Summary
في الفئران عنق الرحم نموذج زرع القلب هو مناسبة تماما لالمناعية فضلا عن دراسات إصابة نقص التروية ضخه. نحن تعديل الإجراء باستخدام تقنية صفعة غير خياطة وتنفيذ أكثر من 1،000 عملية زرع ناجحة مع هذا النهج.
هنا، ونحن نقدم تفاصيل إضافية لهذه التقنية لاستكمال الفيديو.
Abstract
نماذج الماوس ذات أهمية خاصة في مجال البحوث منذ طائفة واسعة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وحددت تجاريا والفطرية هي سلالات خروج المغلوب المتاحة لتنفيذ الآلية في الدراسات المجراة. في حين أن النماذج زرع القلب باستخدام تقنية خياطة وضعت لأول مرة بنجاح على الفئران، تم تحقيق الترجمة إلى ما يعادل الفئران المستخدمة على نطاق واسع على قدم المساواة أبدا بسبب التعقيد التقني الإجراء المجهرية. في المقابل، كانت تقنيات غير خياطة الكفة، وضعت أيضا في البداية في الفئران وتكييفها بنجاح لاستخدامها في الفئران 1-3. هذه التقنية لإعادة التوعي تتضمن خطوتين رئيسيتين I) مشنفة السفينة مستلم عبر صفعة البولي اثيلين. II) سحب السفينة المانحة على سفينة مقلوبة المتلقي سابقا وعقد في مكانه مع ربطة عنق كفافي. وهذا يضمن استمرارية الطبقة البطانية، والوقت قصير ومعدلات التشغيل المباح عالية جدا 4.
ر "> استخدام هذه التقنية لمفاغرة وعائية أجرينا أكثر من 1،000 زرع القلب عنق الرحم مع نسبة النجاح الإجمالية 95٪. لتدفق الشرايين الشريان السباتي المشترك وتم anastomosed قوس الأبهر الداني مما أدى إلى الوراء التروية للقلب المزروع. لالتصريف الوريدي كان anastomosed الشريان الرئوي من الكسب غير المشروع مع الوريد الوداجي الخارجي للمتلقي 5.هنا، ونحن نقدم تفاصيل إضافية لهذه التقنية لاستكمال الفيديو.
Introduction
زرع القلب يمثل العلاج المفضل للمرضى الذين يعانون من مختلف أمراض القلب في نهاية المرحلة. أدت التطورات في التقنيات الجراحية والوقاية من الالتهابات أكثر فعالية، ونظم مناعة جديدة في تحسن ملحوظ نتائج زراعة الأعضاء 6. ومع ذلك، فقد بقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل لم تتحسن بشكل صارم على مدى السنوات الماضية 7. استمر الرفض المزمن، وتتميز زرع تصلب الشرايين يشكل عقبة رئيسية أمام الكسب غير المشروع البقاء على المدى الطويل 8-11.
نموذج منتبذ زرع القلب في الفئران يوفر أداة مهمة وصالحة للتحليل من خلال آلية مناعية حادة فضلا عن الرفض المزمن 12-15.
حتى الآن نموذج زرع الأكثر شيوعا لا يزال البطن زرع قلب فأر باستخدام تقنية خياطة. هو anastomosed الأبهر الصاعد من قلب المانحين لللهو anastomosed bdominal الشريان الأورطي والشريان الرئوي إلى الوريد الأجوف السفلي المستلم. ويستند جزء كبير من صعوبة المجهرية من طراز خياطة على حجم صغير من السفن، والتي تخاط 16،17.
على النقيض من النموذج خياطة يتم وضع القلب في منطقة الرقبة من المتلقي حيث هو anastomosed الوريد الوداجي الخارجي إلى الشريان الرئوي والشريان السباتي المشترك الشريان الأورطي من الجهة المانحة.
