Summary
Мышиный шейки модель трансплантация сердца хорошо подходит для иммунологических, а также исследований ишемии реперфузии. Мы изменили процедуру, используя технику манжеты без шва и проведено более 1000 успешных трансплантаций с этим подходом.
При этом, мы предоставляем дополнительные детали этой техники, чтобы дополнить видео.
Abstract
Мышиные модели представляют особый интерес в области исследований, так как широкое разнообразие моноклональных антител и коммерчески определяется инбредных и штаммы нокаут доступны для выполнения механистический в естественных условиях исследования. В то время как модели пересадку сердца, используя технику наложения шва были впервые успешно развивается на крысах, перевод в равной степени распространенной используемой мыши эквиваленте не было достигнуто благодаря технической сложности микрохирургического процедуры. В отличие от этого, методы не-шовный материал манжеты, также разработаны изначально у крыс, были успешно адаптированы для использования в мышах 1-3. Эта техника для реваскуляризации включает в себя два основных шагов I) выворачивание судно получатель над полиэтиленовой манжеты; II), потянув за донорской судно над ранее вывернутой сосуда-реципиента и удерживая его на месте с окружной галстук. Это обеспечивает непрерывность эндотелия слоя, недолгое время работы и очень высоким уровнем проходимости 4.
т "> Используя эту технику для сосудов анастомоза мы провели более 1000 шейки трансплантацию сердца с общей вероятностью успеха 95%. Для артериальной приток общей сонной артерии и ближний дуга аорты были анастомозировали в результате ретроградной перфузии пересаженного сердца. Для венозного дренажа легочной артерии трансплантата был анастомозировали с наружной яремной вены реципиента 5.При этом, мы предоставляем дополнительные детали этой техники, чтобы дополнить видео.
Introduction
Сердечная трансплантация представляет собой терапию выбора для пациентов, страдающих от различных заболеваний сердца в терминальной стадии. Достижения в хирургических методов, более эффективного профилактики инфекций, и новых иммуносупрессивных режимов привело к заметно улучшенную исход трансплантации органов 6. Тем не менее, долгосрочная выживаемость трансплантата не улучшилась строго в последние годы 7. Хроническое отторжение, характеризуется трансплантации атеросклероза продолжает быть основным препятствием для долгосрочного трансплантата выживания 8-11.
Модель гетеротопической трансплантации сердца у мышей обеспечивает важную и действующий инструмент для анализа иммунологическим механизмом, при остром, так и хроническое отторжение 12-15.
На сегодняшний день наиболее часто встречающаяся модель трансплантации еще в животе трансплантации мыши сердце с помощью техники наложения шва. Восходящей аорты донора сердца анастомозировали к аbdominal аорта и легочная артерия является анастомозируется с нижней полой вены реципиента. Большая часть микрохирургической сложности модели швов на основе небольшого размера сосудов, которые сшивают 16,17.
В отличие от модели шовного сердце помещают в области шеи реципиента, где внешний яремную вену анастомозировали в легочной артерии и общей сонной артерии аорты донора.
Обоснование развития шейного модели трансплантации сердца, используя технику манжеты был иметь животную модель, которая позволяет достичь высоких показателей успеха с основными микрохирургических навыков, которые позволят широкому применению этой модели. Основными преимуществами этого метода являются значительно менее происходит анастомоза осложнений, связанных как кровоизлияний и тромбоза по сравнению с шовного модели 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные размещены в свободном объекта барьера патогена. Все животные получают человеческую заботу в соответствии с «принципами лабораторных животных", сформулированных Руководство по уходу и использованию лабораторных животных ", подготовленный Национальной академии наук Национального общества медицинских исследований" в и "и опубликованным Национальным Институтов Здоровья (NIH публикации нет. 86-23, пересмотрен 1985). Все эксперименты утверждаются австрийского министерства образования, науки и культуры.
1 Получатель Подготовка
- Обезболить животного-реципиента с внутримышечной инъекции ксилазина (5 мг / кг массы тела) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
- Удалите все волосы боковой области шеи животного и кустарников операционного поля три раза, используя chlorhexdine.
- Наведите в положении лежа на спине на операционном поле.
