Muse Livmoderhalskræft Heart transplantation model ved hjælp af en modificeret Cuff Teknik

Summary

Den murine cervikal hjerte transplantation model er velegnet til immunologisk samt iskæmisk reperfusionsbeskadigelse studier. Vi modificerede procedure bruger en ikke-sutur manchet teknik og gennemført mere end 1.000 vellykkede transplantationer med denne tilgang.

Heri giver vi yderligere detaljer ved denne teknik at supplere videoen.

Abstract

Musemodeller er af særlig interesse for forskning, idet en lang række monoklonale antistoffer og kommercielt defineret indavlede og knockout-stammer er tilgængelige til at udføre mekanisk in vivo-undersøgelser. Mens hjertetransplantation modeller med en sutur teknik blev først succes udviklet i rotter blev oversættelsen til en lige så udbredt brugt museækvivalenten aldrig opnået på grund af den tekniske kompleksitet mikrokirurgisk procedure. I modsætning hertil blev der ikke sutur manchet teknikker, også oprindeligt udviklet i rotter med succes tilpasses til anvendelse i mus ^1-3. Denne teknik til revaskularisering involverer to store skridt I) krænge modtageren fartøj over en polyethylen manchet; II) trækker donorfartøjets over tidligere everteret modtager fartøj og holde den på plads med en perifer slips. Dette sikrer en kontinuitet endothellaget, kort driftstid og meget høje åbentstående kar ^4.

t "> Brug af denne teknik til vaskulære anastomose udførte vi mere end 1.000 cervikale hjertetransplantationer med en samlet succesrate på 95%. Til arteriel indstrømning den fælles carotidarterie og den proksimale aortabuen blev anastomoseret resulterer i en retrograd perfusion af det transplanterede hjerte. for venøs dræning lungepulsåren af transplantatet blev anastomoseret med den eksterne halsvene modtageren ^5.

Heri giver vi yderligere detaljer ved denne teknik at supplere videoen.

Introduction

Hjertetransplantation repræsenterer terapi valg for patienter, der lider af forskellige slutstadiet hjertesygdomme. Fremskridt inden for kirurgiske teknikker, mere effektiv forebyggelse af infektioner, og nye immunosuppressive regimer resulterede i markant forbedret resultat af organtransplantation ^6. Imidlertid har langsigtede graft overlevelse ikke forbedret strengt i de seneste år ^7. Kronisk afstødning, kendetegnet ved transplantation åreforkalkning fortsætter med at være en væsentlig hindring for langsigtede graft overlevelse ^8-11.

Modellen for heterotopisk hjerte transplantation i mus giver et vigtigt og brugbart redskab til analyse af immunologisk mekanisme under akut såvel som kronisk afstødning ^12-15.

Til dato er den hyppigste transplantation model er stadig den abdominale mus hjerte transplantation ved hjælp af sutur teknik. Den opadgående aorta af donor hjerte er anastomoseret til enbdominal aorta og lungepulsåren er anastomoseret til modtagerens vena cava inferior. Meget af den mikrokirurgisk sværhedsgrad af suturen model bygger på den lille størrelse af de fartøjer, som har suturerede ^16,17.

I modsætning til suturen model hjertet er placeret i halsregionen af ​​modtageren, hvor den eksterne halsvene er anastomeres lungepulsåren og fælles carotidarterie aorta donoren.

Begrundelsen for udviklingen af ​​livmoderhalskræft hjerte transplantation model ved hjælp af manchetten teknik var at have en dyremodel, som gør det muligt at opnå høj succesrate med grundlæggende mikrokirurgiske færdigheder, som vil give bred anvendelse af denne model. De største fordele ved denne metode er den betydeligt mindre forekommende anastomose relaterede komplikationer, såsom blødninger og thrombose i forhold til suturen model ^18.

