Summary
ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。
Abstract
近年では、ゲノム不安定性がしっかり多くの発達障害、癌、および加齢に関連していることが明らかになった。幹細胞は生涯を通じて組織の恒常性および修復を確実にする責任があることを考えれば、幹細胞集団は、組織のゲノムの完全性を維持するために重要であると仮定することは妥当である。そのため、重要な関心は、幹細胞ベースの疾患の病因を理解することを目指し、幹細胞およびその子孫ゲノムの完全性に関する内因性および環境要因の影響を評価する際に生じている。
LacIリトランスジェニックマウスは、LacIリ遺伝子が変異レポーターとして機能するLacIリレポーター系をコードする回復可能なλファージベクターを運ぶ。変異したlacI遺伝子の結果は青に回し、切断する発色基質のβ-ガラクトシダーゼの製造である。 LacIリレポーター系は、iを搭載してnの全ての幹/前駆細胞を含む細胞、および容易に回収し、続いてE.を感染させるために使用することができる大腸菌 。感染したEをインキュベートした後正しい基質を含むアガロース上で大腸菌は 、プラークをスコアすることができ、明確なプラークが野生型を保有しながら、青いプラークは、変異型lacI遺伝子を示している。プラーク（クリア間の）青色の周波数は、DNAがより抽出された元の細胞集団における突然変異頻度を示す。変異型lacI遺伝子の配列を決定することは遺伝子の変異の位置および変異の種類が表示されます。
LacIリトランスジェニックマウスモデルは、in vivo変異導入アッセイとして十分に確立されている。また、アッセイのためのマウスおよび試薬は、市販されている。ここでは、このモデルを自発的に幹細胞富化林におけるDNA突然変異体を天然の周波数を測定するように構成することができる方法を詳細に説明する- IL7R -のSca-1 +するcKit + +（LSK）細胞および造血系の他の部分集団。
Introduction
ほとんどの組織では、分化した細胞は、限られた寿命を持っている。機能的完全性を維持するために、長寿命の、組織特異的幹細胞は、連続的に順番に、その特定の組織の機能に必要な完全に分化した細胞を生じる前駆細胞を産生する。幹細胞は、自己複製と呼ばれるプロセスを通じて、自分の区画を補充する。このように、幹細胞は、彼らがそのためインチ常駐組織の機能的完全性を維持する責任があり、それは彼らが損傷を受けたDNAを検出し、潜在的に修復するために、堅牢なメカニズムが装備されていることが不可欠です。そうでなければ、彼らは彼らの子孫によって継承できる複数のゲノム（潜在的に有害な）摂動を、取得することができる。幹細胞は、生物の寿命の間に彼らのゲノムをセーフガードする方法を理解することは重要な問題であり、ゲノムの不安定性は、癌および（1,2に概説されている）他のいくつかの加齢に伴う疾患にリンクされている理由を私たちが理解するのに役立つことがあります。
3-6の直接DNA修復の特定のタイプを測定することが可能であることを実証した。なお、後者は低い忠実度および製造従ってリスク増加の修復プロセスであり、造血系において、例えば、二本鎖DNAの切断が相同組換え（HR）又は非相同末端結合（NHEJ）によって修復することができることが見出されたエラーが。両方が、造血幹細胞（HSC）4,5に利用されているが、マウスにおいて、早期前駆細胞がHR 4を利用し 、一方、それは造血幹細胞で主にNHEJであると思われる。同様の観察は、皮膚6中の幹細胞のために作られました。興味深いことに、ヒトHSC人事ではないNHEJにおいて、二本鎖切断3のための選択の修復機構であると思われる。 2種間のこの機能的な違いは本物であるか、単に技術的または実験の差を表しているかどうかは、見守らなければならない。
損傷を受けたDNAを修復する幹細胞のレパートリーは、例えば、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）およびミスマッチ修復（MMR）のような他のDNA修復機構を含む可能性がある。 MMR修正塩基塩基ミスマッチ、挿入/欠失ループながらBERとNERは、一本鎖DNAに、単一または複数の塩基対の病変を修復するための責任であり、DNA損傷のこれらのタイプは、NHEJまたはHRによって修復することができない。この概念をサポートすることは、HSCコンパートメント7-9に、これらの経路の1の変化と異常の間のリンクを示す造血系だけでなく、骨髄異形成症候群10月16日の発症リスクの増加に起因する疾患からのいくつかの研究であるHSCは、その疾患が進行するにつれて17ゲノム不安定性を増大と関連している。まだ今のように、造血幹細胞を直接、BER、NER、およびMMRの測定が報告されていない。
機構的レベルでの組織の完全性を制御する様々なプロセスを解明することに加えて、これらのプロセスのいずれかの収差の影響が遺伝子対正常に、例えば 、試験することができるように、突然変異したDNAの程度を測定することができることが不可欠である幹細胞を操作または若いに対する古い中。しかし、関連アッセイの開発が原因組織特異的幹細胞の不足および「幹細胞性」を維持し、培養条件の欠如のために困難である。さらに、そのようなアッセイは、環境や遺伝子操作に修正可能である必要があります。これらの制限および要件に可能な解決策は、具体的にはDNAの突然変異を検出するために設計されているマウスモデルの使用である。