كان المبرر لتطوير عنق الرحم نموذج زرع القلب باستخدام تقنية صفعة لنموذج حيواني، والذي يسمح بتحقيق معدلات نجاح عالية مع مهارات الأساسية المجهرية التي تسمح التطبيق الواسع لهذا النموذج. أهم مزايا هذه الطريقة هي مفاغرة تحدث أقل بكثير مضاعفات مثل النزيف والتجلط المتعلقة بالمقارنة مع النموذج خياطة 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إيواء الحيوانات في منشأة حاجز الممرض الحر. جميع الحيوانات على رعاية الإنسان في الامتثال مع "مبادئ رعاية الحيوان المعملية" التي صاغتها الجمعية الوطنية للأبحاث الطبية "و" دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "من قبل الأكاديمية الوطنية للعلوم أعدت ونشرت من قبل الوطني معاهد للصحة (NIH المنشور رقم 86-23، منقحة 1985). تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل وزارة التعليم النمساوية والعلوم والثقافة.
1. مستلم إعداد
- تخدير الحيوان المتلقي مع حقنة ايم من زيلازين (5 ملغ / كغ من وزن الجسم) والكيتامين (100 ملغ / كغ من وزن الجسم).
- إزالة جميع الشعر من منطقة عنق الرحم الجانبية الحيوان وفرك مجال المنطوق ثلاث مرات باستخدام chlorhexdine.
- ضع الماوس في موقف ضعيف في مجال الجراحة.
- بجانب إجراء شق الجلد من المؤتمر الوطني العراقي الوداجيision إلى انخفاض الفك السفلي الأيمن.
- وفي وقت لاحق، وحشد بصراحة الحق حبل الوريد الخارجي (EJV) وتقسيم الفروع بين الحروف المركبة.
- ثم تقسيم EJV بين الحروف المركبة مع التأكد من ترك ما يكفي من طول الجذع إلى ايفرت القريبة أنحاء الجسم الكفة.
- التالي إزالة الفص الأيمن من الغدة تحت الفك السفلي.
- لمفاغرة وريدية تمرير نهاية القريبة من EJV من خلال الكفة البولي اثيلين وإصلاحه في مقبض الكفة مع المشبك الصغير.
- إزالة ربطة في نهاية السفينة، ايفرت لمعة على الكفة واصلاحها مع الحرير 8-0 حلقة (الشكل 1A).
- المسح الشامل لاحقا عضلة القصية الترقوية الخشائية اليمنى مع الكي ثنائي القطب للوصول إلى الشريان السباتي المشترك.
- بجانب حشد الشريان السباتي المشترك وقطع السفينة بين الحروف المركبة.
- بجانب حشد الشريان السباتي المشترك وقطع السفينة بين الحروف المركبة.
- تمرير ديسالتل نهاية السفينة من خلال صفعة واصلاحها مع المشبك الشريان.
- إزالة ربطة في نهاية السفينة ويتمدد التجويف باستخدام dilatators الأوعية الدموية. المقبل، في قياسا على EJV، ايفرت الشريان على الكفة واصلاحها مع حلقة 8-0 الحرير.
المشتريات 2. القلب
- تخدير الماوس المانحة مع حقنة ايم من زيلازين (5 ملغ / كغ من وزن الجسم) والكيتامين (100 ملغ / كغ من وزن الجسم). ثم إزالة كل الشعر من منطقة البطن من الحيوان. فرك المنطوق وقت الميدانية الثلاثة باستخدام chlorhexdine. مكان المقبل الماوس في موقف ضعيف في مجال المنطوق كما هو موضح سابقا.
- بعد شق البطن خط الوسط، سحب الأحشاء مع Q-نصائح إلى اليسار من أجل فضح الوريد الأجوف السفلي (IVC).
- ضخ 400 ميكرولتر من 1: 4 heparin- حل sodium- في IVC لتنقص معالجة.
- إجراء بضع الصدر وأضعاف جدار الصدر الأمامي على cranially لكسب لجنة التنسيق الإداريةوفاق سطيف إلى القلب.
- المقبل، إزالة الغدة الصعترية وجعل التنفيس شقوق في اليسار واليمين الوريد الأجوف العلوي.
- بعد ذلك، يروي القلب بطريقة الوراء مع 4 درجات مئوية HTK حل عن طريق القسطرة من قوس الأبهر مع G 27 حقنة على مستوى الفرع العضدي الرأسي.
- Ligate أدنى وأعلى الوريد الأجوف مع 8-0 الحرير وتقسيمها بشكل أقصى على الحروف المركبة.