Protocol

Dyrene er opstaldet i en barriere patogen fri facilitet. Alle dyr får menneskelig omsorg i overensstemmelse med "principper for Laboratory Animal Care" formuleret af den nationale Selskab for Medicinsk forskning "og" Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr "udarbejdet af National Academy of Sciences og offentliggjort af National Institutes of Health (NIH publikation nr. 86-23, revideret 1985). Alle forsøg er godkendt af det østrigske ministerium for Uddannelse, Videnskab og Kultur.

1. Modtager Forberedelse

1. Bedøver recipientdyrets med en intramuskulær injektion af xylazin (5 mg / kg legemsvægt) og ketamin (100 mg / kg legemsvægt).
2. Fjern alle hår af den laterale cervikale region af dyret og krat den operative felt tre gange ved hjælp chlorhexdine.
3. Placer musen i liggende stilling på den operative område.
4. Næste lave en incision i huden fra jugularis incision til højre undernæb.
5. Efterfølgende omsvøb mobilisere den rigtige eksterne halsvene (ejv) og opdele grenene mellem ligaturer.
6. Derefter opdele ejv mellem ligaturer og sørg for at efterlade nok længde til at krænge den proximale stump over manchetten krop.
7. Næste fjerne højre lap af submandibulære kirtel.
8. For venøs anastomose passere den proximale ende af ejv gennem polyethylen manchet og løse det ved grebet af manchetten med en mikro klemme.
9. Fjern ligatur ved udgangen af fartøjet, krænge lumen over manchet og ordne det med en 8-0 silke sløjfe (figur 1a).
10. Efterfølgende transektere den rigtige sternocleidomastoideus muskler med bipolar kautering at få adgang til den fælles halspulsåre.
11. Næste mobilisere den fælles halspulsåren og skære skibet mellem ligaturer.
12. Næste mobilisere den fælles halspulsåren og skære skibet mellem ligaturer.
13. Pass disdistale ende af fartøjet gennem manchetten, og fastgør den med arterie klemme.
14. Fjern ligatur ved enden af ​​beholderen og udspile lumen ved hjælp af vaskulære dilatators. Næste, i analogi med ejv, krænge arterien over manchet og ordne det med en 8-0 silke sløjfe.

2. Hjerte indkøb

1. Bedøver donormus med en intramuskulær injektion af xylazin (5 mg / kg legemsvægt) og ketamin (100 mg / kg legemsvægt). Derefter fjernes alle hår maveregionen af ​​dyret. Skrub den operative felt tre tid ved hjælp chlorhexdine. Næste sted musen i en liggende position på det operative område som tidligere beskrevet.
2. Efter en midterlinjen abdominal indsnit, trække indvoldene med Q-tip til venstre for at blotlægge vena cava inferior (IVC).
3. Indsprøjtes 400 pi af en 1: 4 heparin- natrium løsning i IVC til heparinisering.
4. Udfør en torakotomi og fold den forreste brystvæg løbet kranialt at få access til hjertet.
5. Dernæst fjerner thymus og gøre udluftning snit i venstre og højre vena cava superior.
6. Efterfølgende perfundere hjerte i en retrograd måde med 4 ° C HTK opløsning ved kanylering af aortabuen med en 27 G-sprøjte ved niveauet for den brachiocephale gren.
7. Ligere inferior og vena cava superior med 8-0 silke og dele dem distalt til ligaturer.
8. Næste opdele aortabuen på niveau med det foregående kanylering og dissekere fri pulmonal stammen og dividere det så langt distalt som muligt.
9. Efter at binde lungevenerne med en bulk ligatur og dele dem distalt til ligaturer.
10. Endelig fjerne hjertet fra donor websted og gemme det i 4 ° Celsius HTK opløsning (figur 1b).

3. Implantation

1. Placer hjerte transplantat i modtagerlandet halsregionen i en på hovedet position (Figur 1c
2. Næste træk pulmonal stammen af hjerte over venen manchet konstruktion af modtageren, og ordne det med en silke sløjfe (figur 1d).
3. Udfør anastomose mellem aorta af transplantatet og den udkrængede arterie hos dyret på samme måde (figur 1e).
4. Derefter fjernes den venøse klemme først, efterfulgt af den arterielle klemme. Hjertet er reperfunderes og begynder at slå i 1-2 min. Under reperfusion fugte hjerte med varme (35 ° C) saltvand.
5. Endelig lukke operationssåret med 6-0 kontinuerlige suturer (1E).