MUL変異検出のためのTIPLEトランスジェニックマウスモデルが開発されている。例えば、トランスジェニックマウスのLacI 18 のLacI遺伝子はLacオペレーターのサプレッサーをコードする変異レポーターとして機能するLacIリレポーター系をコードする回復可能なλファージベクターを運ぶ。 LacIリ遺伝子の変異の際に、Lacオペレーターが活性化され、β-ガラクトシダーゼが生成される。それが青色に変わっβ-ガラクトシダーゼの発色性基質を切断するのX-gal（5 - ブロモ-4 - クロロ - 電子 - インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）。 のLacIベクトルに隣接するCOSサイトはラムダファージタンパク質およびEのその後の感染により容易に回収することができ大腸菌 。感染したEをインキュベートした後大腸菌は、X-gal基質を含有するアガロースに、プラークをスコア付けすることができる。明確なプラークは非変異体を保有しながら、青斑は、推定される変異型ラック-I有するファージを含んでいる。目の中で青いプラークの周波数（電子明確なもの）は、DNAから抽出された元の細胞集団における突然変異頻度を示す。また、LacIリターゲットをホストするλファージは、容易に、比較的高いスループット分析のためのPCR技術を用いて配列決定することができる。複数の変異型のLacI遺伝子の配列を決定することは今度は特定のDNA修復経路で可能な欠陥または特定の遺伝毒性事象を指すことがあり、突然変異スペクトルに関する重要な情報を明らかにします。 のLacIトランスジェニックシステムは、複数の研究室19全体で標準化されており、試薬は、市販されている。 LacIリシステムの一つの主要な欠点は、大規模な欠失または再配列を検出する能力が限られているので、分裂中期スプレッド上の他の方法、 例えば 、多色FISHは、この欠陥を補完するために使用される必要がある。
LacIリマウスモデルのλファージベクターの中では、はるかに小さい遺伝子、CIIがあります、変異解析のために利用できる。そのサイズおよび変異体を選択することができるという事実は、このlacI遺伝子解析未満の労働集約的かつ安価なアッセイを20にする。しかしながら、lacI遺伝子は、より広範囲に突然変異誘発21に研究されており、発色基質22-25に関する表現型応答を生成するアミノ酸残基の明確な理解が存在するように突然変異遺伝子の感度はよく特徴付けられている。
変異検出のための他のマウスモデルがΦX174またはLacZを導入遺伝子の使用を含む。 T→G：オリジナルAとΦX174トランスジェニックマウスモデル、C復帰突然変異試験26又は塩基対置換のスペクトルの検出を可能に前進突然変異試験27は 、LacIリモデルより安価なシステムを表す。しかし、フォワードアッセイにおける突然変異画面は些細な突然変異の仕様ではありませんΦX174導入遺伝子のスペクトラムは、次のようにのLacIのものと十分に特徴づけされていません。 LacZを導入遺伝子を有するマウスモデルでは、LacZの突然変異レポーターを大腸菌を用いた回収され、ガラクトースおよびガラクトース28を含有する培地に対して感受性である大腸菌宿主細胞。このシステムの欠点は、LacZの対象の回復はまた、E.のライゲーションおよびエレクトロポレーションに続いて、制限エンドヌクレアーゼ消化を含むことであることが困難少数の細胞のためのシステムを適合すること大腸菌ホスト。多数の細胞が必要な場合には（ 例えば百万個以上）、（1、常により多くのマウスで始めることができます）幹細胞/前駆細胞集団を操作するための絶対条件ではありませんが、それはすぐに非現実的で費用対法外になります。また、LacZの比較的大きなサイズの、感受性突然変異レポーターを提供しつつ、DNA配列分析およびdetermために面倒でコストがかかる突然変異スペクトルの追うもの。このモデルの主な利点は、しかしながら、その大きな欠失および挿入を検出する能力、ならびに染色体再編成である。
LacIリ、ΦX174およびLacZトランスジェニックマウスモデル内のすべてのセルがレポーター系を運ぶので、これらのマウスモデルのいずれかは、それらが確実に採取することができるように、幹細胞および前駆細胞を含む、関心対象の任意の細胞型において突然変異誘発を測定するために使用することができる十分な数の。我々はのLacIマウスモデルとのLacI突然変異試験で豊富な経験を持っていたので、我々は造血幹細胞および前駆細胞集団内変異導入解析のための更なるこのシステムを追求することにしました。
造血組織は、リンの極めてまれな集団として同定可能であり、長期再増殖幹細胞を含むその個々の成分の細胞表面表現型の点でよく特徴付けられている- IL7R
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Protocol
C57BL / 6バックグラウンド上のLacIトランスジェニックマウス由来の白血球はのSca-1（ 図1）を発現しない。のSca-1が細胞の精製に使用されるマーカーであるため場合、これらのマウスはのSca-1の発現を得るために適切な株と交配される必要があり、このプロトコルにおける正規C57BL / 6（B6）マウスとの間の相互のLacIのF1 （C57BL / 6）トランスジェニックマウス（LacIリ ） は （ 図1）を用いた。このプロトコルで使用される細胞集団から、のLSKとのCMPは、骨髄中で最小の集団を表す。 、、ソート/それぞれの少なくとも2×10 5の精製の み後肢から、あるいは少なくとも4匹のマウスにもヒップ、前脚- 、脊柱の骨から骨髄を採取する際に、約10匹のマウスから骨髄を結合するために、胸骨が使用される。
骨髄および脾臓から単一細胞懸濁液を作る。骨髄の小さな割合がそのまま使用され、大部分はプリンに使用されるIFYのLSKと差別化骨髄性前駆細胞、選別（FACS）、蛍光活性化細胞によるつまりのCMPおよび顆粒球/単球前駆細胞（GMPは）。骨髄細胞の単離およびこれらの集団のFACS精製は、他の場所に記載されている30-32。およそ6つの独立したソートが集団間の変異頻度の有意差を同定する必要がある。
