Summary
Le modèle de transplantation cardiaque col de l'utérus de souris est bien adapté pour immunologique ainsi que des études de lésions d'ischémie reperfusion. Nous avons modifié la procédure en utilisant une technique de manchette non-suture et effectué plus de 1.000 transplantations réussies avec cette approche.
Ici, nous fournissons des détails supplémentaires de cette technique pour compléter la vidéo.
Abstract
Des modèles de souris sont d'un intérêt particulier dans la recherche depuis une grande variété d'anticorps monoclonaux et définis dans le commerce consanguine et souches de finale sont disponibles pour effectuer mécaniste des études in vivo. Alors que les modèles de transplantation cardiaque en utilisant une technique de suture ont été développés avec succès chez le rat, la traduction dans la tout aussi répandue équivalent murin utilisé n'a jamais été atteint en raison de la complexité technique de la procédure microchirurgicale. En revanche, les techniques non-suture boutons de manchette, également développé initialement chez le rat, ont été adaptés avec succès pour une utilisation chez les souris 1-3. Cette technique de revascularisation comporte deux grandes étapes I) éversantes le navire bénéficiaire sur une manchette de polyéthylène; II) en tirant le navire donneur sur le navire bénéficiaire anciennement retournée et le maintenir en place avec une cravate périphérique. Ceci assure une continuité de la couche endothéliale, de courte durée de fonctionnement et les taux de perméabilité très élevée 4.
t "> Grâce à cette technique pour l'anastomose vasculaire nous avons joué plus de 1000 transplantations cardiaques col de l'utérus avec un taux de réussite global de 95%. Pour l'apport artériel de l'artère carotide commune et la crosse de l'aorte proximale ont été anastomosée résultant en une perfusion rétrograde de la greffe du coeur. Pour le drainage veineux de l'artère pulmonaire de la greffe a été anastomosée avec la veine jugulaire externe du destinataire 5.Ici, nous fournissons des détails supplémentaires de cette technique pour compléter la vidéo.
Introduction
La transplantation cardiaque représente le traitement de choix pour les patients atteints de différentes maladies cardiaques en phase terminale. Les progrès des techniques chirurgicales, la prophylaxie des infections plus efficace, et de nouveaux traitements immunosuppresseurs ont donné lieu à une amélioration des résultats nettement de la transplantation d'organes 6. Cependant, la survie du greffon à long terme ne s'est pas améliorée avec rigueur au cours des dernières années 7. Le rejet chronique, caractérisé par l'artériosclérose de greffe continue d'être un obstacle majeur à long terme la survie du greffon 8-11.
Le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique chez la souris fournit un outil important et valable pour l'analyse de mécanisme immunologique pendant aiguë ainsi que le rejet chronique 12-15.
A ce jour le modèle de la transplantation est le plus souvent encore la transplantation cardiaque abdominale de la souris en utilisant la technique de suture. L'aorte ascendante du cœur du donneur est anastomosé à l'unaorte bdominal et l'artère pulmonaire est anastomosée à la veine cave inférieure du receveur. Une grande partie de la difficulté de microchirurgie du modèle de fil de suture est basée sur la taille réduite des vaisseaux, qui sont suturées 16,17.
Contrairement au modèle de fil de suture est placé au coeur de la région de col du récipient où la veine jugulaire externe est anastomosé à l'artère pulmonaire et l'artère carotide commune de l'aorte du donneur.
La raison de l'évolution du modèle de transplantation cardiaque col de l'utérus en utilisant la technique du brassard était d'avoir un modèle animal, ce qui permet d'atteindre des taux de réussite élevés avec des compétences de base de microchirurgie qui permettront une large application de ce modèle. Les principaux avantages de cette méthode sont l'anastomose se produit significativement moins de complications telles que hémorragie et de thrombose liée par rapport au modèle de fil de suture 18.
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Protocol
Les animaux sont logés dans une usine sans barrière de l'agent pathogène. Tous les animaux reçoivent des soins humaine en conformité avec les «directeurs de laboratoire de protection des animaux" formulées par la Société nationale pour la recherche médicale »et le« Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire »préparé par l'Académie nationale des sciences et publiées par le National Institutes of Health (NIH Publication no. 86-23, révisé 1985). Toutes les expériences sont approuvés par le ministère autrichien de l'Education, de la Science et de la Culture.
