Summary
Il modello murino di trapianto di cuore cervicale è adatto per immunologica nonché studi danno da ischemia riperfusione. Abbiamo modificato la procedura utilizzando una tecnica bracciale non sutura ed eseguito più di 1.000 trapianti di successo con questo approccio.
Qui, forniamo ulteriori dettagli di questa tecnica per integrare il video.
Abstract
Modelli murini sono di particolare interesse per la ricerca in quanto una grande varietà di anticorpi monoclonali e commercialmente definiti inbred e ceppi di eliminazione diretta sono a disposizione per effettuare meccanicistico studi in vivo. Mentre i modelli di trapianto di cuore utilizzando una tecnica di sutura sono stati sviluppati con successo nei ratti, la traduzione in un altrettanto diffuso equivalente murino usato non è mai stata raggiunta a causa della complessità tecnica del procedimento microchirurgico. Al contrario, le tecniche di gemelli non sutura, anche sviluppati inizialmente nei ratti, sono stati adattati con successo per l'utilizzo nei topi 1-3. Questa tecnica di rivascolarizzazione prevede due fasi principali I) eversione della nave ricevente su un bracciale in polietilene; II) tirando la nave cedente sopra la nave ricevente precedentemente estroflesso e tenendolo in posizione con un pareggio circonferenziale. Ciò garantisce una continuità dello strato endoteliale, tempo di funzionamento breve e molto elevati tassi di pervietà 4.
t "> Utilizzando questa tecnica di anastomosi vascolare abbiamo effettuato più di 1.000 trapianti di cuore cervicale con un tasso di successo complessivo del 95%. Per afflusso arterioso l'arteria carotide comune e l'arco aortico prossimale sono stati anastomizzata conseguente perfusione retrograda del cuore trapiantato. Per il drenaggio venoso polmonare dell'innesto è stata anastomizzata con la vena giugulare esterna del destinatario 5.Qui, forniamo ulteriori dettagli di questa tecnica per integrare il video.
Introduction
Il trapianto cardiaco rappresenta la terapia di scelta per i pazienti affetti da diverse malattie di cuore allo stadio terminale. I progressi nelle tecniche chirurgiche, più efficace profilassi delle infezioni, e nuovi regimi immunosoppressivi determinato marcatamente migliore risultato del trapianto di organi 6. Tuttavia, la sopravvivenza del trapianto a lungo termine non è migliorata con rigore negli ultimi anni 7. Rigetto cronico, caratterizzata da trapianto arteriosclerosi continua ad essere un grave ostacolo per la sopravvivenza del trapianto a lungo termine 8-11.
Il modello di trapianto cardiaco eterotopico nei topi fornisce uno strumento importante e valido per l'analisi del meccanismo immunologico durante acuta e rigetto cronico 12-15.
Ad oggi il modello di trapianto più frequente è ancora il trapianto di cuore del mouse addominale utilizzando la tecnica di sutura. L'aorta ascendente del cuore del donatore viene anastomizzato alla unbdominal aorta e l'arteria polmonare è anastomizzati alla vena cava inferiore del destinatario. Gran parte delle difficoltà microchirurgico del modello di sutura si basa sulla piccola dimensione dei vasi, che vengono suturate 16,17.
In contrasto con il modello sutura cuore è posto nella regione del collo del recipiente in cui la vena giugulare esterna è anastomizzato l'arteria polmonare e l'arteria carotide comune l'aorta del donatore.
La logica dello sviluppo del modello di trapianto di cuore cervicale con la tecnica bracciale era di avere un modello animale, che permette di ottenere alte percentuali di successo con le abilità di microchirurgia di base che permetteranno un'ampia applicazione di questo modello. I principali vantaggi di questo metodo sono l'anastomosi significativamente meno che si verificano complicazioni come emorragie e trombosi correlata rispetto al modello di sutura 18.
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Protocol
Gli animali sono alloggiati in una struttura senza barriere patogeno. Tutti gli animali ricevono cure umana nel rispetto dei "Principi di cura degli animali da laboratorio" formulate dalla Società Nazionale per la ricerca medica "e la" Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ", preparati dalla National Academy of Sciences e pubblicata dal National Institutes of Health (NIH Publication no. 86-23, rivisto 1985). Tutti gli esperimenti sono approvati dal Ministero della Pubblica Istruzione, la Scienza e la Cultura austriaca.
