Murina Cervical Heart Transplantation Modell hjälp av en modifierad Cuff Technique

Summary

Den murina livmoderhalscancer hjärttransplantation modell passar bra för immunologiska samt ischemi reperfusion studier skada. Vi ändrade proceduren med en icke-sutur manschetten teknik och utfört mer än 1000 framgångsrika transplantationer med detta synsätt.

Häri ger vi ytterligare information om denna teknik för att komplettera videon.

Abstract

Mus modeller är av särskilt intresse för forskning, eftersom en mängd olika monoklonala antikroppar och kommersiellt definierade inavlade och knockout stammar är tillgänglig för att utföra mekanistiska studier in vivo. Medan hjärttransplantations modeller med hjälp av en sutur tekniken först framgångsrikt utvecklat hos råttor, var översättning till ett lika utbrett använt murina motsvarighet aldrig uppnås på grund av tekniska komplexiteten i mikrokirurgisk procedur. Däremot var inte sutur manschetten tekniker, även utvecklats till en början hos råttor, med framgång anpassat för användning i möss ^1-3. Denna teknik för revaskularisering innebär två stora steg I) everting det mottagande fartyget under en polyeten manschetten; II) drar det fartyg som bidrar över tidigare vrängs mottagande fartyget och hålla den på plats med en omkrets slips. Detta säkerställer en kontinuitet endotelskiktet, kort driftstid och mycket höga öppna kärl ^4.

t "> Med hjälp av denna teknik för vaskulär anastomos vi utfört mer än 1.000 livmoderhalscancer hjärttransplantationer med en total framgång på 95%. För arteriell inflöde den gemensamma halspulsådern och den proximala aortabågen anastomoserades resulterar i en retrograd perfusion av det transplanterade hjärtat. För venös dränering lungartären av transplantatet var anastomoseras med den yttre halsvenen av mottagaren ^5.

Häri ger vi ytterligare information om denna teknik för att komplettera videon.

Introduction

Hjärttransplantation representerar terapi av val för patienter som lider av olika slutstegs hjärtsjukdomar. Framsteg inom kirurgisk teknik, effektivare profylax av infektioner, och nya immunsuppressiv behandling resulterade i markant förbättrad resultatet av organtransplantation ^6. Emellertid har långsiktiga graft överlevnad inte förbättrats rigoröst under de senaste åren ^7. Kronisk avstötning, som kännetecknas av transplantations åderförkalkning fortsätter att vara ett stort hinder för långsiktig graft överlevnad ^8-11.

Modellen för heterotop hjärttransplantation i möss ger ett viktigt och relevant verktyg för analys av immunologisk mekanism under akut och kronisk avstötning ^12-15.

Hittills den vanligaste transplantationen modellen är fortfarande buken musen hjärttransplantation med hjälp av sutur tekniken. Den stigande aorta av donatorns hjärta anastomoseras till ettbdominal aorta och lungartären är anastomoseras till mottagarens sämre hålvenen. En stor del av mikro svårigheten att suturen modellen bygger på den lilla storleken av fartygen, som suture ^16,17.

I motsats till den sutur modell hjärtat placeras i halsområdet hos mottagaren där den externa jugularvenen anastomoserades till lungartären och den gemensamma halsartären aortan hos givaren.

Den logiska grunden för utvecklingen av halshjärttransplantation modell med manschetten teknik var att ha en djurmodell, som gör det möjligt att uppnå höga andelen framgångsrika med grundläggande mikrokirurgisk kompetens som gör att bred tillämpning av denna modell. De stora fördelarna med denna metod är betydligt mindre förekommande anastomos relaterade komplikationer såsom blödningar och trombos jämfört med sutur modell ^18.