- بجوار تقسيم قوس الأبهر في مستوى القسطرة السابق وتشريح مجانا الجذع الرئوي وتقسيمه كما بشكل أقصى حد ممكن.
- بعد ذلك، ربط الأوردة الرئوية مع ربط السائبة وتقسيمها بشكل أقصى إلى الحروف المركبة.
- أخيرا، وإزالة القلب من موقع المانحة وتخزينها في 4 درجات مئوية HTK حل (الشكل 1B).
3. زرع
- وضع الكسب غير المشروع في قلب منطقة الرقبة المتلقي في موقف لأسفل الصاعد (الشكل 1C
- بجانب سحب الجذع الرئوي للقلب خلال بناء الوريد صفعة للمتلقي واصلاحها مع حلقة الحرير (الشكل 1D).
- إجراء مفاغرة بين الشريان الأورطي من الكسب غير المشروع والشريان مقلوبة الحيوان المتلقي في نفس الشكل (الشكل 1E).
- وفي وقت لاحق، وإزالة المشبك الوريدي أولا، تليها المشبك الشرياني. وإشباعها القلب ويبدأ الضرب في غضون 1-2 دقيقة. خلال ضخه بلل القلب مع الدافئة (35 درجة مئوية) المالحة.
- أخيرا إغلاق الجرح الجراحي مع الغرز 6-0 مستمرة (الشكل 1E).
4. بعد العملية الجراحية العناية، نقطة النهاية
- إعطاء ما يصل إلى 0.3 مل العادي IP المالحة بعد العمل الجراحي لاستبدال السوائل.
- وضع الحيوان تحت مصباح الحرارة حتى الاستيقاظ من التخدير.
- مرة واحدة مستيقظا، والعودة الحيوان إلى منشأة سكنية حيث يتلقون الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
- إلى ميألم nimize خلال 7 أيام بعد الجراحة الأولى بإدارة كاربروفين (4mg / كجم تحت الجلد كل 12 ساعة (الشوري)، بالإضافة إلى إعطاء Buprenorphin (0.1 ملغ / كلغ) الحق بعد العملية كل 12 ساعة لمدة 5 أيام.
- الحصول على الوزن (ز) من كل أسبوعية الحيوان المتلقي لتقييم للالحصة الغذائية المناسبة. إذا كان هناك دليل أكثر من 10-15٪ فقدان الوزن مقارنة الوزن في جراحة تاريخه، واللامبالاة، أو شل ظهر عازمة جدا، تضحية الحيوان باستخدام استنشاق الأيزوفلورين محطة قبل الوصول إلى نقطة النهاية السريرية. أيضا تضحية الحيوان بعد أن تم رفض القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 بيانات بقاء تمثيلية من المغايرة القلب من BALB / ج المانحين بعد زرع في MHC متطابقة تماما C57BL / 6 المتلقين. يتم رفض القلوب في يوم 7 ± 1 بعد الزرع. ملامسة إصبع من طعم خيفي زرع هو طريقة حساسة للكشف عن وبالطبع يعتمد وقت رفض طعم خيفي. كل زرع القلب مسانج أجريت في سلسلتنا نجا أجل غير مسمى (> 150 يوما).