- Далее сделать разрез кожи от яремной Inc-концепции в нужное нижней челюсти.
- Впоследствии, прямо мобилизовать правильный внешний яремную вену (EJV) и разделить ветви между лигатур.
- Затем разделите EJV между лигатур убедившись, чтобы оставить достаточную длину, чтобы выворачивания ближний пень над манжеты тела.
- Следующая удалить правую долю подчелюстной слюнной железы.
- Для венозной анастомоза пройти проксимальный конец EJV через полиэтиленовую манжету и закрепить его на ручке манжеты с микро зажима.
- Удалить лигатуру в конце сосуда, выворачивания просвет над манжетой и закрепить его с 8-0 шелковой петли (фиг.1а).
- Впоследствии секут правильный кивательной мышцы с биполярным прижиганием, чтобы получить доступ к общей сонной артерии.
- Следующая мобилизовать общую сонную артерию и снизить судно между лигатур.
- Следующая мобилизовать общую сонную артерию и снизить судно между лигатур.
- Проходят дисТаль конец сосуда через манжеты и зафиксировать его с помощью зажима артерии.
- Удалить лигатуру в конце сосуда и разбухают просвет с помощью сосудистых dilatators. Далее, по аналогии с EJV, выворачивания артерии над манжеты и зафиксировать его с 8-0 шелковой петли.
2 Сердце закупок
- Обезболить мыши-донора с внутримышечной инъекции ксилазина (5 мг / кг массы тела) и кетамина (100 мг / кг массы тела). Затем удалить все волосы в области живота животного. Скраб оперативное поле три раза с помощью chlorhexdine. Следующая место мышь в положении лежа на спине на операционном поле, как описано выше.
- После средней линии живота разрез, убрать внутренности с ватных палочек слева, чтобы разоблачить нижней полой вены (НПВ).
- Введите 400 мкл 1: 4 heparin- натриевых раствора в НПВ для гепаринизации.
- Выполните торакотомия и сложить переднюю грудную стенку над краниально получить соотвESS к сердцу.
- Затем удалите тимус и сделать вентиляции надрезов на левой и правой верхней полой вены.
- Впоследствии, заливать сердце ретроградным способом с 4 ° по Цельсию раствора HTK катетеризации аорты с 27 г шприц на уровне брахиоцефального ветви.
- Лигировать слабую, и верхней полой вены с 8-0 шелка и разделить их дистальнее лигатуры.
- Следующая разделить дуги аорты на уровне предыдущего катетеризации и анализировать бесплатно легочного ствола и разделить его, насколько дистально, насколько это возможно.
- После этого, связать легочные вены с объемной перевязки и разделить их дистальнее лигатуры.
- Наконец, удалить сердце из донорской и сохранить его в 4 ° решения по Цельсию HTK (Рисунок 1b).
3 Имплантация
- Поместите сердца трансплантата в области шеи получатель в перевернутом положении (Рисунок 1в
- Далее тянуть легочный ствол сердца над вены манжеты конструкции получателя и исправить ее с шелковой петли (рисунок 1d).
- Выполните анастомоз между аортой трансплантата и вывернутой артерии животного-реципиента таким же образом (Рисунок 1е).
- Затем снимите с венозной зажим первого, а затем артериальной зажима. Сердце реперфузии и начинает бить в течение 1-2 мин. Во время реперфузии увлажнить сердце теплой (35 ° по Цельсию) физиологического раствора.
- Наконец закрыть операционную рану 6-0 непрерывных швов (Рисунок 1E).
4 Послеоперационный период, Endpoint
- Дайте до 0,3 мл нормального физиологического раствора после операции по замене жидкости.
- Поместите животное под инфракрасной лампой до пробуждения от анестезии.
- После того, как проснулся, вернуть животное к субсидированного жилья, где они получают пищу и воду без ограничений.
- М.И.nimize боль в течение первых 7 дней после операции администрирования карпрофена (4 мг / кг каждые 12 ч подкожно (SC). Кроме того, дать Buprenorphin (0,1 мг / кг) сразу после операции через каждые 12 ч в течение 5 дней.