Protocol

Djur är inrymda i en barriär patogenfri anläggning. Alla djur får mänskliga vård i överensstämmelse med "Principals of Laboratory Animal Care" utarbetas av Nationalföreningen för medicinsk forskning "och" Guide för skötsel och användning av försöksdjur "som utarbetats av National Academy of Sciences och offentliggjorts av National Institutes of Health (NIH publikation nr. 86-23, reviderad 1985). Alla experiment är godkända av det österrikiska ministeriet för utbildning, vetenskap och kultur.

1. Mottagarens Framställning

1. Bedöva mottagaren djur med en im injektion av xylazin (5 mg / kg kroppsvikt) och ketamin (100 mg / kg kroppsvikt).
2. Ta bort allt hår i den laterala halsregionen av djuret och skrubba den operativa området tre gånger med chlorhexdine.
3. Placera musen i ryggläge på operationsområdet.
4. Nästa göra en hud snitt från hals incision till höger nedre käken.
5. Därefter rent ut mobilisera rätt yttre halsvenen (EJV) och delar upp grenarna mellan ligaturer.
6. Sedan dela den EJV mellan ligaturer och se till att lämna tillräckligt med längd för att vränga den proximala stump över manschetten kroppen.
7. Nästa bort den högra loben av submandibular körteln.
8. För det venösa anastomos passera proximala ände EJV genom polyeten manschetten och fixa det i handtaget på manschetten med en mikro klämma.
9. Ta bort ligaturen i slutet av kärlet, vränga lumen över manschetten och fäst den med en 8-0 silkesslinga (Figur 1a).
10. Därefter transekt rätt sternocleidomastoideus med bipolär diatermi för att få tillgång till den gemensamma halspulsådern.
11. Nästa mobilisera gemensamma halspulsådern och skär fartyget mellan ligaturer.
12. Nästa mobilisera gemensamma halspulsådern och skär fartyget mellan ligaturer.
13. Passera distal änden av kärlet genom manschetten och fixa det med artärklämman.
14. Ta bort ligaturen i slutet av kärlet och distend lumen med hjälp av kärl dilatators. Nästa, i analogi med EJV, vränga artären under manschetten och fäst den med en 8-0 silkesslinga.

2. Hjärta Anskaffning

1. Bedöva donator mus med en im injektion av xylazin (5 mg / kg kroppsvikt) och ketamin (100 mg / kg kroppsvikt). Ta sedan bort allt hår i bukhålan av djuret. Skrubba operationsområdet tre tiden med chlorhexdine. Nästa ställe musen i ryggläge på operationsområdet som tidigare beskrivits.
2. Efter en mittlinje buksnitt, dra inälvorna med Q-tips till vänster för att exponera den nedre hålvenen (IVC).
3. Injicera 400 pl av en 1: 4 heparinnatriumlösning in i IVC för heparinisering.
4. Utför en torakotomi och vik den främre bröstväggen över cranially att vinna accESS till hjärtat.
5. Ta sedan bort tymus och göra ventilations snitt i vänster och höger övre hålvenen.
6. Därefter BEGJUTA hjärtat på ett tillbakagående sätt med 4 ° Celsius HTK lösning genom kanylering av aortabågen med en 27 G spruta vid nivån för den brachiocephalic gren.
7. Ligate sämre och övre hålvenen med 8-0 silke och dela dem distalt till ligaturerna.
8. Nästa dela aortabågen på nivån för den tidigare kanyle och dissekera fri lung bålen och dividera det så långt distalt som möjligt.
9. Efter detta, slips lungvenerna med en bulk ligation och dela dem distalt till ligaturerna.
10. Slutligen, ta bort hjärtat från givarstället och förvara den i 4 ° Celsius HTK-lösning (Figur 1b).

3. Implantation

1. Placera hjärtat transplantat i mottagarens halsregionen i ett läge upp och ned (Figur 1c
2. Nästa dra pulmonell stammen av hjärtat över venen manschetten konstruktionen hos mottagaren och fäst den med en silkesslinga (figur 1d).
3. Utför anastomos mellan aortan av transplantatet och det vrängda artär hos mottagaren djur på samma sätt (Figur 1e).
4. Därefter tar du bort venösa klämman först, följt av den arteriella klämman. Hjärtat reperfusion och börjar slå i 1-2 min. Under reperfusion fukta hjärta med varmt (35 ° C) koksaltlösning.
5. Slutligen stänga operationssåret med 6-0 kontinuerliga suturer (Figur 1e).

