Summary
Pattedyr integument inneholder løsemiddel-uttrekkbar lipider som kan gi kjemisk komposisjoner karakteristisk for enkelte arter. Dette papir presenterer en rutinemetode for separering av brede lipidklasser isolert fra integumentary vev ved hjelp av tynnsjiktskromatografi og bestemmelse av triacylglyceride profil ved matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri.
Abstract
Den pattedyr integument omfatter talgkjertlene som skiller ut et oljeaktig materiale på overflaten av huden. Sebum produksjon er en del av det medfødte immunsystemet som er beskyttende mot sykdomsfremkallende mikrober. Unormal sebum produksjon og kjemisk sammensetning er også et klinisk symptom på spesifikke hudsykdommer. Sebum inneholder en kompleks blanding av lipider, inkludert triacylglycerides, som er artsspesifikke. Den brede kjemiske egenskaper utstilt ved ulike lipidklassene hindre den spesifikke bestemmelse av sebum sammensetning. Analytiske teknikker for lipider vanligvis krever kjemiske derivatizations som er arbeidskrevende og øke prøveopparbeidelse kostnader. Dette dokumentet beskriver hvordan å ekstrahere lipider fra pattedyr integument, separate brede lipidklasser ved tynnskiktkromatografi, og profilen til de triacylglyceride innholdet ved hjelp av matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri. Denne robuste metoden muliggjør en direkte bestemmelseav triacylglyceride profiler blant arter og mennesker, og det kan lett anvendes på en hvilken som helst taksonomisk gruppe av pattedyr.
Introduction
Pattedyr integumentary vev inkluderer epidermis, keratinous strukturer (f.eks hår og negler), og eksokrine kjertler. Talg-type eksokrine kjertler er forbundet med hårsekker, som er kollektivt referert til som pilosebaceous enhet 1. Talgkjertlene frigi en oljeaktig eksudat på hudoverflaten referert til som talg. Sebum er stort sett består av glycerolipids (f.eks triacylglycerides [-tags]), gratis fatty acyls (FFA), sterol / voks estere, og squalene. Sebum kjemiske sammensetning er artsspesifikk to. I tillegg til å være en del av det medfødte immunsystemet og gi antimikrobielle funksjon 3, talg lipider påvirker viktige fysiologiske prosesser, inkludert fordamping vanntap gjennom huden 4, cellular integritet og genregule 5, og absorpsjonen seks. Talg lipid komposisjoner kan også tjene som sykdomsmarkører. Endrede forhold og mengder av talg broad lipidklassene er kliniske tegn til sykdommer som akne vulgaris 7, flass 8, seboreisk eksem 8, asteatosis 9, blant annet 10. Epidermale og hår vev inkluderer variable profiler som inneholder sterol og derivater, koder, FFA, ceramider, fosfolipider og andre mindre fettkomponenter. Fordi integumentary lipider kan fungere i sykdomsprosesser, bestemme forskjeller i kjemiske sammensetninger av koder mellom friske og syke personer kan være nyttig for klinisk diagnose av sykdommen.
Lipider er generelt definert til å være vann-uløselige organiske forbindelser med enten ikke-polar eller ikke-polar-polare substituenter 11. Lipid strukturer kan være lange karbonkjeder, oksygenerte alkaner (inkludert voksestere, FFAs, alkoholer, ketoner og aldehyder), eller komplekse ringstrukturer slik som kolesterol 12.. Det er åtte store klasser av lipider basert på struktur (FFA, glycerolipids [GL], glycerophospholipids [GP], sfingolipider [SP], sterol lipider [ST], prenol lipider [PR], saccharolipids [SL] og polyketider [PK]), som oppviser et bredt spekter av kjemiske egenskaper avhengig klasse 13. På grunn av den store variasjonen i de kjemiske egenskaper av lipidklasser, er direkte profilering uten forutgående derivatisering av lipidmolekyler ønsket. En emergent Fremgangsmåte i lipid forskning er tynnsjikt-kromatografi (TLC) kombinert med matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) 14.