精製された造血亜集団で自然発生的なin vivoでの突然変異体頻度を測定するための以下のプロトコルは、Kohler ら 18から元の作業に基づいて、いくつかのストラタの取扱説明書33-35から適応される既存のプロトコル33-35と、このプロトコルの間の最も重要な相違点必要な細胞の比較的小さな数を使用する場合に、プロテイナーゼKのインキュベーションのために使用される試薬と時間および温度の容積の違いが挙げられる。
1-mlの遠心管中で所望の細胞集団のアリコートの細胞を収集した後（アリコートあたりの細胞数は、 表1を参照）。 4℃で、7分間266×gで遠心分離慎重に上清を吸引除去する。 5分間、液体窒素中にチューブを配置し、さらに使用するために-80℃の冷凍庫に転送。試料は、少なくとも6ヶ月間保存することができる。
2。ゲノムDNAの単離
- -80℃の冷凍庫からサンプルを採取する。サンプルチューブに氷冷したDNAの溶解緩衝液（ 表3）を500μlを加える。ボルテックスチューブ中速での3-5秒と10分間氷上にチューブを置きます。
- 遠心分離機12分間チューブ、4,000×gで、4℃、慎重に上清の〜450μLを捨てる。 3-5秒間チューブをスピンダウン。注意深く上清の残りを除去するためにガラス毛細管を使用する。 Tの内壁にエアコン乾燥彼はTUBEこの滴（約2分）、もう見えなくなるまで。
- DNAの消化緩衝液（ 表3）100μlにRNaceイットリボヌクレアーゼカクテル2μLと1 M DTTの10を添加する。処理されるサンプルの数に応じてボリュームを調整し、このDNA消化液20μlをサンプルごとに必要です。細胞ペレットに、この液20μlを添加した後、ペレットをそっと指やペンでチューブをタップして、下から自身を切り離すようにしてみてください。
注：は、低細胞数のペレットを表示することが困難な場合がある。 - 非常に優しく、再びチューブをタップし、各サンプルに20μlのプロテイナーゼK溶液*（ 表3）を追加します。
*注：プロテイナーゼK溶液を50℃の水浴中で温めされるべきであり、2分間酵素を活性化するために使用する前に。 - 50℃の水浴中ですぐにチューブを配置します。のガイドラインに従ってサンプルを消化
- 低温室でのDNA透析システム（ 図2）を準備します。 600 mlのガラスビーカーに600ミリリットルTE緩衝液（ 表3）流動緩衝液が透析中に攪拌することができるように、小さな磁気撹拌バーを追加し、（0.025ミリモルの孔径）の膜は、バッファの表面に浮くう。試料ごとに1つの膜; 1-4膜は、単一の透析ビーカー中で使用することができる。各サンプルの識別のためのはさみで膜の余白にマークを作る。
- 適切な消化時間の後、現在、非常に粘性のあるゲノムDNA *慎重に浮遊メンブレンの中央にします（ 図2）を追加します。すぐにアルミホイルでビーカーをカバーしています。 〜16〜20 4℃でゲノムDNAを透析HRは、静かにバッファをかき混ぜる。
*注意：粘性のDNA溶液を使用する場合は、広い開口をピペットチップを使用しています。 - 次の日は、きれいなガラスビーカーに新たに調製し、TE緩衝液（ 表3）の600ミリリットルを注ぎ、非常に慎重にスプーンで新しいビーカーに膜を移し、ホイルでビーカーをカバーしています。さらに2時間透析。
- スプーンを使用して、TE緩衝液でビーカーから透析膜を取り出し、新しい滅菌1ミリリットルチューブにDNA溶液は、最も粘性の "塊"を転送します。 4℃でサンプルを保存する翌日の突然変異誘発分析を継続するか、最大で1.5ヵ月後。精製された集団のために、少なくとも1週間待ってください。
3。 E.のためのトレイの準備大腸菌 /ファージ文化（1日目）
各トレイには、2つの異なる層を含むことになる。下部に寒天層およびX-galが含まれている一番上のアガロース層を。 E.大腸菌/ファージ溶液を後者に追加される。単離した細胞の数と種類が必要になりますどのように多くのトレイを決定します。プロトコルのこの部分のために必要なトレーやソリューションのその後の量の数を計算するには、表1を参照してください。以下は、〜1経験者が容易に処理できる60のトレイを生成します。
- 次のメディアを準備します。
- 底部層は、それぞれのddH 2 Oを1600ミリリットルを含有する6×2 Lフラスコを準備NZY粉末（21グラム/ L）および寒天（15グラム/ L）を追加し、よく混ぜる。
- 上部層に、それぞれ800ミリリットルのddH 2 Oを含有する4×1 Lフラスコを準備NZY粉末（21グラム/リットル）、アガロース（7.2グラム/ L）を追加し、よく混ぜる。
- E.を培養する大腸菌、2×250mlのフラスコの各々にNZY粉末2.5gを追加し、のddH 2 Oで100mlにボリュームをもたらす。
- ステップ8で使用確認のトレイ用、NZY粉末8.4グラムとAGAの6グラムを追加1リットルのフラスコに、RとのddH 2 Oで400ミリリットルにボリュームを持って来る
- アルミホイルでフラスコの開口部を覆う。よく混合し、121℃、30分間15 psiで、それらをオートクレーブ。
- オートクレーブから（非常に熱い！）フラスコを取り外します。慎重に寒天を混合し、アガロース、次いで50℃の水浴中に配置するフラスコを旋回。水浴を再び50℃に達したときに、各トレイ（底層）NZY寒天を150ml〜2 Lフラスコ（ステップ3.1.1）から注ぐ。
- その後、反転してトレーを開き、寒天は、少なくとも2時間、室温で固化することができます。 （ 図3）45を中心の位置から°、蓋の上にトレイの底に置き、30分間乾燥させます。トレイを閉じて、RTで、O / Nのままにしておきます。
- 一方、SCS-8 Eを準備する次の日のための大腸菌の培養。 2 250ミリリットルのフラスコの1から*（ステップ3.1.3）、5ミリリットルNZYブロス（ 表3）を取り、無菌14メートルに転送Lチューブ。マルトース/ 硫酸マグネシウムの溶液62.5μLとサプリメントとSCS-8 Eの10μlを加える大腸菌グリセロールストック。 250〜300 rpmで振とうしながら3〜4時間、37℃でインキュベートする。 NZYブロスの95ミリリットルを接種するためにこの培養物の15μlを使用する（250ミリリットル中のサイドアームフラスコ）、振とう培養器（250〜300 rpm）で、37℃で培養するO / N。