4 Postoperativ vård, Endpoint

1. Ge upp till 0,3 ml normal saltlösning ip postoperativt för vätskeersättning.
2. Placera djuret under en värmelampa tills vaknat från narkosen.
3. När vaken, tillbaka djuret till huset anläggning där de får mat och vatten efter behag.
4. Minimize smärta under de första 7 postoperativa dagarna administrera karprofen (4 mg / kg var 12 h subkutant (sc). Dessutom ger buprenorfin (0,1 mg / kg) direkt efter operation för varje 12 timmar i 5 dagar.
5. Erhåll den vikt (g) av varje mottagardjur veckovis för att bedöma för korrekt näringsintag. Om det finns tecken på mer än 10-15% viktminskning jämfört med tyngd vid kirurgi-datum, apati, förlamande eller en mycket böjd rygg, offra djuret med hjälp av terminalen isofluran inandning innan den kliniska slutpunkten. Också offra djuret efter det att hjärtat har förkastats.

Representative Results

Figur 2 visar representativa överlevnadsdata för hjärt allograft från BALB / c-donatorer efter transplantation till fullo MHC inkompatibla C57BL / 6 mottagare. Hjärtan avvisas dag 7 ± 1 efter transplantation. Finger palpation av transplanterade allograft är en känslig metod för att detektera beroende naturligtvis av transplantatavstötning tid. Alla syngena hjärttransplantationer utförs i vår serie levde på obestämd tid (> 150 dagar).

Figur 1: Intraoperativa bilder (a) Operativ fältet under mottagande beredning (b) Hjärt transplantat efter upphandling (c) Hjärtat transplantat placeras i den mottagande halsregionen i ett läge upp och ned (d + e) Donator platsen före.... implantationen. (f) Skiss sjukustrating det mottagande fartyget, det givande fartyget och manschetten

Figur 2: Hjärt allograftöverlevnad. Kaplan-Meier-kurva visar överlevnaden av hjärtallotransplantat från BALB / c-möss efter ympning in helt MHC felmatchade BL6 mottagare (n = 7; genomsnittlig överlevnadstid = 7 dagar) samt en syngen kontrollgrupp (n = 7; transplantatöverlevnad > 150 dagar). Dagen för avstötning definierades som dagen av upphörandet av hjärtslag.

Discussion

Avslag på vaskulariserade allotransplantat innebär en uppsjö av olika åtgärder som endast kan otillräckligt utvärderas med hjälp av in vitro-modeller. Fenomen som sensibilisering av mottagarna, antigen bearbetning i sekundära lymfoida organ utan även differentiering och proliferation av immunkompetenta celler är bättre karakteriserade in vivo. Djurmodeller är därmed det perfekta verktyget för translationell forskning ^16. Musmodeller utgör fortfarande den högsta standarden inom grund transplantation och immunologisk forskning, eftersom ett stort antal transgena och gen knockoutmöss finns tillgängliga, och ett stort antal av immunologiska och diagnostiska verktyg har utvecklats exklusivt för möss ^18. Den murina livmoderhalscancer hjärttransplantation modell erbjuder ett unikt verktyg för att hantera frågor och utföra mekanistiska studier relaterade till ischemireperfusionsskada, immunosuppression, akut och kronisk avstötning och tolerans induktion ^{1-3, 17, 22.}

Musen buken hjärttransplantation modell med en sutur teknik beskrevs först av Corry et al. 1973 ^19. Tekniska utmaningar i samband med den suture- anastomos av små fartyg, dock begränsat dess utbredda användning.