MALDI-TOF MS brukes mye i proteomikk forskning for å identifisere proteiner og knytte dem til konkrete aminosyresekvenser på grunn av de svært nøyaktige peptid ion mass "fingeravtrykk" generert fra trypsinlignende fordøyd proteiner 15. MALDI-TOF MS kan også brukes til å profilere andre biomolekyl klasser, inkludert lipider som TAGs 16-18. MALDI krever bruk av en matriks, typmatisk en organisk forbindelse som inneholder aromatiske og konjugerte dobbeltobligasjonsstrukturer. De matriks-molekyler tjener til forsiktig å overføre energien fra laseren til analyttene, fremme protonoverføring, og produserer enkeltvis ladede gassfase ioner 19-21. Ioner er utsatt for en høy spenning felt under høyvakuum og akselerert i en TOF masse analysator hvor ioner blir deretter separert ved forskjeller i hastigheter som er proporsjonale med deres masse-til-charge-forhold. Selv svært store biomolekyler kan ionisert med litt fragmentering, produsere enkeltvis ladede molekylære ion arter for forenklet spektrum analyse. Evnen til å analysere lipidmolekyler direkte uten forutgående derivatisering har fremmet klar adopsjon av MALDI-TOF MS i lipidomiske forskning 18.
Dette notatet presenterer en rutinemessig metode for å isolere og analysere integumentary lipider fra håret, talg sekreter og plagiopatagium av Eastern red bat (Lasiurus borealis). Dette brukes til å bestemme interspesifikk variasjoner i bat integumentary lipider å belyse sykdomsprosessen av White-Nose Syndrome (WNS) 22. WNS er en soppsykdom av flaggermus og er forårsaket av den nylig beskrevet psychrophilic arter Geomyces destructans 23-25. WNS har forårsaket dødsfallet til over 5 millioner nordamerikanske hule flaggermus og truer utryddelse av sårbare flaggermusarter, med mulige økonomiske konsekvenser av milliarder av dollar i skader på landbruksnæringen 26,27. For å undersøke trinnene i G. destructans infeksjon, ble lipider hentet fra hår og vinge vev av Eastern røde flaggermus og delt opp i brede lipidklassene av TLC å isolere TAG brøkdel for påfølgende analyse av MALDI-TOF MS. Kodene inneholder korte acylkjedene og er lett oppdages av MALDI-TOF MS med lite matriksinterferens.
Protocol
FORSIKTIG: Skaffe på forhånd alle nødvendige statlige og føderale tillatelser for håndtering, transport og lagring av flaggermus. Godkjenninger må også innhentes fra institusjonelle dyr omsorg og bruk komité, samt fra din institusjonelle biosikkerhet komiteen. Dersom live flaggermus (eller nervesystemet vev) skal behandles, bør Dyretemmere vaksineres for rabies. Flaggermus som brukes i den aktuelle studien ble samlet inn fra Ozark St. Francis National Forest, AR, i løpet av sommeren 2010 i henhold til standard metoder (Arkansas State University Institutional biosikkerhet Committee godkjenning # 135349-1) 28.
En. Tissue Behandling og Lipid Extraction
- Rengjør alle instrumenter med metanol før og mellom vev samling fra forskjellige individer. Trim håret (ca. 1,0 g) fra huden med en saks og legg i en 125 ml erlenmeyerkolbe. Sample sebum fra vingen overflaten ved å skrubbe huden med 4-6 bomullsdotter fuktet med kloroform: Metanoloppløsningsmiddel (C: M; 03:02 v / v), og plasser disse i en separat kolbe.
- Ekstraher vevet med 10 ml C: M (2:1 v / v) inneholdende 0,5% butylert hydroksytoluen (BHT) for å hindre oksydasjon 29.. Bruk kun HPLC kvalitet løsemidler.