1 Destinatario Preparazione
- Anestetizzare il destinatario animale con una iniezione im di xilazina (5 mg / kg di peso corporeo) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo).
- Rimuovere tutti i capelli della regione cervicale laterale dell'animale e macchia il campo operatorio tre volte utilizzando chlorhexdine.
- Posizionare il mouse in posizione supina sul campo operatorio.
- Successivo fare una incisione cutanea dal inc giugulareIsion alla mandibola in basso a destra.
- Successivamente, senza mezzi termini mobilitare la giusta vena giugulare esterna (EJV) e dividere i rami tra legature.
- Poi dividere il EJV tra legature avendo cura di lasciare una lunghezza sufficiente per rovesciare il moncone prossimale sul corpo del bracciale.
- Avanti rimuovere il lobo destro della ghiandola sottomandibolare.
- Per l'anastomosi venosa passare l'estremità prossimale del EJV attraverso il bracciale polietilene e fissarlo alla maniglia del bracciale con un micro pinza.
- Rimuovere la legatura alla fine della nave, Evert il lume sopra il bracciale e fissarlo con un 8-0 loop di seta (Figura 1a).
- Successivamente transetto il muscolo sternocleidomastoideo destro con cauterizzazione bipolare per accedere alla carotide comune.
- Successivo mobilitare l'arteria carotide comune e tagliare il vaso tra le legature.
- Successivo mobilitare l'arteria carotide comune e tagliare il vaso tra le legature.
- Passare i disTal fine della nave attraverso il bracciale e fissarla con la fascetta arteria.
- Rimuovere la legatura all'estremità della nave e distendere il lume usando dilatatori vascolari. Successivamente, in analogia al EJV Evert l'arteria sopra il bracciale e fissarlo con un ciclo di 8-0 seta.
Procurement 2 Cuore
- Anestetizzare il topo donatore con un'iniezione im di xilazina (5 mg / kg di peso corporeo) e ketamina (100 mg / kg di peso corporeo). Quindi rimuovere tutti i capelli della regione addominale dell'animale. Scrub il campo operativo tre volte utilizzando chlorhexdine. Posto Avanti il mouse in posizione supina sul campo operatorio come precedentemente descritto.
- A seguito di una incisione addominale mediana, ritrarre i visceri con Q-punte a sinistra, al fine di esporre la vena cava inferiore (IVC).
- Iniettare 400 ml di una 1: soluzione di sodio 4 eparina nella IVC per eparinizzazione.
- Eseguire una toracotomia e piegare la parete toracica anteriore sopra cranialmente per guadagnare access al cuore.
- Quindi, rimuovere il timo e fare sfiato incisioni nella vena cava superiore sinistra e destra.
- Successivamente, profumato cuore in maniera retrograda con 4 ° C la soluzione HTK dalla cannulazione dell'arco aortico con una siringa G 27 a livello del ramo brachiocefalico.
- Legare l'inferiore e vena cava superiore con 8-0 seta e dividerli distalmente alle legature.
- Accanto dividere aortico a livello della cannulazione precedente e sezionare libera il tronco polmonare e dividerlo per quanto distalmente possibile.
- In seguito, legare le vene polmonari con una legatura di massa e dividerli distalmente alle legature.
- Infine, rimuovere il cuore dal sito donatore e conservarla in 4 ° Celsius soluzione HTK (Figura 1b).
3. impianto
- Posizionare il trapianto di cuore nella regione del collo destinatario in una posizione capovolta (Figura 1c
- Successivo tirare il tronco polmonare del cuore sopra il costrutto bracciale vena del destinatario e fissarlo con un ciclo di seta (Figura 1d).
- Eseguire l'anastomosi tra l'aorta dell'innesto e l'arteria estroflesso del destinatario degli animali nello stesso modo (Figura 1e).