År 1991 Matsuura et al. Presenterade halshjärttransplantation modell med en icke-sutur manschetten teknik i möss ^16. Sedan introduktionen av Zimmerman et al., Och Kamada och Calne "manschetten tekniken" har använts för mikrovaskulära anastomoser i flera olika musmodeller av organtransplantation ^20-22.

Vi har utvecklat en modifierad icke-sutur manschetten teknik för revaskularisering och har genomfört över 1.000 lyckade transplantationer i de senaste åren, med framgångsrika> 95%. Flera olika belastningskombinationer och behandlingsregimerna användes. Tillämpning av den beskrivna tekniken hanre kan den totala drifttiden reduceras till ca 45 min. Viktigt är den totala ischemitiden kan hållas vid 20 min med en implantation av mindre än 7 min, som i motsats är vanligtvis mer än 15 minuter vid användning av sutur teknik ^23. Jämfört med musen buken hjärttransplantation modell, har cervical hjärttransplantation flera fördelar, såsom mindre postoperativ stress och hög kirurgisk framgång. Den hjärtslag transplantat kan lätt övervakas på grund av den ytliga läge. Komplikationer i samband med sutur anastomos, inklusive blödning och trombos är betydligt mindre vanligt när manschetten teknik ^18.

Följande modifieringar av denna teknik föreslås av vår grupp ledde till en förbättrad framgång och till en dramatisk minskning av drifttid:

• Använd en retrograd perfusion genom aortabågen med 3 ml HTK-lösning.
• Håll hjärtat fuktigt använder HTK solmepannor under hela skördeförfarandet.
• Inte dissekera och selektiv ligat den vänstra övre hålvenen.
• Använd mikro klämmor för att täppa fartygen, men, viktigare, att fixa ärmslut.
• Använd vaskulära dilatators med superfina tips för att tänja den gemensamma halsartären, vilket gör det mycket lättare att vränga kärlet under manschetten.
• Placera inte hålla suturer som originalet beskrivs av Matsuura et al.
• För arteriell anastomos använda en manschett med en inre diameter av 0,5 mm och en ytterdiameter av 0,63 mm, för venös anastomos en manschett med en innerdiameter av 0,75 mm och en ytterdiameter av 0,94 mm.
• Använd muddar med en längd av 2 mm, inklusive en 1 mm handtag som tjänar till sin rätta fixering till fartyget, med hjälp av en kärlklämma.

En begränsning att denna metod kan ha är att det kan vara svårt att få lämpliga manschetter. Vi använde därför kommersiellt tillgängliga polyethylene muddar från Rivertech medicinska (Chattanooga, TN).

Huvud felsökning under förfarandet var följande.

Blodflödet disorder: Spola hjärta donator tills färgen blir vit i färgen. Flush utan för mycket tryck som överdrivna tryckskador transplantatet.

• Svårt att vränga fartyget under manschetten: försäkra sig om att fartyget är (a) med tillräcklig längd, (b) fri från vidhängande fett och bindväv och (c) se till att fartyget var väl utspänd, med hjälp av kärl dilatators.
• Blödning vid anastomotic sajt: använd Q-tips för att utöva påtryckningar på drabbade plats för ca 5 min.
• Venösa blodflödet obstruktion: Främst orsakas av vridning av halsvenen vid processerna för placering av manschetten. Ta bort manschetten handtaget vid venösa platsen.
• Graft vridning och strypning: Se till att transplantatet placeras korrekt i givarsidan innan huden stängning.

in vivo-studier relaterade till transplantationsimmunologi. Vår modifierade tillvägagångssätt gör att uppnå höga andelen framgångsrika med grundläggande mikrokirurgisk kompetens som gör att bred tillämpning av denna modell. Denna video är att hjälpa och vägleda andra undersökningar för att fastställa modellen i sina laboratorier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro vessel clip	S & T	B1 00396 V
Microscissor	FST	14075-11
Vesseldilatator	S & T	D-5a.2 00125
Microforceps	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Microvessel clip	S & T	B1 00396 V