- Etter 2 t, tilsett 0,5 g vannfritt sulfat til hver kolbe, bland et kort øyeblikk, og samle løsningsmidlet ved filtrering gjennom filterpapir.
- Gjenta trinn 1,2 og 1,3 ganger. En gang med 1:1 C: M-og i rekkefølge med 01:02 C: M. Pool filtrerer sammen.
- Fordamp de samlede filtratene under en strøm av N2, bestemme tørrvekt, og oppløs residuet i lipid 3:2 C: M (med 0,5% BHT) til en konsentrasjon på 10 mg / ml. Lagres prøven i glassflasker ved -20 ° C. Det er vanligvis best å analysere prøvene i løpet av en måned etter prøvetaking, og for å minimalisere fryse-tine-sykluser.
2. Lipid Separering ved preparativ tynnsjiktkromatografering
- Forbered på forhånd løsemiddel vasket 1,5 ml microcentrifuge rør ved å fylle med 03:02 C: M, skylling med aceton, og lufttørking. Dette er gjort for å fjerne mykgjørere som kan forstyrre senere massespektrometri analyse. Oppbevar prøverør i et støvfritt container og håndtere disse rørene bare med hansker for å hindre forurensning fra hudfett.
- Aktiver TLC-plate ved først å pre-utvikle den med 03:02 C: M. Legg nok løsningsmiddel til TLC kammeret til en dybde på 1 cm, og deretter plassere platen i kammeret (tett med glasslokk) og tillate løsningsmidlet å løpe helt til toppen av platen. Dette tar ca 45 min.
- Ta av platen og tørt i en avtrekkshette før løsemiddel fordamper (ca 15 min), deretter i en ovn i minst 10 minutter ved 120 ° C. Plasser en blyantstrek på toppen av platen for å opprettholde orientering når prøvene er anvendt. Plasser en rett linje blyant, 1,5 cm fra den nedre kant av platen, for å markere den opprinnelige hvor prøven og standardene vil bli plassert.
- Forbered TLC kammer ved å kutte enstykke av filterpapir er stor nok til å stille de to kortvegger, og en lang vegg. Plasser filterpapir foringen inn i kammeret. Det vil helt våt når oppløsningsmidlet tilsettes til kammeret.
- Forbered 100 ml av den mobile fase oppløsningsmiddel, som er heksan: dietyleter: eddiksyre (H: E: A, 80:20:2 v / v / v). Hell løsningsmiddel inn i kammeret for å gi en dybde på omtrent 1 cm. Dekk med glasslokk, ved hjelp av et silikonfett tetning langs den øvre kanten av kammeret. Tillat kammeret til likevekt over natten før bruk.
- Påfør prøven manuelt til den preparerte plate med et kapillarrør eller pipette som en kontinuerlig stripe fra omtrent 1,5 cm fra den ene kanten til 1,5 cm til den annen kant. En automatisert prøvepåførings er foretrukket fordi den ville belaste prøven i et mer homogent strek. Bruk de ytre baner av TLC plate å få øye på om 20 mL blanding av sterol, FFA, koder og sterol ester standarder (bruk på 10 mg / ml, forhåndslagde blandinger kan skaffes).
- Plasser lastet TLC plate innden ekvilibrerte kammeret, i nærheten til lokket, og utvikle platen inntil oppløsningsmidlet går til den øvre kant. Dette tar omtrent 45 min med den mobile fasen som er beskrevet her. Fjern platen fra kammeret og tillate overskytende oppløsningsmidlet til å fordampe fra platen i et avtrekksskap i omtrent 1 min.
- Spray med 0,05% rhodamin 6G i 95% etanol. Visual lipid band under en lang bølgelengde ultrafiolett lampe. Mark med en blyant R f posisjon for de fluoriserende band løst i prøven og standarder. En fotografisk rekord kan bli tatt på dette punktet.