*注：必要に応じて他の250mlのフラスコに文化のODを調整するために、後で使用することができます（ステップ4.1） - 寒天で1リットルのフラスコ（ステップ3.1.4）を取ると、（これはステップ8のために必要な約50の料理のために十分である）60ミリメートル皿に〜NZY寒天6-7ミリリットル注ぐ。寒天（約10分）に硬化するには、その後反転し、プラスチックで包みます。これらの料理は、月まで4℃に維持することができる。
4。 E.のためのトレイの準備大腸菌 /ファージ文化（2日目）
- SCS-8 Eの外径を確認してください分光光度計で大腸菌培養物（3.5ステップ）。NZYブロス（ 表3）（ステップ3.1.3）で0.6にOD 600を調整し、成長を停止し、使用するまで氷上に保つために氷の上にフラスコを置く。これは、ステップ6.3および8.2のために使用されます。この培養物を4℃で5日間保持することができる
- 空室アッセイトレイを乾燥します（ 図3）〜5時間（前日を注いだ）。
5。ゲノムDNAのパッケージング（2日目;続き）
- オレンジTranspackの必要数を取るうちチューブ-80℃の冷凍庫で使用できる状態になるまでドライアイスの上に置き、実行される各パッケージング反応のための1オレンジTranspackチューブを取る。適切に各チューブにラベルを付けます。氷上のゲノムDNAサンプル（ステップ2.9）をご用意ください。
- このステップは、一度に1つのチューブを行うべきである。次のDNAサンプルに進む前に、完全なステップを完了します。すぐに1オレンジチューブ* 注1を解凍：それのほとんどが解凍されるまで、指を使って、そして置く冷やして。対応するゲノムDNAサンプルを取り、すぐにオレンジ色のチューブに8月12日μlのサンプル* 注意2,3を転送します。優しくピペッティング3回だけでなく、優しく指でチューブをタップしてコンテンツを混ぜる。混合する際に気泡を導入しないようにしてください。 90分間30℃の水浴中に管を置き。
*注1：マイクロ遠心クイックスピンは内部の壁やキャップからすべてのコンテンツを収集する必要があるかもしれない。
*注2：追加されたサンプルの量は、そのサンプルを生成するために使用する細胞の数に依存します。サンプルの11から12μlを2.0〜5.0×10 5個の細胞から調製し、1.0×10 6細胞サンプルの10μL、および8μL 1.5×10 6細胞サンプルの。
*注3：DNAはまだ非常に粘性のある、、、DNAを取り出し、試料管の底にピペットチップを押して慎重にチューブの内壁に周りの先端をねじる。 - 1または2の青色Transpack TUを取るBESは、-80℃の冷凍庫を*と、さらに使用するまでドライアイスの上に置きます。迅速に解凍し、オレンジ色のチューブにそれぞれ12μLを移す。軽くピペッティング3倍溶液を混合。さらに混合するために、指でチューブをタップして、すぐに別の90分間30℃の水浴に戻して、その後、2〜3秒間ダウンチューブをスピン。
*注：10月12日の反応のための5-6の反応と2青のチューブに使用1青チューブ。 - 90分後、5秒間中速での反応や渦を停止するために970μLのSMバッファ*（ 表3）で各反応を希釈。さらに使用するまで氷上にチューブを置く。
*注：細胞の数が≤5×10 5である場合、反応を停止させ、500μlのSM緩衝液（ 表3）を使用して、（同一のサンプルの）2チューブは、その後（工程6.4）を組み合わせることができる。
6。メッキパッケージゲノムDNA（2日目;続き）
- 反転寒天トンを閉じる午前中に乾燥のために開かれた線。各サンプルのトレイにラベルを付けます。
- Nの16.8ミリリットル中のX-galの4.8グラムを溶かし、N-ジメチルホルムアミド（ステップ6.5のために必要）。すぐにかき混ぜるとシェーカープラットフォーム上で置く。光から保護する。解決策は、20〜30分に明確にする必要があります。
- SCS-8 Eを分取大腸菌細胞 。トレイのセットごとに*、1 50ミリリットルコニカルチューブを使用しています。パッケージ化されたDNAサンプルの名前で、チューブにラベルを付けます。 Eの2ミリリットルを追加します。各トレイのための大腸菌懸濁液 。
*注：たとえば、3×10 5 GMPは8トレイのセット（ 表1参照 ）が必要です。したがって、2つのアリコートを、8×2 = 16のトレイを必要とする。アリコートを各= 16ミリリットル8×2 Eで、2 50mlチューブを分離し、このように準備しておく大腸菌サスペンション。 - SCS-8 大腸菌を含む適切な50mlチューブに（工程5.4からの）パッケージ化されたDNA試料を1ml *を追加大腸菌分量、よく混ぜる。このEをインキュベート揺れincu中の大腸菌 /ファージ混合物ウランバートル（250〜300 rpm）で、23分間37℃で。
*注：DNAは≤5×10 5細胞から抽出された場合は、SM緩衝液500μlの反応（ステップ5.4）を停止するために使用された。このステップでは、チューブは組み合わせることができ、1つ50mlコニカルチューブに加えた。 - 場合には、E.大腸菌 /ファージ混合物がトップアガロース層のための準備を開始し、インキュベートされる。 （; 50℃に保たれ、ステップ3.1.2からの）上層アガロース溶液のそれぞれ800ミリリットルフラスコに、X-galを/ Nを5 mlを加えてN-ジメチルホルムアミド溶液（工程6.2）。のX-galの最終濃度は1.5 mg / mlのでしょう。アガロースに添加した場合のX-galは少しを沈殿させることがあります。 X-galを溶解し、背面50℃の水浴中にボトルを置くためにスワール。