4. Postoperativ pleje, Endpoint

1. Giv op til 0,3 ml normalt saltvand ip postoperativt til væskeerstatning.
2. Placer dyret under en varmelampe indtil vågner fra anæstesi.
3. Når vågen, sende dyret tilbage til huset facilitet, hvor de får mad og vand ad libitum.
4. MInimer smerter i løbet af de første 7 postoperative dage administrere carprofen (4 mg / kg hver 12 timer subkutant (sc). Desuden giver Buprenorphin (0,1 mg / kg) lige efter operationen hver 12 timer i 5 dage.
5. Anskaf vægt (g) på hver modtager dyr om ugen for at vurdere korrekt ernæringsmæssige indtagelse. Hvis der er tegn på mere end 10-15% vægttab i forhold til vægt ved kirurgi-dato, apati, forkrøblende eller en meget bøjet ryg, ofre dyret med klemme isofluran inhalation, før de når den kliniske slutpunkt. Også ofre dyr efter hjertet er blevet afvist.

Representative Results

Figur 2 viser repræsentative data overlevelse af hjerteallografter fra BALB / c-donorer efter transplantation i fuldt MHC-fejlparrede C57BL / 6 modtagere. Hjerter bliver afvist på dag 7 ± 1 efter transplantation. Finger palpering af det transplanterede allograft er en følsom metode til påvisning af den tidsafhængige løbet af allotransplantatafstødning. Alle syngene hjerte transplantationer foretaget i vores serie overlevede på ubestemt tid (> 150 dage).

Figur 1: Intraoperative billeder (a) operative felt under modtager præparat (b) hjerte graft efter indkøb (c) Hjertet transplantat placeres i modtagerens halsregionen i en på hovedet position (d + e) Donoren stedet forud.... implantation. (f) Principskitse sygustrating modtageren fartøj, donor fartøj og manchetten

Figur 2: Cardiac allotransplantatoverlevelse. Kaplan-Meier-plot viser overlevelse af hjerte allotransplantat fra BALB / c-mus efter podning til fuldt MHC- uoverensstemmende BL6 modtagere (n = 7; gennemsnitlig overlevelsestid = 7 dage) samt en syngen kontrolgruppe (n = 7; graftoverlevelse > 150 dage). Dagen for afvisning blev defineret som den dag for ophør af hjerteslag.

Discussion

Afvisning af vaskulariserede allotransplantater medfører et væld af forskellige trin, som kun kan være utilstrækkeligt vurderet ved hjælp af in vitro-modeller. Fænomener som sensibilisering af modtagere antigenbehandling i sekundære lymfoide organer, men også differentiering og proliferation af immun-kompetente celler er bedre karakteriserede in vivo. Dyremodeller er dermed det ideelle værktøj til translationel forskning ^16. Musemodeller udgør stadig den gyldne standard i grundlæggende transplantation og immunologisk forskning siden en bred vifte af transgene og gen-knockout-mus er til rådighed, og et stort antal af immunologiske og diagnostiske værktøjer er blevet udviklet udelukkende til mus ^18. Den murine livmoderhalskræft hjerte transplantation model tilbyder et unikt redskab til at håndtere spørgsmål og udføre mekanistiske undersøgelser relateret til iskæmisk reperfusionsbeskadigelse, immunosuppression, akut og kronisk afstødning og tolerance induktion ^{1-3, 17, 22.}

Musen abdominal hjerte transplantation model ved hjælp af en sutur teknik blev først beskrevet af Corry et al. I 1973 ^19. Tekniske udfordringer forbundet med suture- anastomose af små fartøjer, som dog begrænses den udbredte anvendelse.