- Identifiser bandet tilsvarende med TAG standard og fjerne det fra platen ved å skrape silika med en slikkepott til en stor del av glassine veie papir. Overfør silika til et 1,5 ml løsningsmiddel-rensende mikrosentrifugerør.
- Tilsett 1,0 ml av 03:02 C: M oppløsningsmiddel til prøverøret, sonicate i 1 min, pelletere silika ved sentrifugering, og deretter overføre det løsningsmiddel inn i et nytt pre-veide rør. Gjenta the foregående trinn, basseng filtratene, og fordamp løsningsmidlet under en strøm av N2.
- Oppbevar det tørkede residuum inneholdKategorier under N2 i mørke ved 4 ° C mens ytterligere vevsprøver er separert ved hjelp av TLC. Rhodamine 6G er til stede i prøvene, men det er uoppløselig i heksan, og blir fjernet under prøveoppløsningen umiddelbart før MS-analyse.
Tre. TAG Analyse av MALDI-TOF MS
- Tilbered en frisk α-cyano-4-hydroksy-kanelsyre (CHCA) matrix-løsning ved å oppløse 10 mg CHCA i 1 ml løsningsmiddel (49.5% etanol, 49.5% acetonitril, og 1% vandig 0,1% TFA).
- Forbered adrenocarticotropic hormon (ACTH, 18-39 klips, 2465,1989 Da) for oppløsning instrument og følsomhet testing ved å blande 1 mL av ACTH (1 mg / ml) med 39,5 mL av 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) for å oppnå en 10 pmol / ul stamløsning. Det kan lagres ved -20 ° C for fremtidig bruk.
- Forbered en fersk arbeids ACTH solution (1 pmol / ul) ved å ta 1 pl av 10 pmol / mL stamløsning, blandes med 9 ul 0,1% TFA, og deretter å blande (1:1) med 10 pl av den CHCA matriks-løsning for å oppnå en 500 fmol / mL konsentrasjon.
- Forbered Tags standarder på 10 mg / ml i 3:02 C: M for MALDI instrumentkalibrering (f.eks tricaprin [470,361 Da], tricaprylin [554,455 Da], trilaurin [638,549 Da], tripalmitin [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristin [806,736 Da], triolein [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], og trierucin [1052,971 Da]).
- Forbered triolein på 10 mg / ml i 3:02 C: M for en ekstern lock-mass kalibrering TAG standard.
- Oppløs de lagrede Tags prøvene i heksan til en 10 mg / ml løsning.
- Forbered en 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) lager løsning av 2,5-dihydroksybenzoesyre (DHB) med 90% metanol for bruk som prøve og standard matrise. Også forberede en 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) oppløsning av NaOH. Dekk røret med DHB løsning ved hjelp av aluminium foi l å beskytte mot lys.
- Mix (i forvasket rør) 10,0 mL DHB matrise, 10,0 mL prøve eller standard, og 5,0 mL 1,0 M NaOH. Bland og kort sentrifuge røret for å bringe blandingen til bunnen.
- Spot 1,0 mL av standard, sample, eller ACTH mot en MALDI rustfritt stål sikteplate og legg i en eksikkator til den er tørr. Plasser måleplaten i instrumentet for datainnsamling.
- Utfør MALDI-TOF MS analyser i positiv reflectron modus. Tune og kalibrere instrumentet som beskrevet av instrumentprodusenten bruker ACTH og TAG standardløsninger.
- Innhente spektra for hver prøve flekket på måleplaten (samsvar med instrument spesifikasjoner; parametre for dette arbeidet var 5 Hz laser avfyringshastighet, ~ 100 skudd pr base for å oppnå en gjennomsnittlig spektrum). Etter jevne og trekke bakgrunn fra MALDI spektra, prosess ion topper manuelt med online søkemotoren LIPID MAPS (/ Verktøy / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / verktøy / ms / glycerolipids_batch).