- Eを取るインキュベーター（ステップ6.4）のうち、大腸菌 /ファージ混合物。各サンプルは、複数のトレイを必要とし、各トレイは、50ミリリットルX-gal/agarose溶液（ステップ6.5）が必要です。各サンプルのX-gal/agarose必要量（ すなわち 50ミリリットルXを注ぐトレイの数）が大きく滅菌プラスチックボトル中で、適切なEを追加大腸菌 /ファージ混合物。混合するボトルを旋回。 50ミリリットルコニカルチューブ中の45〜50ミリリットルの分量で混合を分割。管の数は、そのサンプルに必要なトレイの数と同じである必要があります。
注：残りのX-gal/agaroseソリューションはステップ8.3で使用されます。この溶液を、さらに使用するまで50℃の水浴に格納することができる。 - アッセイトレイの下半分全体でトップアガロース混合物の50ミリリットルを注ぐ。すぐに1方向にわずかアッセイトレイを傾けることによって、アガロースを広げた。
注：アガロースを非常に迅速にクールダウンし、トレイに広がることは不可能になります。したがって、この工程は比較的速く50℃に保温されたアガロースを用いて実行される必要がある - トップアガロースが少なくとも15分間硬化させることができます。その後、30分（ 図3）のためにそれらを空気乾燥させてアッセイトレイを反転して開きます。 15〜16時間、37℃で（上の一番下の寒天層側）に反転アッセイトレイをインキュベート、トレイを閉じます。 5つ以上のトレイを積み重ねないでください。
7。推定変異頻度の決定（3日目）
- 37℃のインキュベーターからトレイを取り外し、それらをクールダウンしてみましょう。各トレイに半透明のプラーク形成単位（PFU）を数え、ランダムに、トレイに2サイトを選択2.5×2.5 cm 2以上5×5 cm 2の正方形*を描き、マーキングセルカウンターで各正方形内のすべてのPFUを数える（ 図4A、B）。
*注： 図5に示すように、正方形使用して、デバイスを描画する。カウントのPFUの数が≥40の場合は、そうでない場合より大きなを使用し、より小さな正方形を使用しています。 - カウント乗の平均を取ると、より小さな四角でカウントした場合96で乗算、または大規模な1でカウントした場合24で、この数を掛けます。のPFUの数は、SAからのすべてのトレイのために数え追加私はサンプル。これは、サンプルのために生成のPFUの合計数です。
- 次に、各トレイ内の変異体のプラークを数える。トレイは現在、変異プラークを見つけるのに役立つであろう、冷却している。さらに、青斑スポッティング容易に赤と/または白の表面上にトレイを移動するには、赤と白の紙のシートが適しています。サークルマーカーペンで任意のブループラーク。各変異体の青色の形状や強度を記録（ 例えば 、フル、円、セクター、 図4C）36,37。
- のPFUの合計数 （ステップ7.2）で、変異のPFUの数（ステップ7.3）を分周して、各サンプルの推定変異体頻度を決定する。
8。推定変異プラーク（日3-5）の検証
- パスツールピペットを用いて、コア各変異（青）PFUおよび250μLの滅菌SMバッファー（ 表3）にプラグを移す。クロロホルム25μlを、5秒ANボルテックスを追加4℃でのDストアは、翌日継続または変異PFUが実際に突然変異体であることを確認するために、次のステップに進む前に、室温で2時間、終了します。試料は、少なくとも1年間、4℃で保存することができる。
- 1 1ミリリットルと差し込まれた各変異体のための1 4ミリリットル滅菌チューブにラベルを付けます。新しい1ミリリットルチューブに、寒天プラグ（ステップ8.1）を滅菌SMバッファーで1:50（100μLのSMバッファにサンプルを2μL（ 表3））から放出された再懸濁したファージを希釈、簡単に渦が、脇に置きます。 4ミリリットル滅菌チューブに200μlのSCS-8 Eを追加大腸菌 （ステップ4.1から）を培養し、対応する1ミリリットル管から希釈されたファージの2μL、5〜10分間37℃でインキュベートする。
- 60 mmのNZY寒天プレートに混ぜて注ぐために、各4ミリリットルチューブ、スワール管に（ステップ6.6から左オーバー）のX-galを含むトップアガロースの2.5ミリリットルを追加し、以前に（ステップ3.6）に注いだ。 Tせる（10分間のままに彼はトップアガロース）固化、お皿を反転し、37℃でO / Nインキュベート
- 翌朝、インキュベーターからお皿を取り外し、それぞれの料理に青のPFUの割合（ 図6）を決定します。のPFUの70％以上が青色である場合、変異体38,39を確認したと考えられる。コア変異型皿から歯垢および1.5ミリリットルを入れは250μlのSM緩衝液（ 表3）と25μlのクロロホルムを含む、トップチューブスクリュー、それは今シークエンシングのための準備ができました。
- PFUの50％以下が青色である場合には、現実の変異体38,39とはみなされない。青のPFUの頻度60〜70％の間である場合には、プラークの形状に関する注記にして戻って確認してください。PFUの形状が "フル"であった場合、シーケンシングを進める。
9。 LacIリGエン変異をシーケン
- 1.5μ含め、25μlの反応容量でPCR反応をセットアップする、プラーク上清（テンプレート、ステップ8.4）lのフォワードプライマーSF1（5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 '）およびリバースプライマーSR2（5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'）。製造業者の説明書に従ってPCR延長Taqポリメラーゼキットを使用する。サイクリング条件は以下のとおりである：94℃2分間、次いで5分間72℃の最終工程2分間、続いて20秒間、20秒間94℃の35サイクル、60°C、72°C、 。
- 各反応の5μlのアリコートを取り、0.8％アガロースゲルに流し、増幅を確認する。