I 1991 Matsuura et al. Introducerede livmoderhalskræft hjerte transplantation model ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik i mus ^16. Siden introduktionen af Zimmerman et al. Og Kamada og Calne "manchetten teknik" er blevet brugt til mikrovaskulære anastomoser i flere forskellige murine modeller af organtransplantation ^20-22.

Vi har udviklet en modificeret ikke-sutur manchet teknik til revaskularisering og har gennemført over 1.000 vellykkede transplantationer i de sidste mange år, med succes satser> 95%. Flere forskellige strain kombinationer og behandlingsregimer blev anvendt. Anvendelse af teknikken beskrevet hanre, kan den samlede driftstid reduceres til omkring 45 minutter. Vigtigere samlede iskæmi tid kan holdes på 20 min med en implantation på mindre end 7 minutter, hvilket derimod er som regel mere end 15 minutter ved anvendelse af sutur teknik ^23. Sammenlignet med musen abdominale hjerte transplantation model cervikal hjerte transplantation har flere fordele, såsom mindre postoperativ stress og høj kirurgisk succesrate. Den hjerteslag graft kan nemt overvåges på grund af den overfladiske stilling. Komplikationer i forbindelse med sutur anastomose, herunder blødning og trombose er betydeligt mindre udbredt, når du bruger manchetten teknik ^18.

Følgende modifikationer af denne teknik foreslået af vores gruppe førte til en forbedret succesrate og til en dramatisk reduktion af driftstiden:

• Brug et tilbageskridt perfusion gennem aortabuen med 3 ml HTK løsning.
• Hold hjertet fugtig hjælp HTK solution under hele høst proceduren.
• Må ikke dissekere og selektiv Liger venstre vena cava superior.
• Brug mikro klemmer til occlude fartøjer, men vigtigere, også for at fastsætte manchetter.
• Brug vaskulære dilatators med superfine tips til at udspile den fælles halspulsåre, hvilket gør det meget nemmere at krænge fartøjet over manchetten.
• Anbring ikke holde suturer som oprindelig beskrevet af Matsuura et al.
• For arteriel anastomose bruge en manchet med en indvendig diameter på 0,5 mm og en udvendig diameter på 0,63 mm, til venøs anastomose en manchet med en indvendig diameter på 0,75 mm og en udvendig diameter på 0,94 mm.
• Brug manchetter med en længde på 2 mm med en 1 mm greb, der tjener til korrekt fiksering til beholderen ved hjælp af en vaskulær klemme.

En begrænsning, at denne metode kan have, er, at det kan være vanskeligt at opnå passende manchetter. Vi har derfor brugt kommercielt tilgængelige polyethylene manchetter fra Rivertech medicinsk (Chattanooga, TN).

Vigtigste fejlfinding under proceduren var som følger.

Blodgennemstrømning uorden: Skyl donor hjerte, indtil farven bliver hvid i farven. Flush uden alt for meget pres som for højt tryk skader protesen.

• Besvær med at krænge skibet over manchet: Kontroller igen, at fartøjet er (a) af tilstrækkelig længde, (b), fri for vedlagte fedt og bindevæv og (c) at sørge for, at skibet var godt udspilet, ved hjælp af vaskulære dilatators.
• Blødning på anastomotiske sted: bruge Q-tips til at lægge pres på angrebne sted for cirka 5 minutter.
• Veneblod strømningshindring Hovedsagelig forårsaget af vridning af halsvenen under processer manchet placering. Tag manchetten håndtaget på den venøse side.
• Graft vride og kvælning: Sørg for, at protesen er placeret korrekt i donorsiden før hudlukning.

in vivo-undersøgelser i forbindelse med transplantation immunologi. Vores ændrede tilgang giver opnå høj succesrate med grundlæggende mikrokirurgiske færdigheder, som vil give bred anvendelse af denne model. Denne video har til formål at hjælpe og vejlede andre forskere at etablere modellen i deres laboratorier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro vessel clip	S & T	B1 00396 V
Microscissor	FST	14075-11
Vesseldilatator	S & T	D-5a.2 00125
Microforceps	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Microvessel clip	S & T	B1 00396 V