Summary
Die murine Gebärmutterhalskrebs Herztransplantation Modell ist für immunologische sowie Ischämie Reperfusionsschaden Studien gut geeignet. Wir modifizierten das Verfahren mit einem nicht-Nahttechnik und Manschette durchgeführt mehr als 1.000 erfolgreiche Transplantationen mit diesem Ansatz.
Hier stellen wir weitere Einzelheiten dieser Technik, um das Video zu ergänzen.
Abstract
Mausmodelle sind von besonderem Interesse in der Forschung seit einer Vielzahl von monoklonalen Antikörpern und kommerziell Inzucht definiert und Knockout-Stämme sind in-vivo-Studien Mechanismus durchzuführen. Während Herztransplantation Modelle mit einer Nahttechnik wurden zunächst erfolgreich an Ratten entwickelt wurde, war die Übersetzung in eine ebenso weit verbreitete gebrauchte murine Äquivalent nie aufgrund der technischen Komplexität der mikrochirurgischen Verfahren erreicht. Im Gegensatz dazu wurden nicht-Nahtmanschette Techniken auch bei Ratten ursprünglich entwickelt, erfolgreich für die Verwendung in Mäusen 1-3 angepasst. Diese Technik für Revaskularisierung umfasst zwei Hauptschritte I) Umstülpen des Empfängergefäßes über einen Polyethylen Manschette; II) Ziehen des abgebenden Schiffes über die früher umgestülpt Empfängergefäßes und hielt ihn an Ort und Stelle mit einer umlaufenden Krawatte. Dies gewährleistet eine Kontinuität der Endothelschicht, kurze Betriebszeit und sehr hohe Durchgängigkeitsraten 4.
t "> Unter Verwendung dieser Technik für die vaskuläre Anastomose führten wir mehr als 1.000 zervikalen Herztransplantationen mit einer Erfolgsquote von 95%. arterielle Zufluss der Arteria carotis communis und das proximal Aortenbogen wurden anastomosiert was eine retrograde Perfusion des transplantierten Herzens. für venöse Drainage wurde die Lungenarterie des Transplantats mit der externen Halsschlagader des Empfängers 5 anastomosiert.Hier stellen wir weitere Einzelheiten dieser Technik, um das Video zu ergänzen.
Introduction
Herztransplantation stellt die Therapie der Wahl bei Patienten mit verschiedenen Endstadium Herzerkrankungen. Fortschritte in der chirurgischen Techniken, effektiver Prophylaxe von Infektionen und neuartige Immunsuppressiva führte zu deutlich verbesserten Ergebnis der Organtransplantation 6. Doch langfristige Transplantatüberleben wurde nicht konsequent in den letzten Jahren 7 verbessert. Chronische Abstoßung, gekennzeichnet durch Transplantat-Arteriosklerose ist weiterhin ein großes Hindernis für die langfristige Überleben des Transplantats 8-11 sein.
Das Modell der heterotopen Herztransplantation bei Mäusen eine wichtige und gültige Werkzeug zur Analyse von immunologischen Mechanismus während der akuten als auch chronischen Abstoßung 12-15.
Bis heute die häufigste Transplantationsmodell ist immer noch die Bauch Maus Herztransplantation mit der Nahttechnik. Die aufsteigenden Aorta des Spenderherzens an die eine Anastomosebdominal Aorta und der Lungenarterie ist an der unteren Hohlvene des Empfängers anastomosiert. Viel von der mikro Schwierigkeit des Naht Modell basiert auf der geringen Größe der Gefäße, die genäht werden 16,17 basiert.
Im Gegensatz zu dem Nahtmaterial-Modell wird das Herz in den Halsbereich des Empfängers, wo die äußere Jugularvene wird zur Lungenarterie und der Arteria carotis communis die Aorta anastomosiert des Spenders angeordnet.
Das Grundprinzip der Entwicklung der Halsherztransplantation Modell mit Hilfe der Manschette Technik war es, ein Tiermodell, der hohen Erfolgsraten mit grundlegenden mikrochirurgischen Fähigkeiten, die breite Anwendung dieses Modells erlauben wird ermöglicht. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die deutlich weniger auftritt Anastomose verbundenen Komplikationen wie Blutungen und Thrombosen im Vergleich zu dem Fadenmodell 18.
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Protocol
Tiere werden in einem barrierefreie Einrichtung Erreger untergebracht. Alle Tiere erhalten menschlicher Obhut in Übereinstimmung mit den "Principals of Laboratory Animal Care" von der National Society for Medical Research "und dem" Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren "der Nationalen Akademie der Wissenschaften vorbereitet formuliert und veröffentlicht von der National Institutes of Health (NIH Publikation nicht. 86-23, überarbeitet 1985). Alle Versuche werden vom Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur genehmigt.