- 製造業者の指示に従ってAugencourtクリーンアップキットを用いてPCR反応をクリーンアップする。
- 鋳型DNAを定量する。
- シーケンシング用の鋳型DNAとしてPCR産物〜100 ngのを使用してください。配列決定プライマーとして同一のPCRプライマーを用いて両方向に配列アンプリコン（上記参照）。
- シーケンスを組み立て、mutatiを検出するためのLacI参照配列 40に合わせるアドオン。
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Representative Results
in vivoでの変異誘発アッセイは、多くのイベント（すべてのPFU）の中で稀な事象（変異のPFU）を測定する。少数の細胞でアッセイを行うことにより、結果が大幅に正偽及び偽陰性の結果に影響されることが可能である。この問題に対処するために、我々は、3つの異なる動物から採取未分画骨髄細胞との連続希釈実験を行った。我々は、1.4×10 6、7.0×10 5を使用して、これらの動物の骨髄中の3.5×10 5の突然変異体頻度を測定したところ、1.75×10 5個の細胞。結果（ 図7）は、入力細胞数およびPFUの生成された数の間の直線関係を示している。重要なのは、変異頻度は、細胞の低または高の数字を用いて測定するかどうか、一貫性があります。直接（原因細胞の少なさに）テストされていないが、これはのLSKとGMPはの場合ではないと信じる理由はありません。
T ">この変異導入アッセイにおいて最も重要なステップは、ゲノムDNA（ステップ2）の単離である。DNA濃度は、理想的には500 ngの/μlの≥れるべきであるが、このプロトコルは40〜150 ngの/μlでうまく動作します。より重要である吸光度比260/280（これは> 1.8〜2.0であるべき）および分子量（周り300〜500キロバイトでなければなりません）。1は、品質と単離されたDNAの大きさを確認するためのアッセイに精通していないときにお勧めです。 図8は、高分子量のDNAの電気泳動操作の一例を示す。1は、精製された少数の細胞で開始すると、図4（b）に示すトレイ上の個々のPFUのマーキングはプラークの合理的かつ達成可能な密度を表し、トレイが40〜150のPFU /小さな正方形の間で保持する必要があります。この特定の実験では、 図4Bの小さな正方形が103プラークが含まれています。 図4Aの上隅に示すトレイ上の他の正方形、 41によって推奨される12000のPFUよりも低い。
図4Cは、観察することができる青色プラークの異なるタイプの例を示す。 LacIリ変異誘発アッセイでは、プラーク（ すなわちフル、部門または円）の形態は、変異の起源を示すものであり、完全なマウス原点から突然変異で、他の2が可能性が高いEに生産され、一方、 大腸菌 36,37。再プレーティングと（ALSを参照してください。図6）、O、ほぼすべての「完全な」プラークは、セクタプラークのごく小さな部分が行うのに対し、再度> 70％青色プラークを再現しておらず、しばしば小さく、円形プラークの事実上いずれ。
表2は、高骨髄細胞（細胞はから選別された細胞の同じプール）の数および脾臓細胞とその精製された細胞と比較して比較的少数でプラーク形成の再現性を示している。
変異体のPFUは、最初の配列決定により、第二再プレート（ 図6は、一次変異体（青）のPFUの確認のための料理の代表的な例を示している）によって、確認されています。 > 70％の青色のPFU（下2）を含む図6の料理は、変異が（とは、 大腸菌で）マウスで始まっていることを確認します。しかし、左上のお皿には青のPFUを示していないため、一次PFUは、突然変異体とsequeとしてカウントすべきではありませんncingは必要ありません。右の皿は、〜65％の青色のPFUを示しています。プライマリープラークの形状によっては、このサンプルでは、（ステップ8.4を参照）、配列決定のために送信されます。 DNA変異は、配列決定によって確認することができる場合にのみ、このPFUは、変異体としてカウントされる。 PFUの形状がわからない場合、シーケンス！
図1のSca-1は、野生型C57BL6マウス（B6）、トランスジェニックLacIリマウス（LacIリ ）および B6マウスのこれら二つ（LacIリ X B6）。骨髄細胞との間の交配の子孫から骨髄細胞上の染色を発現したSca-それらの細胞表面上の1この特性は、幹細胞及び前駆細胞を精製するために使用される。 B6背景にトランスジェニックのLacIマウスは、しかし、SCA-1を発現しないが、このマーカーは、WHが失われている必要がありますコロニーを確立するILE。トランスジェニックのLacIマウスにSCA-1を再導入するために、これらのマウスは、通常のB6マウスと交配した。
図2。のDNA透析システム。（より良い視覚化のための青色）中心部にある粘性のDNA溶液を保持している三つの膜は、TE緩衝液に浮遊している。赤い矢印は、サンプル識別のために使用される膜の小さなニックを示している。
図3。60以上の寒天/アガロースを含むトレイを乾燥させる効率的な方法。
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プラーク形成単位の図4。検出（PFUで）。描かれたファージに感染したEの主要なコロニーを有する（ 図3に示されている）、大寒天トレー（の一部） 大腸菌 。 （A）示されたプラークを計数するためにそれに描画された2つの小さな四角で1プレート全体である。赤インサートは、（B）に拡大して示されている。 （b）各個別の黒のマーカードットが寒天プレート（計103）で明らかに野生型PFUを示します。可能性のある突然変異体のPFU（C）の様々な形状。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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図5。プレキシグラスがカウントを正方形。描かは、大小のカウント広場もあります。大きな正方形の内部の測定を5cm×5センチ、小さな正方形の2.5センチメートルX 2.5センチメートルです。