الشكل 1: صور جراحة داخلية (أ) الحقل المنطوق خلال إعداد المتلقي (ب) فساد القلب بعد الشراء (ج) والكسب غير المشروع وضعت في قلب منطقة الرقبة المتلقي في الموقف رأسا على عقب (د + ه) الموقع المانحة مسبق.. إلى زرع. (و) رسم تخطيطي مريضاustrating السفينة المتلقي، السفينة المانحة والكفة
الشكل 2: البقاء على قيد الحياة طعم خيفي القلب. كابلان ماير مؤامرة تعرض بقاء طعم خيفي القلب من الفئران BALB / ج بعد التطعيم إلى المتلقين BL6 MHC-متطابقة تماما (ن = 7؛ يعني بقاء الوقت = 7 أيام)، وكذلك مجموعة مراقبة مسانج (ن = 7؛ بقاء الكسب غير المشروع > 150 يوما). وقد عرفت اليوم من الرفض كما في اليوم من وقف ضربات القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
رفض المغايرة أوعية دموية ينطوي على مجموعة كبيرة من الخطوات المختلفة التي لا يمكن تقييمها بشكل كاف باستخدام نماذج في المختبر. ظواهر مثل توعية المستفيدين، معالجة المستضد في الأجهزة اللمفاوية الثانوية ولكن أيضا تمايز وتكاثر الخلايا المناعية المختصة هي أفضل تتميز في الجسم الحي. النماذج الحيوانية هي بالتالي أداة مثالية للبحث متعدية 16. نماذج الماوس لا تزال تمثل المعيار الذهبي في زرع الأساسية والبحوث المناعية منذ نطاق واسع من الجينات المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران متاحة، كما تم وضع عدد كبير من الأدوات المناعية والتشخيصية حصرا للفئران 18. يقدم الفئران عنق الرحم نموذج زرع القلب أداة فريدة من نوعها لمعالجة الأسئلة وإجراء دراسات الآلية المتعلقة نقص التروية إصابة ضخه، كبت المناعة، الرفض الحاد والمزمن والتسامح تحريض 1-3، 17، 22.
الماوس البطن نموذج زرع القلب باستخدام تقنية خياطة وصفت لأول مرة من قبل كوري وآخرون في عام 1973 19. التحديات التقنية المرتبطة مفاغرة suture- من السفن الصغيرة، ومع ذلك، يقتصر استعماله على نطاق واسع.
في عام 1991، ماتسورا وآخرون. قدم عنق الرحم نموذج زرع القلب باستخدام تقنية صفعة غير خياطة في الفئران 16. منذ عرضه قبل زيمرمان وآخرون، وKamada وكالن "تقنية صفعة" استخدمت لanastomoses الاوعية الدموية الدقيقة في عدة نماذج الفئران مختلفة من الجهاز زرع 20-22.
وضعنا غير خياطة، تقنية صفعة تعديل لإعادة التوعي وأكملوا أكثر من 1،000 عملية زرع ناجحة في السنوات القليلة الماضية، مع معدلات النجاح> 95٪. واستخدمت عدة مجموعات الضغط المختلفة ونظم العلاج. تطبيق تقنية صفهاإعادة، يمكن تخفيض الوقت الإجمالي العملية إلى ما يقرب من 45 دقيقة. أهمية الوقت الإجمالي نقص التروية يمكن أن تظل في 20 دقيقة مع الوقت زرع أقل من 7 دقائق، والتي في المقابل هو عادة أكثر من 15 دقيقة عند استخدام تقنية خياطة 23. مقارنة مع الماوس نموذج زرع قلب في البطن، وزرع قلب عنق الرحم لديها العديد من المزايا، مثل الإجهاد بعد العملية الجراحية طفيفة وارتفاع معدل نجاح العمليات الجراحية. ضرب الكسب غير المشروع القلب يمكن بسهولة رصدها نظرا لموقف سطحي. المضاعفات المرتبطة مفاغرة خياطة، بما في ذلك النزيف وتجلط الدم بشكل ملحوظ أقل شيوعا عند استخدام تقنية صفعة 18.
التعديلات التالية من هذه التقنية التي اقترحها أدت مجموعتنا لتحسين معدل النجاح وإلى انخفاض هائل في وقت العملية:
- استخدام نضح الوراء من خلال قوس الأبهر مع 3 مل HTK الحل.
- الحفاظ على القلب رطبة باستخدام HTK سولution أثناء إجراء الحصاد كله.
- لا تشريح وligate انتقائية اليسار الوريد الأجوف العلوي.
- استخدام المشابك الصغيرة لتسد الأوعية، ولكن الأهم من ذلك، أيضا لإصلاح الأصفاد.
- استخدام dilatators الأوعية الدموية مع نصائح رقيق لانتفخ الشريان السباتي المشترك الذي يجعل من الاسهل بكثير ان ايفرت السفينة على الكفة.
- لا تضع عقد الغرز كما الأصلي وصفها ماتسورا وآخرون.
- لمفاغرة شريانية استخدام الكفة مع قطرها الداخلي 0.5 مم وقطرها الخارجي من 0.63 مم، لمفاغرة وريدية صفعة مع القطر الداخلي من 0.75 ملم وقطرها الخارجي من 0.94 ملم.