1. Empfänger Vorbereitung
- Betäuben die Empfängertier mit einer im Injektion von Xylazin (5 mg / kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
- Entfernen Sie alle Haare der seitlichen Halsbereich des Tieres und schrubben das Operationsfeld dreimal mit chlorhexdine.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Operationsfeld.
- Weiter machen einen Hautschnitt von der Halsschlag incision auf der rechten Unterkiefer.
- Anschließend unverblümt zu mobilisieren, die rechte äußere Halsschlagader (EJV) und teilen die Zweige zwischen Ligaturen.
- Dann teilen Sie die EJV zwischen Ligaturen und achten Sie auf eine ausreichende Länge zu verlassen, um den proximalen Stumpf über die Manschette Körper umzustülpen.
- Nächstes entfernen Sie den rechten Lappen der Unterkieferspeicheldrüse.
- Für die venöse Anastomose passieren das proximale Ende des EJV durch die Polyethylen Manschette und befestigen Sie es am Griff der Manschette mit einem Mikroklemme.
- Entfernen Sie die Ligatur am Ende des Schiffes, umstülpen, das Lumen über der Manschette und fixieren Sie es mit einem 8-0 Seidenschleife (Abbildung 1a).
- Anschließend durchschneiden das Recht M. sternocleidomastoideus mit bipolaren Kauter, um Zugang zu der A. carotis communis zu gewinnen.
- Weiter zu mobilisieren, die Arteria carotis communis und schneiden das Schiff zwischen den Ligaturen.
- Weiter zu mobilisieren, die Arteria carotis communis und schneiden das Schiff zwischen den Ligaturen.
- Führen Sie die distal Ende des Schiffes durch die Manschette und fixieren Sie es mit der Arterienklemme.
- Entfernen Sie die Ligatur am Ende des Schiffes und dehnen das Lumen mit Gefäß Dilatatoren. Weiter, in Analogie zu der EJV Evert die Arterie über der Manschette und fixieren Sie es mit einem 8-0 Seidenschleife.
2. Herz Beschaffung
- Betäuben die Spendermaus mit einer im Injektion von Xylazin (5 mg / kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). Dann entfernen Sie alle Haare der Bauchbereich des Tieres. Schrubben das Operationsfeld drei Mal mit chlorhexdine. Nächsten Ort die Maus in Rückenlage auf dem Operationsfeld wie zuvor beschrieben.
- Nach einer Mittellinie Bauchschnitt, schieben Sie der Eingeweide mit Q-Tips auf der linken Seite, um die untere Hohlvene (IVC) aus.
- Injizieren 400 ul einer 1: 4 Heparin-Natrium-Lösung in den IVC für Heparinisierung.
- Führen Sie eine Thorakotomie und klappen Sie den vorderen Brustwand über kranial nach gewinneness zum Herzen.
- Dann entfernen Sie den Thymus und Entlüftung machen Einschnitte in der linken und der rechten oberen Hohlvene.
- Anschließend versorgen die Herzretrograd mit 4 ° Celsius HTK-Lösung durch Kanülierung der Aortenbogen mit einem 27 G Spritze auf der Ebene der brachiozephalen Zweig.
- Ligieren den unteren und oberen Hohlvene mit 8-0 Seide und teilen sie distal zu den Ligaturen.
- Weiter teilen den Aortenbogen auf dem Niveau des vorherigen Kanülierung und sezieren die kostenlose Lungen Stamm und teilen sie so weit distal wie möglich.
- Im Anschluss daran binden die Lungenvenen mit einer Schüttligation und teilen sie distal zu den Ligaturen.
- Schließlich entfernen Sie das Herz aus der Entnahmestelle und speichern sie in 4 ° Celsius HTK-Lösung (Abbildung 1b).
3. Implantation
- Legen Sie die Herzen Transplantat im Empfängerhalsbereich in einer umgekehrten Position (Abbildung 1c
- Weiter ziehen Sie den Stamm der Lungen Herz über die Vene Manschette Konstrukt des Empfängers und fixieren Sie sie mit einem Seidenschleife (Abbildung 1d).
- Führen Sie die Anastomose zwischen der Aorta des Transplantats und dem umgestülpten Arterie des Empfängertieres in der gleichen Weise (Abbildung 1e).