1. bénéficiaire Préparation
- Anesthésier l'animal receveur avec une injection intramusculaire de xylazine (5 mg / kg de poids corporel) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel).
- Retirer tous les poils de la région cervicale latérale de l'animal et frotter le champ opératoire trois fois en utilisant chlorhexdine.
- Passer la souris dans une position couchée sur le champ opératoire.
- Ensuite faire une incision de la peau de la jugulaire incision de la mandibule inférieure droite.
- Par la suite, mobiliser carrément la veine jugulaire externe droite (CPA) et de diviser les branches entre ligatures.
- Ensuite, divisez la CPA entre ligatures en veillant à laisser suffisamment de longueur pour retourner la souche proximale sur le corps brassard.
- Ensuite, enlevez le lobe droit de la glande sous-maxillaire.
- Pour l'anastomose veineuse passer l'extrémité proximale de la CPA par l'intermédiaire du manchon de polyéthylène et le fixer à la poignée de la manchette avec un micro pince.
- Retirez la ligature à l'extrémité de la cuve, retourner la lumière sur la manchette et le fixer avec un 8-0 boucle de soie (figure 1a).
- Par la suite transect le muscle sterno droite avec cautérisation bipolaire pour accéder à l'artère carotide commune.
- Suivant mobiliser l'artère carotide commune et couper le navire entre les ligatures.
- Suivant mobiliser l'artère carotide commune et couper le navire entre les ligatures.
- Passez les distal fin de la cuve par la manchette et le fixer avec la pince de l'artère.
- Retirer la ligature à l'extrémité du récipient et dilater la lumière en utilisant dilatateurs vasculaires. Ensuite, par analogie avec la CPA, retourner la artère sur le brassard et le fixer avec une boucle 8-0 de soie.
2.-Cœur achats
- Anesthésier la souris donneuse avec une injection intramusculaire de xylazine (5 mg / kg de poids corporel) et de kétamine (100 mg / kg de poids corporel). Ensuite, retirer tous les poils de la région abdominale de l'animal. Frotter le champ opératoire trois fois à l'aide chlorhexdine. Ensuite, placez la souris en position couchée sur le champ opératoire tel que décrit précédemment.
- Après une incision abdominale médiane, retirer les viscères avec Q-tips à gauche afin d'exposer la veine cave inférieure (VCI).
- Injecter 400 pi d'une solution à 1: 4 héparine sodium dans la VCI pour héparinisation.
- Effectuez une thoracotomie et plier la paroi thoracique antérieure sur crânienne à gagner seloness au cœur.
- Ensuite, retirez le thymus et faire la ventilation des incisions dans la veine cave supérieure gauche et à droite.
- Par la suite, perfuser le coeur d'une manière rétrograde de 4 ° Celsius solution HTK par cathétérisme de la crosse aortique avec une seringue G 27 au niveau de la branche brachiocéphalique.
- Ligaturer la veine cave inférieure et supérieure avec 8-0 soie et de les diviser de manière distale pour les ligatures.
- Suivant diviser la crosse de l'aorte au niveau de la ponction précédente et disséquer libre du tronc pulmonaire et diviser de manière distale dans la mesure du possible.
- Par la suite, lier les veines pulmonaires avec une ligature en vrac et de les diviser de manière distale pour les ligatures.
- Enfin, retirez le coeur de la zone donneuse et la stocker dans 4 ° Celsius solution HTK (figure 1b).
3 Implantation
- Placer la greffe de cœur dans la région du cou du destinataire dans une position à l'envers (figure 1c
- Suivant tirer le tronc pulmonaire du cœur sur la construction veine de manchette du destinataire et le fixer avec une boucle de soie (figure 1d).
- Effectuez l'anastomose entre l'aorte de la greffe et l'artère retournée de l'animal receveur de la même façon (figure 1e).
