॉल में जहा पर इस तालिका का उपयोग. डीएनए नमूने का प्रत्येक आबादी शीर्ष पर संकेत के लिए, विभाज्य प्रति कोशिकाओं की संख्या (10 x 5), डीएनए पाचन समय, मात्राडायलिसिस के बाद, विभाज्य प्रति आवश्यक ट्रे में से प्रत्येक विभाज्य और संख्या के लिए आवश्यक प्रतिक्रियाओं की संख्या बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं. 50 डिग्री सेल्सियस पर पाचन बार प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं.

तालिका 1

LSK = लिन - SCA-1 + किट + + कोशिकाओं, सीएमपी = प्रतिबद्ध माइलॉयड पूर्वज, जीएमपी = monocytic / granulocytic पूर्वज; WBM = (unsorted) पूरे अस्थि मज्जा. तिल्ली कोशिकाओं unsorted कर रहे हैं.

तालिका 2. पट्टिका गठन की क्षमता अलग सेल आबादी के बीच बराबर है. इस तालिका में विभिन्न आबादी के बीच पट्टिका गठन से पता चलता है. छह महीने की उम्र C57BL 6 / चूहों इन प्रयोगों (femurs और प्रयोग के प्रति 10-11 चूहों की tibiae, कुल 6 प्रयोगों) के लिए इस्तेमाल किया गया. इन प्रयोगों गा में इस्तेमाल आबादी में से एक है लेकिन सभीकम से कम (पुष्टि) 24 से 1,, उत्परिवर्ती PFUs (तैयारी में झोउ एट अल., पांडुलिपि) कर दिया है. Pfu संख्या माउस तनाव प्रति भिन्न हो सकते हैं.

तालिका 2

LSK = लिन - SCA-1 + किट + + कोशिकाओं, सीएमपी = प्रतिबद्ध माइलॉयड पूर्वज, जीएमपी = monocytic / granulocytic पूर्वज; WBM = (unsorted) पूरे अस्थि मज्जा * तिल्ली कोशिकाओं unsorted हैं.. एसडी = मानक विचलन.

तालिका 3. अतिरिक्त अभिकर्मकों की तैयारी के लिए निर्देश.

तालिका 3

RecoverEase डीएनए अलगाव किट की Stratagene निर्देश पुस्तिका से §

¶ Transpack पैकेजिंग निकालें के Stratagene निर्देश पुस्तिका से

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Discussion

यहाँ बताया vivo में mutagenesis परख मूल रूप से Kohler एट अल. 18 यह मॉडल एक Laci पत्रकार जीन ले एक λ फेज वेक्टर इस्तेमाल से उत्पन्न Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पर आधारित है. वेक्टर संक्रामक फेज कणों में एक अपेक्षाकृत सरल वसूली और बाद में पैकेजिंग के लिए अनुमति flanking दो क्योंकि साइटों, ई. संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया कोलाई. एक नीले रंग पट्टिका फेज संक्रमित ई. द्वारा उत्पन्न हो जाएगा एक उत्परिवर्तित Laci जीन होते हैं कि कोलाई. नीले रंग पट्टिका इस प्रकार बहुत उत्परिवर्ती स्कोरिंग का कार्य सरल बनाने, एक बेरंग पृष्ठभूमि के खिलाफ सेट है. डीएनए अनुक्रमण तकनीक mutagenesis के अंतर्निहित तंत्र में आगे की जांच में मदद मिल सकती है, जो घटित हुआ है कि उत्परिवर्तन की स्थिति और प्रकार, की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हम इस mutagenesis परख के प्रोटोकॉल में किए गए संशोधनों से एक FACS शुद्ध hematopoie साथ इसका इस्तेमाल करने की अनुमतिटिक सेल आबादी. हालांकि, हम एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण अभी भी उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 2 एक्स 10 5 hematopoietic कोशिकाओं की आवश्यकता है कि पाया. HSCs repopulating लंबी अवधि की आवृत्ति इन HSCs पर एक mutagenesis के विश्लेषण के प्रदर्शन, 29 बेहद कम है के बाद से इस बिंदु पर प्राप्त नहीं है. हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग स्टेम सेल समृद्ध आबादी, LSK कोशिकाओं, FLK-2 के अलावा शामिल हैं - multipotential पूर्वज का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अल्पकालिक repopulating HSCs और FLK-2 + कोशिकाओं, - लंबी अवधि के repopulating HSCs, भी FLK-2 कोशिकाओं (MPPS) 42. HSCs NHEJ के उपयोग के मामले में पूर्वज कोशिकाओं की तुलना में 5 - इस सीमा के बावजूद हम यह LSK कोशिकाओं को और अधिक LSK-FLK-2 की तरह व्यवहार करते दिखाया गया था कि क्योंकि इस mutagenesis परख में HSCs के लिए बाहर पढ़ने के रूप में LSK कोशिकाओं का उपयोग उचित है कि लग रहा है. इसके अलावा, रॉसी एट अल. 8 से काम MPPS damag साथ नकल में बेहतर कर रहे हैं पता चलता है किवे उम्र, खासकर जब HSCs से एड डीएनए, परिकल्पना के लिए हमें प्रमुख LSK आबादी में पाया म्यूटेंट की संख्या नहीं बल्कि MPPS से HSCs की है कि दर्शाता है.