- Successivamente, rimuovere il morsetto venoso prima, seguita dalla pinza arteriosa. Il cuore è riperfuso e inizia a battere in 1-2 min. Durante la riperfusione inumidire il cuore con caldo (35 ° C) soluzione salina.
- Infine, chiudere la ferita chirurgica con 6-0 sutura continua (Figura 1e).
4 Cura postoperatoria, Endpoint
- Rinunciare a 0,3 ml di soluzione fisiologica normale ip dopo l'intervento per la sostituzione del fluido.
- Posizionare l'animale sotto una lampada di calore fino risveglio dall'anestesia.
- Una volta sveglio, rispedire l'animale verso la struttura alloggiativa dove ricevono cibo e acqua ad libitum.
- A MIdolore nimize durante i primi 7 giorni postoperatori amministrare carprofene (4 mg / kg per via sottocutanea ogni 12 ore (sc). Inoltre, dare buprenorfina (0,1 mg / kg), subito dopo l'operazione ogni 12 ore per 5 giorni.
- Ottenere il peso (g) di ogni destinatario animale settimanale per valutare il corretto apporto nutrizionale. Se vi sono prove di oltre il 10-15% di perdita di peso rispetto al peso alla chirurgia-data, apatia, paralizzante o una schiena molto piegata, sacrificare l'animale con terminale inalazione isoflurano prima di raggiungere il punto finale clinico. Anche sacrificare l'animale dopo che il cuore è stato respinto.
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Representative Results
La Figura 2 mostra i dati di sopravvivenza rappresentativi di trapianti cardiaci da donatori BALB / c dopo il trapianto in pieno MHC non corrispondenti C57BL / 6 destinatari. I cuori sono respinti il giorno 7 ± 1 dopo il trapianto. Finger palpazione del trapianto allogenico trapiantato è un metodo sensibile per rilevare il corso dipendente dal tempo di rigetto. Tutti i trapianti di cuore eseguiti singeniche nella nostra serie sono sopravvissuti a tempo indeterminato (> 150 giorni).
Figura 1: immagini intraoperatorie (a) campo operativo durante la preparazione destinatario (b) trapianto di cuore dopo l'approvvigionamento (c) L'innesto cuore collocato nella regione del collo destinatario in posizione capovolta (d + e) Il sito donatore prima.... per l'impianto. (f) Schema malatoustrating nave ricevente, nave cedente e il bracciale
Figura 2: la sopravvivenza allotrapianto cardiaco. Kaplan-Meier che visualizza la sopravvivenza di allograft cardiaco da topi BALB / c dopo l'innesto in destinatari BL6 completamente MHC- non corrispondenti (n = 7; tempo medio di sopravvivenza = 7 giorni) e un gruppo di controllo singenico (n = 7; sopravvivenza del trapianto > 150 giorni). Il giorno del rifiuto è stata definita come il giorno in cui cessa battito cardiaco.
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Discussion
Rifiuto di trapianti vascolarizzati comporta una pletora di diverse fasi che possono essere non sufficientemente valutati solo con modelli in vitro. Fenomeni come la sensibilizzazione dei destinatari, trasformazione antigeni negli organi linfoidi secondari, ma anche la differenziazione e la proliferazione delle cellule immuno-competenti sono meglio caratterizzati in vivo. I modelli animali sono quindi lo strumento ideale per la ricerca traslazionale 16. Modelli murini rappresentano ancora il gold standard nel trapianto di base e la ricerca immunologica dato una vasta gamma di transgenici e gene knockout mice sono disponibili, e un gran numero di strumenti immunologici e diagnostici sono stati sviluppati in esclusiva per i topi 18. Il modello murino di trapianto di cuore cervicale offre uno strumento unico per rispondere alle domande ed effettuare studi meccanicistici relativi al danno da ischemia riperfusione, immunosoppressione, rigetto acuto e cronico e induzione della tolleranza 1-3, 17, 22.
Il mouse addominale modello trapianto cardiaco utilizzando una tecnica di sutura è stato descritto da Corry et al. Nel 1973 19. Problemi tecnici connessi con l'anastomosi suture- dei piccoli vasi, tuttavia, limitato l'uso diffuso.