- Kopier og lim listen spektra inn i listen av forløperen ioner og intensitet boksen. Begrens søket til acylsammensetningen ønsket. Identifiser merker ved den masse / charge (m / z) forholdstall fra ioner som er tilstede i spekteret for hver prøve. Hvis fatty acid methyl ester (FAME) prosenter er tilgjengelig fra egen GC / MS analyse, legge disse data for å få sannsynlig av koder til stede.
INSTRUMENT: Den massespektrometer brukt i denne studien er en Waters Micro MALDI MX (utstyrt med et 337 nm 20 Hz N 2-laser). Kan brukes noen produsentens MALDI instrument med positive reflectron moduskapabilitet. Generelle innstillinger som brukes er puls spenning, 2000 V; reflectron, 5200 V; kilde, 15 000 V, med datainnsamling ved hjelp MassLynx programvare (ver. 4.0). Denne bruksforhold gir masse oppløsning større enn 12000.
Representative Results
Ekstraksjonen fremgangsmåte for isolering av totale lipider fra vev beskrevet av Folch 30 er en enkel prosedyre, som er tilpasset her. Etter at vevet ekstraksjon og fordampning oppløsningsmiddel, lipider forekommer ofte som et gulaktig film. Den gule fargen mest sannsynlig er fra protein-forurensninger som kan fjernes ved å utføre en væske-væske-ekstraksjon. Denne ekstra prøvebehandling er ikke nødvendig i denne fremgangsmåten, fordi preparativ TLC skiller TAG fraksjonen fra slike forurensninger. Tilsetningen av frisk vannfritt natriumsulfat ved alle filtreringstrinn bidrar til å redusere vannforurensning som påvirker nøyaktige lipid vektbestemmelser.
Pattedyr integumentary lipid analyser ved preparativ TLC med H: E: A som den mobile fasen vil vanligvis løse fire forskjellige band tilsvarende (med start fra opprinnelse) steroler, FFA, koder og sterolestere / voksestre / squalene (Figur 1). Noen ganger når du bruker analytical høy ytelse (HP) TLC 'H: E: A mobile fasen, de sterolestere, voksaktige estere, og squalen vil skille og fremkommer som tre separate bånd. Under de betingelser som brukes i den foreliggende undersøkelse, er det sterol / voksaktige estere ikke separert. Hvis disse band er av interesse, kan den mobile fasen endres til isooktan: etyleter (95:5, v / v), og HPTLC plate kan analyseres ved å skanne densitometry. Andre faktorer kan føre til dårlig separasjon. Disse er vanligvis elimineres ved å plassere filterpapiret i kammeret, påføring av smørefett for god tetning på lokket, ved ekvilibrering av kammeret over natten, og holde rene TLC kamre, for å oppnå jevn kvalitet TLC separasjoner og data.
Representative MALDI-TOF-massespektra innhentes for merking isolert fra Midtøsten røde bat er vist i figurene 2 og 3. Disse spektra inneholder merker ion topper i masseområdet mellom m / z 850 til 910, som er typisk for merking isolert fra ikke-vann pattedyrets. Tilsetningen av 1,0 M NaOH fremmer enkeltvis ladet Na +-ioner som er mer stabil enn H +-ioner. I tillegg til stabilitet, fravær av H + og K +-ioner øker enkel spektrumanalyse. Den m / z 850-910 ion topper tilsvarer 16:00, 18:00, 18:01 og 18:02 FA delene kan være de dominerende acyl bestanddeler i tags (Tabell 1). Mulige FA moieties av koder kan i utgangspunktet bestemt av total ion m / z stede i MALDI-TOF MS spektra, og forskjeller mellom arter og individer utledet. Imidlertid, hvis de spesifikke forhold av acyl-innhold er nødvendig, så MS / MS-eller gass-kromatografi (GC / MS) må benyttes. Videre informasjon om acyl forholdstall kan utledes ved å observere toppene i diacylglycerides området av spekteret (figur 4). Diacylglycerides er produsert fra TAG fragmentering i MALDI kilde og kan finnes i m / z 590 til 650 området. TAG fragmentering kan økes vedå sløyfe tilsetningen av 1,0 M NaOH 16. Eastern red bat vingevevet er karakterisert ved en dominerende topp ved m / z 879,7 og hår vevet med en dominerende topp ved m / z 881,8 (fig. 2 og 3 respektivt). Topper på m / z 907,8, 879,7 og 855,7 (POP, PPOs) er omtrent selv i intensitet (~ 50%) i håret vev med topp på 853,7 vesen ~ 40%.