क्रमबद्ध कोशिकाओं की कम संख्या प्रत्येक प्रयोग में प्राप्त कर रहे हैं, एक महत्वपूर्ण मुद्दा सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए, इस में विवो mutagenesis के परख की योजना बनाने के स्तर पर विचार करना आवश्यक (नमूना प्रति सजीले टुकड़े की कुल संख्या आईई) नमूने का आकार है. लक्ष्य, उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार नियंत्रण LSK कोशिकाओं के लिए चालाकी से LSK कोशिकाओं के उत्परिवर्तन आवृत्ति की तुलना है जब दूसरे शब्दों में, कितने सजीले टुकड़े में कुल में एक दो या तीन गुना अंतर का पता लगाने के लिए प्रत्येक LSK आबादी के लिए आवश्यक हैं उत्परिवर्तन आवृत्ति? हम एक नकारात्मक द्विपद प्रतिगमन विश्लेषण 43 के आधार पर कम से कम जंगली प्रकार की कोशिकाओं में छँटाई प्रयोगों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया गया के बाद से ध्यान से, सजीले टुकड़े की कुल संख्या, सभी प्रयोगों से जोड़ा जा सकता है. फलक संख्याBers कि (प्लीहा, LSKs और CMPs के लिए डब्ल्यूबीएम और GMPs के लिए ~ 10,000 और ~ 7000) निष्पादित करने की जरूरत है कि एक तरह की संख्या का निर्धारण करेगा क्योंकि पता करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. उत्परिवर्तन आवृत्तियों जंगली प्रकार के ऊतकों 44 में छोटे होते हैं, सांख्यिकीय इन की तुलना सामान्य सन्निकटन सही नहीं है. कि आवृत्ति छोटा है और नमूने का आकार बड़ा रिश्तेदार है जब यह (उत्परिवर्तन आवृत्ति का) सही द्विपद वितरण approximates के बाद से इस कारण से, हम, पायसन बंटन का उपयोग करें, Huffman 45 आधार नमूना आकार की गणना करने के लिए सूत्र (समीकरण 4) प्रदान करता है पायसन बंटन पर. काल्पनिक उत्परिवर्तन 2.5 की आवृत्तियों, 4, और नियंत्रण कक्षों 44 में 100,000 कोशिकाओं प्रति 7 म्यूटेशन के लिए आवेदन किया है, हम दो पूंछ महत्व के साथ एक महत्वपूर्ण दो गुना अंतर (दो नमूने के परीक्षण का पता लगाने के लिए, क्रमश: 456,949 विपत्तियों, 285,592 और 163,196 आवश्यकता 0.80 से 0.05 और बिजली की). कम सजीले टुकड़े तीन गुना का पता लगाने के लिए आवश्यक हैंफर्क: 122148, 76342, और क्रमश: 43,624,. इस प्रकार, ब्याज की प्रत्येक जनसंख्या (और इस प्रकार पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए जरूरी प्रकार की संख्या) के लिए आवश्यक सजीले टुकड़े की संख्या पर नियंत्रण सेल आबादी और तुलना आबादी में भविष्यवाणी गुना परिवर्तन में उम्मीद की जा सकती है कि उत्परिवर्तन आवृत्ति पर निर्भर करता है.