Nel 1991, Matsuura et al. Ha introdotto il modello di trapianto di cuore cervicale utilizzando una tecnica bracciale non sutura nei topi 16. Fin dalla sua introduzione da Zimmerman et al., E Kamada e Calne "la tecnica bracciale" è stato utilizzato per anastomosi microvascolari in diversi diversi modelli murini di trapianto di organi 20-22.
Abbiamo sviluppato un non-tecnica di sutura della cuffia modificato per rivascolarizzazione e abbiamo completato oltre 1.000 trapianti di successo negli ultimi anni, con tassi di successo> 95%. Sono stati utilizzati Diverse combinazioni di deformazione differenti e regimi di trattamento. Applicando la tecnica descritta hari, il tempo totale di funzionamento può essere ridotto a circa 45 min. È importante sottolineare che il tempo totale di ischemia può essere mantenuta a 20 minuti con un tempo impiantazione inferiore a 7 min, che in contrasto è generalmente superiore a 15 minuti quando si utilizza la tecnica di sutura 23. Rispetto al modello del mouse trapianto di cuore addominale, trapianto di cuore cervicale ha diversi vantaggi, quali minore lo stress post-operatorio e l'alta percentuale di successo chirurgico. Il battito del trapianto di cuore può essere controllata facilmente a causa della posizione superficiale. Le complicanze associate con sutura anastomosi, inclusi sanguinamento e trombosi sono significativamente meno comune quando si utilizza la tecnica del bracciale 18.
Le seguenti modifiche di questa tecnica proposta dal nostro gruppo ha portato ad un tasso di successo migliore e ad una drastica riduzione del tempo di funzionamento:
- Utilizzare una perfusione retrograda attraverso l'arco aortico con 3 ml di soluzione HTK.
- Tenere il cuore umido con HTK solution durante l'intera procedura di raccolta.
- Non sezionare e legare selettivo della vena cava superiore sinistra.
- Utilizzare i micro pinze per occludere i vasi, ma, soprattutto, anche per fissare le manette.
- Utilizzare dilatatori vascolari con punte superfine per distendere l'arteria carotide comune, che rende molto più facile per Evert nave sopra il polsino.
- Non posizionare in possesso di suture come originale descritti da Matsuura et al.
- Per l'anastomosi arteriosa utilizzare un bracciale con diametro interno di 0,5 mm e un diametro esterno di 0,63 mm, per l'anastomosi venosa un bracciale con diametro interno di 0,75 mm e un diametro esterno pari a 0,94 mm.
- Utilizzare polsini con una lunghezza di 2 mm inclusa una maniglia 1 mm, che serve a sua fissazione adeguata alla nave, utilizzando un morsetto vascolare.
Una limitazione che questo metodo può avere è che può essere difficile ottenere polsini appropriate. Abbiamo quindi usato commercialmente disponibile ppolsini olyethylene da RIVERTECH medico (Chattanooga, TN).
Principali problemi di ripresa durante la procedura sono stati i seguenti.
Sangue disturbo del flusso: il cuore del donatore filo fino a quando il colore diventa di colore bianco. Flush senza troppa pressione danneggia pressione eccessiva l'innesto.
- Difficoltà di Evert nave sopra il polsino: accertare che la nave sia (a) di lunghezza sufficiente, (b) privo di grassi allegata e tessuti connettivi e (c) assicurarsi che la nave era ben disteso, usando dilatatori vascolari.
- Sanguinamento nel sito anastomotico: usare Q-tips per applicare pressione a sito interessato per circa 5 min.
- Ostruzione del flusso di sangue venoso: principalmente causata dalla torsione della vena giugulare durante i processi di posizionamento del bracciale. Rimuovere la maniglia bracciale al sito venoso.
- Graft torsione e strangolamento: Assicurarsi che l'innesto è posizionato correttamente nel lato donatore prima della chiusura della pelle.
in vivo correlate a trapianto di immunologia. Il nostro approccio modificato permette di ottenere alte percentuali di successo con le abilità di microchirurgia di base che permetteranno un'ampia applicazione di questo modello. Questo video ha lo scopo di aiutare e guidare altre ricerche per stabilire il modello nei loro laboratori.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
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