- Anschließend entfernen Sie die venöse Klemme zuerst, gefolgt von der Arterienklemme. Das Herz wird reperfundiert und beginnt innerhalb von 1-2 min zu schlagen. Während der Reperfusion zu befeuchten das Herz mit warm (35 ° Celsius) Kochsalzlösung.
- Schließlich schließen Sie die OP-Wunde mit 6-0 kontinuierliche Nähte (Abbildung 1e).
4. Postoperative Behandlung, Endpoint
- Gib bis zu 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung ip postoperativ für Flüssigkeitsersatz.
- Legen Sie das Tier unter einer Wärmelampe bis Erwachen aus der Narkose.
- Einmal wach, bringen Sie das Tier mit dem Gehäuse Anlage, wo sie Nahrung und Wasser ad libitum erhalten.
- Auf minimize Schmerzen während der ersten 7 Tage nach der Operation zu verabreichen Carprofen (4 mg / kg alle 12 Stunden subkutan (sc). Darüber hinaus geben Buprenorphin (0,1 mg / kg) unmittelbar nach der Operation alle 12 Stunden für 5 Tage.
- Erhalten das Gewicht (g) jedes Empfängertier wöchentlich, um für die richtige Nahrungsaufnahme zu beurteilen. Wenn es Hinweise auf mehr als 10-15% Gewichtsverlust im Vergleich zu Gewicht bei der Operation-date, Apathie, Lähmung oder eine sehr zurückgebogen, zu opfern das Tier mit Terminal-Isofluran Inhalation vor dem Erreichen der klinischen Endpunkt. Auch das Tier zu opfern, nach dem Herzen abgelehnt wurde.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt repräsentative Überlebensdaten von Herzallotransplantaten von BALB / c-Spendern nach Transplantation in vollständig übereinstimm MHC C57BL / 6 Empfängern. Herzen werden an Tag 7 ± 1 nach der Transplantation abgelehnt. Finger Palpation des transplantierten Allograft ist eine empfindliche Methode, um den zeitlichen Verlauf der Transplantatabstoßung zu erkennen. Alle syngenen Herztransplantationen in unserer Serie durchgeführt lebt auf unbestimmte Zeit (> 150 Tage).
Abbildung 1: Intraoperative Bilder (a) Operationsfeld während der Empfängervorbereitung (b) Herztransplantat nach der Beschaffung (c) Das Herz Transplantat im Empfängerhalsbereich in einer umgedrehten Position (d + e) Die Entnahmestelle vor.... der Implantation. (f) Schematische Darstellung krankustrating den Empfänger Fahrzeug, das abgebende Schiff und die Manschette
Abbildung 2: Herztransplantatüberleben. Kaplan-Meier-Plot Darstellung der Überlebensrate von Herztransplantat von BALB / c Mäusen nach Transplantation in vollständig übereinstimm MHC BL6 Empfänger (n = 7; mittlere Überlebenszeit = 7 Tage) sowie eine syngene Kontrollgruppe (n = 7; Transplantatüberleben > 150 Tage). Der Tag der Ablehnung wurde als der Tag der Beendigung der Herzschlag festgelegt.
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Discussion
Ablehnung der gefäß Allografts bringt eine Fülle von verschiedenen Schritten, die nur unzureichend mit in-vitro-Modellen bewertet werden können. Phänomene wie die Sensibilisierung von Empfängern, die Antigenprozessierung in sekundäre lymphatische Organe, sondern auch die Differenzierung und Proliferation von immunkompetenten Zellen sind dadurch besser in vivo. Tiermodelle sind damit das ideale Werkzeug für translationale Forschung 16. Mausmodelle stellen immer noch den Goldstandard in der Grundlagentransplantation und immunologische Forschung seit einem breiten Spektrum von transgenen und Gen-Knockout-Mäuse zur Verfügung stehen, und eine große Anzahl von immunologischen und Diagnose-Tools haben exklusiv für Mäuse 18 entwickelt worden. Die murine zervikalen Herztransplantationsmodell bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Fragen zu beantworten und führen mechanistische Studien von Ischämie-Reperfusionsverletzung, Immunsuppression, akute und chronische Abstoßung und Toleranzinduktion 1-3, 17, 22 zusammen.
Das Mausbauchherztransplantationsmodell unter Verwendung eines Nahttechnik wurde zuerst von Corry et al. 1973 19. Technische Herausforderungen mit suture- Anastomose kleiner Gefäße verbunden sind, jedoch ihre breite Anwendung beschränkt.