- استخدام الأصفاد بطول 2 ملم بما في ذلك مقبض 1 ملم والذي يعمل على تثبيت الصحيح للسفينة، وذلك باستخدام المشبك الأوعية الدموية.
واحد الحد أن هذا الأسلوب قد يكون هو أنه قد يكون من الصعب الحصول على الأصفاد المناسبة. لذا استخدمنا ص متاحة تجاريا الأصفاد olyethylene من Rivertech الطبية (تشاتانوغا، TN).
كان الخلل الرئيسي خلال الإجراء على النحو التالي.
اضطراب تدفق الدم: القلب المانحة فلوش حتى يصبح اللون الأبيض اللون. دافق دون الكثير من الضغط والضغط الأضرار المفرطة الكسب غير المشروع.
- صعوبة في ايفرت السفينة على الكفة: تأكد من أن السفينة (أ) من طول كاف، (ب) خالية من الدهون المرفقة والأنسجة الضامة و (ج) تأكد من أن السفينة كانت منتفخة بشكل جيد، وذلك باستخدام dilatators الأوعية الدموية.
- نزيف في موقع توصيلي: استخدام Q-نصائح لممارسة الضغط على المكان المصاب لحوالي 5 دقائق.
- عرقلة تدفق الدم الوريدي: تسببت أساسا من التواء من حبل الوريد خلال عمليات التنسيب الكفة. إزالة مقبض صفعة في موقع الوريدي.
- التواء الكسب غير المشروع والخنق: تأكد من أن يتم وضع الكسب غير المشروع بشكل صحيح في الجانب المانحة قبل إغلاق الجلد.
= "jove_content"> وعلى الرغم من حقيقة أن زرع القلب في الفئران منتبذ يمثل تحديا من الناحية التقنية، إلا أنها تبقى المعيار الذهبي لأي الميكانيكية في الجسم الحي الدراسات المتعلقة زرع المناعة. نهجنا تعديل يسمح بتحقيق معدلات نجاح عالية مع مهارات الأساسية المجهرية التي تسمح التطبيق الواسع لهذا النموذج. يهدف هذا الفيديو لمساعدة وتوجيه بحوث أخرى لإنشاء نموذج في مختبراتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
- Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81, 583-589 (2006).
- Schneeberger, S., et al. The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant. 8, 773-782 (2008).
- Sucher, R., et al. IDO and regulatory T cell support are critical for cytotoxic T lymphocyte-associated Ag-4 Ig-mediated long-term solid organ allograft survival. JImmunol. 188, 37-46 (2012).
- Yamashita, K., et al. Heme oxygenase-1 is essential for and promotes tolerance to transplanted organs. FASEB J. 20, 776-778 (2006).
- Kienzl, K., et al. Proteomic profiling of acute cardiac allograft rejection. Transplantation. 88, 553-560 (2009).
- Aurora, P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: tenth official pediatric lung and heart/lung transplantation report--2007. J Heart Lung Transplant. 26, 1223-1228 (2007).
- Häyry, P. Chronic allograft vasculopathy new strategies for drug development. Transplant Proc. 30, 3989-3990 (1998).
- Hosenpud, J. D. Immune mechanisms of cardiac allograft vasculopathy an update. Transpl Immunol. 1, 237-249 (1993).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Kouwenhoven, E. A., de Bruin, R. W., Heemann, U. W., Marquet, R. L., Ijzermans, J. N. Late graft dysfunction after prolonged cold ischemia of the donor kidney inhibition by cyclosporine. Transplantation. 68, 1004-1010 (1999).
- Kouwenhoven, E. A., Ijzermans, J. N., de Bruin, R. W. Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction. Transpl Int. 13, 385-401 (2000).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Huang, X., Chen, D., Chen, L. [A modified model of cervical heterotopic cardiac transplantation for chronic rejection research]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, 1508-1510 (2008).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2, 471-480 (2007).
- Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105, 1609-1614 (2002).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64, 1598-1601 (1997).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplant Proc. 11, 571-577 (1979).
- Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10, 2231-2240 (2010).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Actapathologica et microbiologica Scandinavica Section A, Pathology. 79, 366-372 (1971).