| Sammensetning | Elemental Sammensetning | Observert Mass |
| Na + TAGs | Na + TAGs | |
| SSO | C 57 H 108 O 6 | 911,8 |
| OOS, LSS | C 57 H 106 O 6 | 909,8 |
| OOO, LNSS, LSO | C 57 H104 O 6 | 907,8 |
| LOO, LLS | C 57 H 102 O 6 | 905,8 |
| LLO, OOLn | C 57 H 100 O 6 | 903,7 |
| LLL | C 57 H 98 O 6 | 901,7 |
| LLLn | C 57 H 96 O 6 | 899,7 |
| LLnLn | C 57 H 94 O 6 | 897,7 |
| LnLnLn | C 57 H 92 O 6 | 895,7 |
| OSP | C 55 H 104 O 6 | 883,8 |
| LSP, OOP, Sopo | C 55 H 102 O 6 | 881,8 |
| LOP, LnSP, LSPo | C 55 H 100 O 6 </ Td> | 879,7 |
| LLP, LNOP, Lopo | C 55 H 98 O 6 | 877,7 |
| LnLP, LLPo, LnOPo | C 55 H 96 O 6 | 875,7 |
| LnLnP, LnLPo | C 55 H 94 O 6 | 873,7 |
| LnLnPo | C 55 H 92 O 6 | 871,7 |
| PPS | C 53 H 102 O 6 | 857,8 |
| POP, Ppos | C 53 H 100 O 6 | 855,7 |
| Oom, PPL, POPOS, Popo | C 53 H 98 O 6 | 853,7 |
| PPLn, Ppol, Popoo, MyOO | C 53 H 96 O 6 | 851,7 |
| LLM, LnOM | C 53 H 94 6 | 849,7 |
| PPP, SSLa | C 51 H 98 O 6 | 829,7 |
| PPPo, Osla | C 51 H 96 O 6 | 827,7 |
| PPoPo, PMyO | C 51 H 94 O 6 | 825,7 |
| LnLnLa | C 51 H 86 O 6 | 817,6 |
| MMS, klapse, PPM | C 49 H 94 O 6 | 801,7 |
| SLaPo, PPoM, PPMy | C 49 H 92 U-6 | 799,7 |
| PoPoM, OOCa | C 49 H 90 U-6 | 797,7 |
| MMP | C 47 H 90 O 6 | 773,7 |
| MMPO, OCAP | C 47 H 88 O6 | 771,7 |
| OCaPo | C 47 H 86 O 6 | 769,6 |
| MMM, PPCa, PMLa | C 45 H 86 O 6 | 745,6 |
| PoPCa, PoMLa | C 45 H 84 O 6 | 743,6 |
| PoPoCa | C 45 H 82 O 6 | 741,6 |
| LaLaP, MMLa, Børsverdi | C 43 H 82 O 6 | 717,6 |
| LaLaPo | C 43 H 80 O 6 | 715,6 |
| OO | C 39 H 72 O 5 | 643,5 |
| OL | C 39 H 70 O 5 | 641.5 |
| LL | C 39 H 68 O 5 | 639,5 |
| SP | C 37 H 72 O 5 | 619,5 |
| OP | C 37 H 70 O 5 | 617,5 |
| LP | C 37 H 68 O 5 | 615,5 |
Tabell 1. Fettsyresammensetning, elementsammensetningen, og isotopisk massen av sodiated addukter av triacylglycerides og diacylglycerides. Ln = linolensyre (18:03), L = linolsyre (18:02), O = oljesyre (18:01), S = stearinsyre (18:00), P = palmitinsyre (16:00), Po = palmitoleic syre (16:01), M = myristinsyren (14:00), My = myristoleic syre (14:01) La = laurin syre (12:00), Ca = kaprinsyre (10:00).
