Summary
We presenteren een voorbereiding voor het visualiseren en manipuleren van calcium signalering in de moedertaal, intact microvasculaire endotheel. Endotheliale buizen vers geïsoleerd uit muis weerstand slagaders die skeletspieren behouden in vivo morfologie en dynamische signalisatie binnen en tussen naburige cellen. Endotheliale buizen kunnen worden bereid uit microvaten van andere weefsels en organen.
Abstract
De besturing van de bloedstroom door de weerstand vasculatuur regelt de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen gelijktijdig met de verwijdering van metabolische bijproducten, zoals bijvoorbeeld oefenen skeletspier. Endotheelcellen (EC) langs de intima van weerstandsvaten en dienen een belangrijke rol in het controleren diameter (bijv. endotheel-afhankelijke vaatverwijding) en daarmee de grootte en de distributie van weefsel bloedstroom. De regulering van de vasculaire weerstand van EC wordt uitgevoerd door intracellulaire Ca2 +-signalen, wat leidt tot productie van diffundeerbare autacoïden (bijvoorbeeld stikstofoxide en arachidonzuur metabolieten) 1-3 en hyperpolarisatie 4,5 dat gladde spiercellen relaxatie opwekken. Dus het begrijpen van de dynamiek van de endotheliale Ca 2 +-signalen is een belangrijke stap naar het begrijpen van mechanismen die de bloedstroom controle. Isoleren van endotheliale buizen elimineert verstorende variabelen geassocieerd met blood in het lumen van het vat en omringende gladde spiercellen en perivasculaire zenuwen, die anders EG structuur en functie beïnvloeden. Hier presenteren we de isolatie van endotheliale buizen uit de superieure epigastrische slagader (SEA) met behulp van een protocol geoptimaliseerd voor dit schip.
Endotheliale buizen uit een verdoofde muis isoleren, is de SEA geligeerd in situ bloed binnen het lumen van het vat te handhaven (vergemakkelijken visualiseren tijdens dissectie), en de gehele pagina buikspier uitgesneden is. De SEA wordt vrij van omringende spiervezels en bindweefsel ontleed wordt bloed gespoeld uit het lumen, en milde enzymatische digestie wordt uitgevoerd om de verwijdering van adventitia, zenuwen en gladde spiercellen met zachte trituratie inschakelen. Deze vers geïsoleerde preparaten van intacte endotheel behouden hun oorspronkelijke morfologie, individuele EC blijven functioneel gekoppeld aan elkaar, kunnen chemische en elektrische si overdragengnals intercellulair via gap junctions 6,7. Naast het verstrekken van nieuw inzicht in calcium signalering en membraanbiofysica, deze voorbereidingen toelaten moleculaire studies van genexpressie en eiwit lokalisatie binnen inheemse microvasculaire endotheel.
Introduction
In dit protocol beschrijven we de isolatie van endotheelcellen buizen uit de muis SEA. De SEA komt voort uit de interne thoracale slagader en levert zuurstofrijk bloed naar de voorste buikspieren. Onze samenwerking met de zee als een model is toe te schrijven aan het verstrekken van relatief lange, onvertakte microvessel segmenten die goed geschikt is voor het bestuderen van intercellulaire signalering gebeurtenissen ten grondslag liggen aan de rol van het endotheel in het bestuur en de coördinatie van gladde spiercellen ontspanning. Voor diegenen die geïnteresseerd zijn in andere dan de skeletspieren weefsel, hebben we deze techniek gemakkelijk worden aangepast voor het verkrijgen van endotheliale buizen van kleine bloedvaten van de hersenen, darmen en het lymfestelsel gevonden.