- Par la suite, retirer la pince veineuse en premier, suivi par la pince artérielle. Le cœur est reperfusé et se met à battre dans 1-2 min. Au cours de la reperfusion humidifier le cœur chaud (35 ° C) une solution saline.
- Enfin fermer la plaie chirurgicale avec 6-0 sutures continues (Figure 1e).
4. Soins postopératoires, Endpoint
- Donner jusqu'à 0,3 ml ip de solution saline normale après l'opération pour le remplacement des liquides.
- Placez l'animal sous une lampe chauffante jusqu'à ce que le réveil de l'anesthésie.
- Une fois réveillé, le réexpédier vers le centre d'hébergement où ils reçoivent de la nourriture et de l'eau ad libitum.
- Midouleur tienne pas compte pendant les 7 premiers jours postopératoires administrer carprofène (4 mg / kg toutes les sous-cutanée de 12 h (sc). De plus, donner Buprénorphine (0,1 mg / kg) juste après l'opération toutes les 12 heures pendant 5 jours.
- Obtenir le poids (g) de chaque hebdomadaire animal receveur à évaluer pour l'apport nutritionnel adéquat. S'il existe des preuves de plus de 10-15% de perte de poids par rapport à la masse à la chirurgie jour, l'apathie, paralysant ou un dos très courbé, sacrifier l'animal à l'aide inhalation isoflurane borne avant d'atteindre le point final clinique. Aussi sacrifier l'animal après que le cœur a été rejetée.
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Representative Results
La figure 2 montre les données de survie représentatives des allogreffes cardiaques provenant de donneurs BALB / c après la transplantation en pleine CMH incompatibles C57BL / 6 destinataires. Les coeurs sont rejetées au jour 7 ± 1 après la transplantation. Palpation de l'allogreffe transplanté est une méthode sensible pour détecter le cours dépend de rejet d'allogreffe de temps. Tous les transplantations cardiaques congénitaux réalisées dans notre série ont survécu indéfiniment (> 150 jours).
Figure 1: Les images peropératoires (a) champ opératoire pendant la préparation du destinataire (b) Coeur greffe après achat (c) La greffe cardiaque placé dans la région du cou de destinataire à l'envers de position (d + e) Le site donneur avant.... l'implantation. (f) de Schéma maladeustrating le navire destinataire, le navire donneur et le brassard
Figure 2: la survie de l'allogreffe cardiaque. Kaplan-Meier afficher la survie de l'allogreffe cardiaque chez des souris BALB / c après la greffe des receveurs BL6 entièrement MHC dépareillées (n = 7; durée de survie moyenne = 7 jours) ainsi qu'un groupe témoin syngénique (n = 7, la survie du greffon > 150 jours). Le jour de rejet a été défini comme le jour de l'arrêt du battement de coeur.
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Discussion
Rejet des allogreffes vascularisées entraîne une pléthore de différentes étapes qui ne peuvent être insuffisamment évalués en utilisant des modèles in vitro. Les phénomènes tels que la sensibilisation des destinataires, le traitement de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires, mais aussi la différenciation et la prolifération des cellules immunocompétentes sont mieux caractérisée in vivo. Les modèles animaux sont ainsi l'outil idéal pour la recherche translationnelle 16. Des modèles de souris représentent encore l'étalon-or dans la transplantation de base et de la recherche immunologique depuis une large gamme de souris transgéniques et knock-out de gène sont disponibles, et un grand nombre d'outils immunologiques et diagnostiques ont été développées exclusivement pour les souris 18. Le modèle de transplantation cardiaque col de l'utérus de souris offre un outil unique pour répondre aux questions et effectuer des études mécanistiques liées à des blessures de l'ischémie reperfusion, immunosuppression, le rejet aigu et chronique et l'induction de tolérance 1-3, 17, 22.
Le modèle de transplantation cardiaque de la souris abdominale en utilisant une technique de suture a été décrite par Corry et al., En 1973, 19. Défis techniques associés à l'anastomose suture- des petits vaisseaux, cependant, limité son utilisation à grande échelle.