इस mutagenesis परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम जीनोमिक डीएनए (चरण 2) का अलगाव है. यह ("प्रतिनिधि परिणाम" देखें) उच्च गुणवत्ता डीएनए नमूनों के साथ इस प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए आवश्यक है छांटी गई कोशिकाओं के साथ काम करते हैं,, सेल नंबर अक्सर सीमित हैं और डीएनए एकाग्रता या आकार का निर्धारण करने पर बर्बाद नहीं किया जा सकता. कदम 2.9 पर नमूना बेहद चिपचिपा और साथ काम करना मुश्किल हो सकता है, हम डीएनए नमूने की गुणवत्ता के लिए एक और अच्छा संकेत अपनी चिपचिपापन है कि पाया. यह इस कदम को सही पाने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता है. इसलिए, यह जैसे बड़े सेल नंबर के साथ प्रोटोकॉल बाहर काम करने के लिए सिफारिश की है पूरे अस्थि मज्जा या क्रमबद्ध Sca -1 + कोशिकाओं, और इन नमूनों से डीएनए अलग से आराम मिलता है और इसकी चिपचिपाहट से डीएनए की गुणवत्ता न्यायाधीश करने के लिए सीखने के साथ.

डीएनए की गुणवत्ता और आकार उत्पन्न PFUs की संख्या को प्रभावित करता है. डीएनए अलगाव कदम सिद्ध किया जाता है, परख के अनुकूलन के अगले महत्वपूर्ण तत्व ट्रे प्रति PFUs का घनत्व है. तालिका 1 ट्रे की सिफारिश की संख्या कि नमूने के लिए कोशिकाओं का एक इष्टतम संख्या को इसी नमूने के प्रत्येक प्रकार के लिए उपयोग करने के लिए पता चलता है. इस निर्देश का उपयोग करने वाले सजीले टुकड़े अभी भी प्रतिष्ठित किया जा सकता है, अभी तक भी फैल पतली नहीं कर रहे हैं, जहां ट्रे में परिणाम चाहिए. एक ट्रे छोटे वर्ग प्रति 40-120 PFUs के बीच धारण करना चाहिए, चित्रा 4 बी में दिखाया गया है उदाहरण के लिए एक उचित घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है. इन अनुकूलन पहलुओं बाहर काम के साथ, नमूना प्रति उत्पन्न PFUs की संख्या अत्यधिक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (तालिका 2).

"> Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल अन्य ऊतकों की एक किस्म के साथ प्रयोग किया गया है, लेकिन दूसरे के लिए आवेदन किया है उच्च शुद्ध आबादी की अपेक्षाकृत कम संख्या के साथ संयोजन के रूप में. (Hematopoietic से) ऊतक प्रतिबंधित स्टेम सेल समृद्ध आबादी है, यह अनुशंसा की जाती है नहीं डीएनए अलगाव की प्रक्रिया के लिए विशेष ध्यान देना;. वे सेल का प्रकार सेल प्रकार से अलग हो सकता है और hematopoietic कोशिकाओं के लिए सिफारिश जरूरी अन्य ऊतक प्रकार की कोशिकाओं के लिए काम नहीं कर सकते ऐसे अभिकर्मकों की राशि, तापमान के रूप में महत्वपूर्ण कारक है, जिस पर proteinase कश्मीर पाचन जगह लेने के लिए और सबसे महत्वपूर्ण, proteinase कश्मीर पाचन समय प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए बाहर काम करने की आवश्यकता होगी की जरूरत है, इस प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि में ग्राफिक डिजाइन और फोटोग्राफी के लिए डेविड आर रोड्रिगेज, एमए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम UTHSCSA फ्लो कोर सुविधा और UTHSCSA उन्नत न्यूक्लिक एसिड कोर सुविधा के लिए GCCRI, एनआईएच / एनआईए (5R21AG033339) और कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (P30CA054174) से धन के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LacI transgenic mice  BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail Agilent Technologies (Stratagene) 720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli Agilent Technologies (Stratagene) 200221
DNA size standards – lambda ladder Bio Rad 170-3635
0.025 mM Pore size membranes  Fisher (Millipore) VSWP 025 00
245 mm2 Bioassay dishes (trays)  Fisher (Corning) 07-200-600
NZY broth (powder) Fisher (Teknova) N1144
Agar Fisher BP1423-500
Agarose Fisher E-3120-500
N,N-Dimethylformamide Fisher AC34843-5000
X-gal Research Products Intl Corp (RPI) B71800-10.0
Proteinase K Roche 3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit 5 PRIME 2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit Beckman/Coulter A63880

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संक्रमण अंक 84, hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, डीएनए उत्परिवर्तन,
शुद्ध hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में डीएनए म्यूटेशन की पहचान
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Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A.,… More

Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A., Prihoda, T. J., Wickes, B. L., Xu, G., Walter, C. A., Rebel, V. I. Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (84), e50752, doi:10.3791/50752 (2014).

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