- Получите Вес (г) каждого получателя животных еженедельника на предмет правильного питания потребления. Если есть доказательства более 10-15% потери веса по сравнению с весом в хирургии Дата, апатия, парализует или очень изогнутой спине, пожертвовать животное с помощью терминала ИФ ингаляции до достижения клинического конечную точку. Также пожертвовать животное после сердце отклонено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показаны репрезентативные данные выживаемости сердечных аллотрансплантатов от BALB / с донорами после трансплантации в полной мере МНС несогласованных C57BL / 6 получателей. Сердца отклоняются на 7 ± 1 день после трансплантации. Finger пальпация пересаженной аллотрансплантата является чувствительным методом для обнаружения зависит от времени курс отторжения трансплантата. Все сингенные по пересадке сердца, выполненные в нашей серии выжил на неопределенный срок (> 150 дней).
Рисунок 1: Интраоперационные фотографии (а) операционного поля во время подготовки получателя (б) Сердце трансплантата после закупки (в) Сердце трансплантат помещается в области шеи-получателя в перевернутом положении (D + E) Жертвователь до.... имплантацией. (е) схема плохоustrating судно получателя, донорской судно и манжету
На рисунке 2: выживание аллотрансплантата сердца. Каплана-Мейера участка отображения выживание аллотрансплантата сердечной от линии BALB / C мышей после прививки в полностью MHC-получателей несогласованных BL6 (N = 7; среднее время жизни = 7 дней), а также сингенных контрольной группы (n = 7; выживаемость трансплантата > 150 дней). День отказа была определена как день прекращения сердцебиения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Отказ от васкуляризированных аллотрансплантатов влечет за собой множество различных шагов, которые могут быть недостаточно начисленных только с помощью в моделях пробирке. Явления, как сенсибилизации получателей, обработки антигена в вторичных лимфоидных органах, но также и дифференциацию и пролиферацию иммунокомпетентных клеток лучше охарактеризовать в естественных условиях. Животные модели, таким образом, идеальным инструментом для трансляционных исследований 16. Мышиные модели все еще представляют собой золотой стандарт в основной трансплантации и иммунологической исследований с широким спектром трансгенных и ген мышей с доступны, и большое количество иммунологических и диагностических инструментов были разработаны исключительно для мышей 18. Мышиный шейки модель трансплантация сердца является уникальным инструментом для решения вопросов и выполнения механистические исследования, связанные с ишемией реперфузии, иммуносупрессии, острого и хронического отторжения и индукции толерантности 1-3, 17, 22.
Мышь в животе трансплантация сердца модель используя технику наложения шва была впервые описана Корри соавт. В 1973 году 19. Технические проблемы, связанные с suture- анастомоза мелких сосудов, однако, ограничивает его широкое применение.
В 1991 году, Мацуура и др. Представила шейки модель по пересадке сердца, используя технику манжеты без шва у мышей 16. С момента своего появления на Циммерман и др., И Камада и Калне "технике манжеты" был использован для микрососудистых анастомозов в нескольких различных мышиных моделях трансплантации органов 20-22.
Мы разработали модифицированную технику манжеты без шва для реваскуляризации и выполнили более 1000 успешных трансплантаций в последние несколько лет, с успехом ставок> 95%. Были использованы несколько различных комбинаций деформации и схемы лечения. Применяя технику описано онповторно, общее время работы может быть снижена до примерно 45 мин. Важно общее время ишемии могут быть сохранены на 20 мин при времени имплантации менее 7 мин, что, в отличие от обычно более 15 мин при использовании методики наложения шва 23. По сравнению с мыши модели в животе по пересадке сердца, рак шейки пересадка сердца имеет ряд преимуществ, таких как незначительные послеоперационном стресса и высокий показатель успеха хирургической. Биение сердца трансплантата можно легко контролировать благодаря поверхностному положении. Осложнения, связанные с шовного анастомоза, включая кровотечения и тромбоза значительно реже при использовании метода манжеты 18.
Выпускаются следующие модификации этой техники, предложенной наша группа, позволили улучшить показатель успешности и к резкому сокращению времени работы:
- Используйте ретроградную перфузию через дуги аорты с 3 мл раствора HTK.