En 1991, Matsuura et al. Introduit le modèle de transplantation cardiaque du col à l'aide d'une technique de suture manchette non chez les souris 16. Depuis son introduction par Zimmerman et al., Et Kamada et Calne "la technique du brassard" a été utilisé pour des anastomoses microvasculaires dans plusieurs différents modèles murins de transplantation d'organes 20-22.
Nous avons développé une technique de manchette non-suture modifiée pour la revascularisation et avons réalisé plus de 1000 transplantations réussies de ces dernières années, avec des taux de succès> 95%. Plusieurs combinaisons différentes de contrainte et des schémas thérapeutiques ont été utilisés. L'application de la technique qu'il décritre, la durée de fonctionnement totale peut être réduite à environ 45 min. Surtout le temps d'ischémie totale peut être maintenue à 20 min avec un temps d'implantation de moins de 7 minutes, ce qui en revanche est généralement de plus de 15 min pour l'utilisation de la technique de suture 23. Par rapport au modèle abdominale de transplantation cardiaque de la souris, col de l'utérus transplantation cardiaque a plusieurs avantages, tels que le stress post-opératoire mineur et le taux de succès chirurgical élevé. Le battement de la greffe de cœur peut être facilement contrôlée en raison de la position superficielle. Les complications associées à suture anastomose, y compris un saignement et la thrombose sont beaucoup moins courante en utilisant la technique de la coiffe 18.
Les modifications de cette technique proposée par notre groupe a conduit à une amélioration des taux de succès et à une réduction considérable de la durée de fonctionnement suivants:
- Utilisez une perfusion rétrograde à travers l'arc aortique avec 3 ml de solution HTK.
- Garder le coeur en humide en utilisant HTK solution au cours de toute la procédure de prélèvement.
- Ne pas disséquer et ligaturer sélective de la veine cave supérieure gauche.
- Utilisez les pinces micro pour obturer les vaisseaux, mais, surtout, également de fixer les poignets.
- Utilisez dilatateurs vasculaires avec des conseils ultrafines distend l'artère carotide commune qui le rend beaucoup plus facile de retourner la cuve sur le brassard.
- Ne placez pas la tenue des sutures aussi originales décrites par Matsuura et al.
- Pour l'anastomose artérielle en utilisant un ballonnet d'un diamètre intérieur de 0,5 mm et un diamètre extérieur de 0,63 mm, pour l'anastomose veineuse avec une manchette d'un diamètre intérieur de 0,75 mm et un diamètre extérieur de 0,94 mm.
- Utilisation poignets avec une longueur de 2 mm avec une poignée de 1 mm, qui sert à sa fixation correcte de la cuve, à l'aide d'une pince vasculaire.
Une limitation de cette méthode qui peut avoir est qu'il peut être difficile d'obtenir des poignets appropriées. Nous avons donc utilisé disponible dans le commerce ppoignets olyéthylène de Rivertech médical (Chattanooga, TN).
Principal tir de difficulté lors de la procédure sont les suivantes.
trouble de la circulation du sang: le cœur du donneur Rincer jusqu'à ce que la couleur devient blanche. Rincer sans trop de pression à titre de dommages de pression excessives de la greffe.
- Difficulté à se retourner le navire sur le brassard: vérifier que le navire est (a) d'une longueur suffisante, (b) sans gras ci-joint et les tissus conjonctifs et (c) faire en sorte que le navire était bien distendu, en utilisant dilatateurs vasculaires.
- Saignement au site de l'anastomose: utiliser des cotons-tiges pour appliquer une pression au site affecté pendant environ 5 min.
- Obstruction de la circulation sanguine veineuse: Principalement causée par la torsion de la veine jugulaire au cours des processus de placement brassard. Retirez la poignée du brassard sur le site veineuse.
- Greffe de torsion et de strangulation: Assurez-vous que le greffon est correctement placé dans le côté des bailleurs de fonds avant la fermeture de la peau.
in vivo des études liées à l'immunologie de transplantation. Notre approche modifiée permet d'atteindre des taux de réussite élevés avec des compétences de base de microchirurgie qui permettront une large application de ce modèle. Cette vidéo a pour but d'aider et de guider d'autres recherches pour établir le modèle dans leurs laboratoires.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
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