Figur 1. Tynn-sjikt kromatogram av bred lipidklasse separasjon av heksan: dietyleter: eddiksyre(80:20:2 v / v / v) som den mobile fase. Båndet mellom sterol og FFA ble ikke identifisert ved en standard, men kan være en fettalkohol eller voks diester.
Figur 2. Utvidet TAG-regionen i MALDI-TOF masse spekteret av sodiated koder. (M / z 700-950) fra Øst-red bat (L. borealis) fløyen vev Peaks identifisert ved m / z 853,7 (oom, PPL, POPOS, Popo) og m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Utvidet TAG-regionen i MALDI-TOF masse spekteret av sodiated tags (m / z 700-950) fra Øst-red bat (L. borealis) hår vev.Peaks identifisert ved m / z 905,8 (LOO, LLS) og m / z 907,8 (OOO, LNSS, LSO). Klikk her for å se større figur .
Figur 4. DAG regionen MALDI-TOF masse spekteret av sodiated DAG fragmenter (m / z 530-730). Fra Øst rød flaggermus (L. borealis) fløyen vev Peaks identifisert ved m / z 643,5 (OO) og m / z 615,5 (LP) . Klikk her for å se større figur .
Discussion
Dette papir presenterer en enkel og robust fremgangsmåte for separering av brede lipidklasser isolert fra pattedyr integument ved preparativ TLC og bestemmelse Tags profiler ved MALDI-TOF MS, uten tidkrevende derivatisering av lipidmolekyler. De kritiske trinn i å produsere kvalitet spektra av koder med MALDI-TOF MS inkluderer: 1) Vellykket utvinning av forbindelsen med minimal forurensning eller oksidasjon, 2) Tilstrekkelig separasjon og isolasjon av kromatografi, og høy oppløsning 3) og masse nøyaktighet ved MALDI-TOF MS.
Dette papiret demonstrerer metoden ved å trekke ut og skille den nøytrale lipidfraksjonen fra plagiopatagium av Eastern rød balltre for å få Tags MS profiler. Mens denne studien brukte en flaggermusarter (Mammalia: Chiroptera) disse metodene kan bli utvidet til å studere integumentary lipider av noen pattedyrarter. Bat integument kjennetegnes ved å være overveiende kolesterol, med lavere mengder av koder, FFA, squaLene og sterol / voksestere. Sebum lipidforhold i flaggermus forskjellig fra mennesker ved at squalen er til stede i små mengder (i motsetning til opptil 16% hos mennesker), mens kolesterol inntreffer i større forholdstall (1 - 7% hos mennesker, men 26-62% i flaggermus) 22 , 31. Menneskelig hår inneholder ca 3% koder, mens forholdstall opptil 28% er funnet i Øst rødt balltre hår. Utvinning av lipid prøver fra flaggermus er lik for andre arter. Mens det i denne studien bomullsdotter dynket i oppløsningsmiddel benyttes for å fjerne talg, kan man også invertere en ampulle eller prøverør inneholdende oppløsningsmiddel på overflaten av de integument flere ganger. Specialized tape produkter også gi alternative metoder for å trekke ut overflatelipider 32. En viktig del av et riktig lipid ekstraksjon, er å minimalisere forurensning fra hudfett. Dette gjør du enkelt ved å holde en klemme flaske med metanol og sprøyting glass og kjøkkenutstyr, tørke kasseroller med en vev mellom alle prøvene og iført undersøkelseshansker. Oksidasjon of flerumettede acyls forhindres ved tilsetning av BHT, og det bør brukes uavhengig av temperaturen prøvene lagres ved.