- Держите сердце влажная помощью HTK зольution во время всей процедуры уборки.
- Не препарировать и селективный перевязывать левую верхней полой вены.
- Используйте микро зажимы для закупоривания сосудов, но, главное, также исправить наручники.
- Используйте сосудистых dilatators с советами супертонких разбухают общей сонной артерии, что делает его гораздо легче выворачивания судно на манжете.
- Не ставьте проведения швов как оригинальный описанные Мацуура и соавт.
- Для артериального анастомоза использовать манжету с внутренним диаметром 0,5 мм и внешним диаметром 0,63 мм, для венозной анастомоза манжету с внутренним диаметром 0,75 мм и внешним диаметром 0,94 мм.
- С помощью манжеты с длиной 2 мм, включая 1 мм ручкой, которая служит для его правильной фиксации в сосуд, с помощью сосудистого зажима.
Одно ограничение, что этот метод может быть в том, что это может быть трудно получить соответствующие манжеты. Поэтому мы использовали имеющийся в продаже рolyethylene манжеты от Rivertech медицинской (Чаттануга).
Главные съемки беда во время процедуры были следующими.
Расстройство кровотока: Флеш донорское сердце до цвета становится белого цвета. Флеш без слишком большого давления в чрезмерных повреждений давления трансплантата.
- Сложность в выворачивания судно на манжете: Определить, что судно (а) достаточной длины, (б) бесплатно прилегающего жира и соединительной ткани и (в) убедиться, что судно было хорошо растянут, используя сосудистые dilatators.
- Кровотечение в анастомоза: использовать ватные палочки, чтобы оказать давление на пораженный участок примерно 5 мин.
- Венозная обструкция кровотока: В основном вызвано кручения яремной вены во время процессов манжеты размещения. Снимите ручку манжеты на венозной сайте.
- Привитые крутящий и удушение: Убедитесь, что трансплантат должным образом размещены в стороны доноров до закрытия кожи.
в естественных условиях исследования, связанные с трансплантации иммунологии. Наш измененный подход позволяет добиться высоких темпов успеха с основными микрохирургических навыков, которые позволят широкому применению этой модели. Это видео призвано помочь и направлять других исследований по созданию модели в своих лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
- Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81, 583-589 (2006).
- Schneeberger, S., et al. The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant. 8, 773-782 (2008).
- Sucher, R., et al. IDO and regulatory T cell support are critical for cytotoxic T lymphocyte-associated Ag-4 Ig-mediated long-term solid organ allograft survival. JImmunol. 188, 37-46 (2012).
- Yamashita, K., et al. Heme oxygenase-1 is essential for and promotes tolerance to transplanted organs. FASEB J. 20, 776-778 (2006).
- Kienzl, K., et al. Proteomic profiling of acute cardiac allograft rejection. Transplantation. 88, 553-560 (2009).
- Aurora, P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: tenth official pediatric lung and heart/lung transplantation report--2007. J Heart Lung Transplant. 26, 1223-1228 (2007).
- Häyry, P. Chronic allograft vasculopathy new strategies for drug development. Transplant Proc. 30, 3989-3990 (1998).
- Hosenpud, J. D. Immune mechanisms of cardiac allograft vasculopathy an update. Transpl Immunol. 1, 237-249 (1993).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Kouwenhoven, E. A., de Bruin, R. W., Heemann, U. W., Marquet, R. L., Ijzermans, J. N. Late graft dysfunction after prolonged cold ischemia of the donor kidney inhibition by cyclosporine. Transplantation. 68, 1004-1010 (1999).
- Kouwenhoven, E. A., Ijzermans, J. N., de Bruin, R. W. Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction. Transpl Int. 13, 385-401 (2000).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Huang, X., Chen, D., Chen, L. [A modified model of cervical heterotopic cardiac transplantation for chronic rejection research]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, 1508-1510 (2008).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2, 471-480 (2007).
- Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105, 1609-1614 (2002).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64, 1598-1601 (1997).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplant Proc. 11, 571-577 (1979).
- Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10, 2231-2240 (2010).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Actapathologica et microbiologica Scandinavica Section A, Pathology. 79, 366-372 (1971).