1991, Matsuura et al. Erläutert den zervikalen Herztransplantationsmodell unter Verwendung eines nicht-Nahtmanschettenverfahren bei Mäusen 16. Seit der Einführung von Zimmerman et al. Und Kamada und Calne "Manschettentechnik" für mikrovaskulären Anastomosen in verschiedenen Mausmodellen der Organtransplantation 20-22 verwendet.
Wir haben ein modifiziertes Nicht-Nahtmanschette Technik zur Revaskularisation entwickelt und über 1.000 erfolgreiche Transplantation in den letzten Jahren abgeschlossen, mit Erfolgsraten> 95%. Mehrere verschiedene Stammkombinationen und Behandlungsschemata verwendet wurden. Anwendung der Technik beschreibt erRe, kann die Gesamtbetriebszeit auf etwa 45 Minuten reduziert werden. Wichtig ist die Gesamt Ischämie Zeit bei 20 min mit einer Implantationszeit von weniger als 7 Minuten, was im Gegensatz ist in der Regel mehr als 15 min bei der Verwendung des Nahttechnik 23 gehalten werden. Verglichen mit der Maus Bauchherztransplantation Modell hat Gebärmutterhalskrebs Herztransplantation mehrere Vorteile, wie zum Beispiel kleinere postoperativen Stress und hohem Operationserfolgsquote. Das Schlagen des Herzens Transplantat kann leicht durch die oberflächliche Lage überwacht werden. Komplikationen, die mit Naht Anastomose, einschließlich Blutungen und Thrombosen sind deutlich seltener, wenn Sie die Manschette Technik 18.
Die folgenden Modifikationen dieser Technik vorgeschlagen von unserer Gruppe führte zu einer verbesserten Erfolgsquote und zu einer drastischen Reduzierung der Betriebszeit:
- Verwenden Sie eine retrograde Perfusion durch den Aortenbogen mit 3 ml HTK-Lösung.
- Halten Sie das Herz feucht mit HTK-Solution während der gesamten Ernteverfahren.
- Nicht sezieren Sie und selektive Ligat die linke obere Hohlvene.
- Verwenden Sie die Mikroklemmen, um die Gefäße zu verschließen, aber wichtiger ist, auch für die Handschellen zu fixieren.
- Verwenden Gefäß Dilatatoren mit super Tipps, um die Halsschlagader, die es viel einfacher, das Schiff über die Manschette umstülpen, macht dehnen.
- Stellen Sie keine Nähte halten als Original von Matsuura et al.
- Für den arteriellen Anastomose mit einem Bund mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm und einem Außendurchmesser von 0,63 mm, für die venöse Anastomose eine Manschette mit einem Innendurchmesser von 0,75 mm und einem Außendurchmesser von 0,94 mm.
- Verwenden Bündchen mit einer Länge von 2 mm mit einem 1 mm Griff, der an der richtigen Fixierung dient dazu, das Schiff mit Hilfe eines Gefäßklemme.
Eine Einschränkung, dass diese Methode haben könnte ist, dass es schwierig sein kann, geeignete Manschetten zu erhalten. Wir haben daher im Handel erhältlich polyethylene Bündchen aus Rivertech medizinische (Chattanooga, TN).
Hauptfehlersuche während des Verfahrens waren wie folgt.
Blutfluss Störung: Flush Spenderherz, bis die Farbe wird in der Farbe weiß. Bündig, ohne zu viel Druck, wie übermäßiger Druck schädigt die Graft.
- Schwierigkeiten, das Schiff über die Manschette umzustülpen: Ermitteln Sie, dass das Schiff (a) von ausreichender Länge, (b) frei von Fett gebunden und Bindegewebe und (c) stellen Sie sicher, dass das Schiff war auch aufgetrieben, mit Gefäß Dilatatoren.
- Blutungen an Anastomosenstelle: Verwenden Q-Tipps, um Druck auf betroffene Stelle für ca. 5 min an.
- Venösen Blutströmungshindernis: Hauptsächlich durch Torsion der Halsschlagader bei den Prozessen der Manschette Platzierung verursacht. Entfernen Sie die Manschette Griff an der venösen Seite.
- Graft Verdrehen und Strangulation: Stellen Sie sicher, dass das Transplantat richtig in der Geberseite vor Hautverschluss gesetzt.
in-vivo-Studien zur Transplantation Immunologie zusammen. Unsere modifizierte Ansatz ermöglicht hohen Erfolgsraten mit grundlegenden mikrochirurgischen Fähigkeiten, die breite Anwendung dieses Modells ermöglicht. Dieses Video soll helfen und andere Forschungen, um das Modell in ihren Laboratorien zu etablieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
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