変異体のプラーク形成単位（PFUで）図6。確認に示す4小皿が青PFUの希釈剤で前日に接種する。左上のお皿には青のPFUを示さない。右上の料理は〜65％の青色のPFUを示しています。 2下段トレイは、80から90までパーセントブルーのPFU（左）と100％の青のPFU（右）を示している。赤い矢印は、明確な（野生型）のPFUを示している。
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図7非分画骨髄における変異頻度。描か（A）で表されている（24〜26ヶ月齢）は、3つの異なる動物で測定のPFUの数、（B）変異体および（C）の数の変異体頻度である異なる色で。 1.4×10 6、7.0×10 5、3.5×10 5、1.75×10 5個の細胞を各マウスについて、測定値は、4つの異なるサンプルサイズで実施した。データは、細胞のこの範囲内で、サンプルサイズが有意に突然変異周波数測定に影響を及ぼさないことを示している。
イチジクウレア8。 精製された細胞から単離された高分子量のDNAサンプルのパルスフィールド電気泳動。プロトコルの工程2に記載のバイオラッド（CHEF-DR III）システム上で実行するように、ゲノムDNAを単離した。 （レーン1 Li）と、成熟した系統+細胞を枯渇骨髄細胞（LB;レーン2および14）、CD34 + LSK細胞（L;レーン6）、CMPのゲル上にロードされた各種サンプルが肝臓から単離されたDNAサンプルである（レーン7-9）のGMP（レーン11および12）およびSca-1 +細胞（S、レーン15）。レーン4は、高分子量DNAのためのラダーを保持する。写真は、DNAの大部分が高分子量（> 600キロバイト）であることを示している。
表1。精製された集団のその他のサンプルパラメータ、全骨髄および脾臓 。議定書に示されている場合、このテーブルを使用してください。 DNA試料の各集団が上に示されるために、アリコートあたりの細胞数（×10 5）を 、DNAの消化時間は、容積透析後、一定分量ごとに必要なトレーの各アリコートと数に必要な反応の数は、左側に表示されています。 50℃での消化時間は、実験の成功に不可欠です。
LSK =林- SCA-1 +キット+細胞; CMP =骨髄球前駆細胞、GMP =単球/顆粒球前駆細胞、WBM =（無選別）全骨髄。脾臓細胞をソートされていない。
表2。プラーク形成の効率が異なる細胞集団の間で同程度である。この表は、異なる集団間のプラーク形成を示しています。六月齢のC57BL / 6マウスを、これらの実験（大腿骨及び実験当たり10〜11匹のマウスの脛骨、合計で6回の実験）のために使用した。これらの実験のGAで使用される集団の1つを除くすべて24まで、少なくとも1 VEの、（確認した）変異体のPFU（Zhou ら 、投稿準備中）。 PFU番号は、マウス系統によって異なる場合があります。
LSK =林- SCA-1 +キット+細胞;。CMP =骨髄球前駆細胞、GMP =単球/顆粒球前駆細胞、WBM =（無選別）全骨髄*脾臓細胞をソートされていない。 SD =標準偏差。
表3。追加の試薬 の調製のための指示。
RecoverEase DNA単離キットのストラタ取扱説明書から§
>¶Transpackのパッケージング抽出のストラタ取扱説明書から
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Discussion
本明細書に記載のin vivo変異導入アッセイはもともとKohler らによって生成されたLacIトランスジェニックマウスモデルに基づいている。18このモデルは、lacIリレポーター遺伝子を有するλファージベクターを利用する。ベクトルは、感染性ファージ粒子に比較的単純な回復とその後のパッケージングを可能に隣接する2つのCOSサイトは、Eを感染させるために使用大腸菌 。ブループラークは、ファージに感染したEによって生成されます変異したlacI遺伝子が含まれている大腸菌 。ブループラークは、このように大幅に変異型得点のタスクを簡素化し、無色の背景に設定されています。 DNA配列決定技術は、変異誘発のメカニズムへのさらなる調査を助けることができるが発生した突然変異の位置及び種類を特定するために使用することができる。
我々は、この変異誘発アッセイのプロトコルに加えられた変更は、1は、FACS精製hematopoieでそれを使用できるようにするTICの細胞集団。しかし、再現性のある分析が依然として高品質のDNAの十分な量を確保するために、少なくとも2×10 5個の造血細胞を必要とすることを見出した。 HSCを長期再増殖の頻度は、これらのHSCに突然変異誘発分析を実施する、29極端に低いので、この時点では達成できない。我々は、このプロトコルで使用する幹細胞に富む人口は、LSK細胞は、FLK-2に加えて、含まれています-多分化前駆を表す短期再増殖HSCおよびFLK-2 +細胞、 -長期再増殖するHSC、またFLK-2を細胞（のMPP）42。 HSCをNHEJを利用の観点から前駆細胞5よりも-この制限にもかかわらず、我々はそれがLSK細胞をよりLSK-FLK-2のように振る舞うことが示されたため、この変異誘発アッセイにおける造血幹細胞のための読み出しなどのLSK細胞を使用することは合理的であると感じています。また、ロッシら 8からの仕事は、MPPをがDAMAGとコピーに優れていることを示唆している彼らの年齢、特に造血幹細胞、よりED DNAを、LSKの人口で見つかった突然変異体の数は造血幹細胞ではなく、のMPPのことを反映していることを仮定するために私達につながる。