Biomolekyl analyse krever vanligvis et kromatografisk trinn å separere molekyler av interesse fra forurensninger. TLC brukes i denne fremgangsmåte, noe som unngår instrumenterings krav til gass-eller væske-kromatografi, og krever mindre teknisk erfaring for å oppnå robust og repeterbare resultater. Avhengig av lipid-klasse av interesse, kan mange forskjellige mobile faser innarbeides. Videre kan bruk av HPTLC-plater og scanning densitometry brukes for å oppnå kvantitative resultater. Mens de variantene av TLC metoder er altfor mange til å liste her, noen vanlige mobilfaser som brukes i lipid TLC inkluderer kloroform: metanol: vann for separasjon av fosfolipider og glykolipider eller isooktan: ethylether for separering av ikke-polare lipider 28. I forhold til å skille tagger fra andre lipid klasser, H: E: En sliklvent systemet fungerer konsekvent og gir sammenlignbare resultater.
En annen fordel ved bruk av TLC, er at båndene av interesse kan bli raskt profilert ved hjelp av MALDI-TOF MS uten forutgående derivatisering av analyttene. I denne studien var silisiumdioksyd fjernes fra TLC-plate, og analytten elueres fra det ved sonikering i et løsningsmiddel og etterfølgende sentrifugering for å separere adsorbenten og inndampning av eluerende løsningsmiddel. Alternativt kan matrisen bli anvendt direkte på analysebånd separert på TLC-plater og deretter direkte analysert ved MALDI-TOF MS 33. Vellykket profilering av MALDI-TOF MS er avhengig av tilstrekkelig prøveopparbeidelse og operatørens ferdigheter med tuning og kalibrering av instrumentet. Instrumentet bør kalibreres daglig med standarder som dekker molekylvekt område som tilsvarer molekyler av interesse. Den passende følsomhet og oppløsning (f.eks ≥ 10 000) av utstyret bør også confirmeD daglig med ACTH.
Talg lipide bestanddeler som finnes på overflaten av pattedyr integument kan spille en rolle i kolonisering av bakterielle / sopp-patogener. Derfor kunnskap om den kjemiske sammensetningen mellom arter og individer kan gi hint om prosesser av menneskelige og dyreliv sykdommer. Intraspecific forskjeller mellom syke og friske personer kan representere kliniske tegn som hjelpemiddel i sykdom deteksjon og diagnose. Videre, hvis spesifikke forbindelser som hemmer vekst av mikroorganismer er til stede, disse kan identifiseres for bruk i sykdommer behandling og forebygging.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Assistanse ble gitt av Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, og Cheyenne Gerdes under utviklingen av laboratoriemetoder. Vi vil gjerne takke Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazábal, Arkansas Biosciences Institute) for å få hjelp med TLC skanning densitometry. MALDI-TOF MS brukes til dette prosjektet ble gitt gjennom NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0701890) i Arkansas Biosciences Institute. Finansieringen ble gitt av en amerikansk Fiskeri og Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, National Grotteforbund, og Senter for nordamerikanske Bat Forskning og konservering ved Indiana State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
| TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
| ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
| Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
| TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
| MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
| MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
| Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
| DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
| CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
| Sebutape | CuDerm | S100 |
References
- Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
- Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
- Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
- Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
- Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
- Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
- Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
- Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
- Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
- Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
- Horton, H. R., Moran, L. A., et al. Principles of Biochemistry. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).
- Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
- Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
- Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
- Savary, B. J., Vasu, P. Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).
- Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
- Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
- Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
- Knochenmuss, R. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).
- Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
- Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
- Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
- Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
- Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
- Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
- Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
- Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
- Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