ソートされた少数の細胞が各実験で得られるので、このin vivo変異導入アッセイの計画段階で考慮すべき重要な問題は、統計的有意性を達成するのに必要な（サンプルあたりのプラークの総数すなわち ）サンプルサイズである。目標は、例えば、野生型対照LSK細胞に操作さLSK細胞の突然変異頻度を比較することであるときに、換言すれば、どのように多くのプラーク合計は、2つの三倍の差を検出するためにそれぞれのLSK集団のために必要とされる変異頻度？我々は、負の二項回帰分析43に基づいて、少なくとも野生型細胞では、選別実験の間に有意差は認められなかったので、注目すべきは、プラークの総数は、すべての実験から組み合わせることができる。プラークのNumのBERは（脾臓、のLSKとのCMP用WBMとGMPを10,000〜と〜7000）それが実行される必要があるソートの数が決まりますので、知っておくことが重要である。突然変異頻度は、野生型組織44に小さいので、これらの統計的比較を正規近似は正確ではない。その周波数が小さく、サンプルサイズが大きい相対的である場合には（突然変異頻度の）真の二項分布に近似するので、このような理由から、我々は、ポアソン分布を使用して、ハフマン符号45は、ベースのサンプルサイズを計算するための式（ 式4）を提供するポアソン分布に。仮説的突然変異2.5の頻度、4と、制御セル44内の100,000個の細胞あたり7突然変異に適用した場合、我々は2つの尾有意に有意二倍の差（2つのサンプルの試験を検出するために、それぞれ、456949疫病、285592及び163196を必要と0.05と0.80の力）の。一部のプラークを3倍に検出するために必要とされるそれぞれ43624; 122148; 76342：違い。従って、関心対象の各集団（従って十分な細胞を得るために必要な種類の数）に必要なプラークの数は、対照細胞集団と比較集団における予測される倍率変化が期待できる変異頻度に依存する。
この突然変異誘発アッセイにおいて最も重要なステップは、ゲノムDNA（ステップ2）の単離である。それは（「代表的な結果」を参照）、高品質のDNA試料を用いて、このプロトコルを開始するために不可欠であるが、ソートされた細胞を用いて作業する場合、細胞数は、しばしば限定され、DNA濃度又は大きさを決定する上で無駄にすることはできない。ステップ2.9で、サンプルが極めて粘性とで動作するようにハードである必要があります。私たちは、DNA試料の品質のためのもう一つの良い指標は、その粘度であることがわかった。それは、このステップの権利を取得するためにいくつかの練習が必要です。したがって、 例えば 、大細胞数とプロトコルを動作するようにお勧めします全骨髄またはソートSCA-1 +細胞であり、これらのサンプルからDNAを単離に慣れると、その粘性によるDNAの品質を判断する方法を学びます。
DNAの品質と大きさは、生成されたのPFUの数に影響を与えます。 DNA単離工程が完成すると、アッセイの最適化の次の重要な要素は、トレイ当たりのPFUの密度である。 表1は 、そのサンプルのための細胞の最適な数に対応する試料の種類ごとに使用するトレーの推奨数を示している。このガイドラインを使用すると、個々のプラークがまだ区別することができ、まだ薄すぎる広がっていないのトレイをもたらすべきである。トレイは小さな正方形あたり40〜120のPFUの間で保持する必要があります。 図4（b）に示す例では、合理的な密度を表します。これらの最適化の側面が働いて、サンプルごとに生成のPFUの数は非常に効率的で再現性のある（ 表2）。
"> LacIリトランスジェニックマウスモデルは、他の種々の組織で使用されているが、他に適用すると、高度に精製された集団の比較的少数に関連して（造血なく）組織限定幹細胞富化集団は、それが推奨されていないDNAの単離操作に特別な注意を払うように、彼らは、細胞型に細胞型と異なる場合がありますし、造血細胞のための推奨事項は、必ずしも他の組織の細胞型では動作しない場合がありますこのような試薬の量、温度、湿度などの重要な要因れるプロテイナーゼK消化が起こり、最も重要なことは、プロテイナーゼK消化時間は、各細胞型のために解決される必要がある必要があり、このプロトコルは、出発点として働くことができる。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
我々は、この原稿でグラフィックデザインや写真撮影のためにデヴィッド·R·ロドリゲス、マサチューセッツ州に感謝したいと思います。この作品は、UTHSCSAフローサイトメトリー中核施設とUTHSCSAアドバンスト核酸基盤施設にGCCRI、NIH / NIA（5R21AG033339）とがんセンターサポート助成金（P30CA054174）からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | ||
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 | |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 | |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 | |
| 0.025 mM Pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 Bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 | |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 | |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/Coulter | A63880 |
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