De belangrijke kenmerken van deze methode zijn dat intact lengte (1-3 mm) van microvasculaire endotheel zijn geïsoleerd, beveiligd tegen een glazen dekglaasje in een stromingskamer waarin zij superfused met PSS en afgebeeld voor Ca 2 +-signalen 7-9 ofgespietst voor elektrische signaal 6,8. Binnen de stroom kamer, wordt de bovenste helft van een buis blootgesteld aan de superfusie oplossing en aan experimentele ingrepen, terwijl de onderste helft (in contact met het dekglaasje) beschermd blijft en rust. Naast het bestuderen van zowel intra-en intercellulaire Ca2 + signaaltransductie gebeurtenissen kunnen endotheliale buizen worden gebruikt voor kwantitatieve real-time PCR om de genexpressie 6,10, immunohistochemie beoordelen in eiwitexpressie 6,10 onderzoeken en elektrofysiologische studies biofysische eigenschappen definiëren elektrische geleiding 6,11.
Er zijn verscheidene voordelen aan het endotheel buis voorbereiding bestuderen endotheelfunctie. De eerste is dat het isolatieproces een eenvoudige onderscheid tussen twee celpopulaties: endotheelcellen (die blijven vaatvorming) en gladde spiercellen (afzonderlijk gedissocieerd, meestal "C" vormigontspannen). Dit zorgt voor selectieve bemonstering en onderzoek van unieke eigenschappen onderliggende bijdrage respectieve cellen 'te functioneren schip. Ten tweede, dit model kunnen de resolutie van signalerende gebeurtenissen inherent aan het endotheel, onafhankelijk van de invloed van de bloedstroom, het omringen gladde spieren, zenuwen en parenchym. Ten derde wordt het endotheel bestudeerd terwijl vers geïsoleerde, waardoor veranderingen in gen of eiwit expressie geassocieerd met celkweek vermijden.
Protocol
1. Voorbereiding van de uitrusting: Flow Chamber, pipetten, en oplossingen
- Flow kamer: Gebruik een stromingskamer met een 24 mm x 50 mm glazen dekglaasje op de bodem om de geïsoleerde endotheliale buizen (zie figuur 1A) superfuse. Vóór de montage van de kamer, was de dekglaasjes met beide 3% HCl en 70% ethanol, spoelen met ultrapuur water, en droog met stikstofgas.
- Pipetten: Drie verschillende types van pipetten worden gebruikt tijdens het protocol: infusen, aanwrijven, en pinning. Zowel de infusen en pinning pipetten worden vóór de dag van het experiment, maar de tritureren tube moet de dag zoals vereist kennis van de diameter van het vat op maat het lumen wijze kunnen plaatsvinden.
- Canulatie pipetten: om rode bloedcellen te spoelen van het lumen, trek borosilicaatglas capillaire buizen met behulp van een micropipet trekker tot lange, taps toelopende uiteinden. Breek de uiteinden met een tang om een buitendiameter ~ 30% less dan die van de slagaders (~ 50-80 micrometer), en vuur polijsten de tip glad zijn (zie figuur 1B). Het is nuttig om ook de hoek van de uiteinden van de pipetten tot ongeveer 45 °.
- Trituratie pipetten: mechanisch dissociëren de gladde spiercellen en adventitia van de endotheliale pijpen maken tritureren pipetten van borosilicaatglas capillaire buisjes. Bereid capillaire buisjes zoals hierboven, en breek het uiteinde met pincet. Tip: Gebruik een glazen scoresysteem om het gemakkelijker om de dikkere wand van de glazen pipet tritureren netjes breken. Breek de pipet aan de inwendige diameter bepaald op de dag van het experiment, ongeveer 10-20 urn groter dan de buitendiameter van het vat waaruit endotheliale buizen worden geïsoleerd. Fire polish de gebroken uiteinden tot een gladde massa (zie figuur 1C).
- Pinning pipetten: Om de endotheliale buis binnen de stromingskamer stabiliseren, maken pinning pipetten te beveiligen de endotheliale tUbe tegen de dekglaasje bodem van de kamer. Trek glazen capillaire buisjes op dezelfde wijze als de canule pipetten. Dan breken de uiteinden met een tang om een diameter van ~ 100 micrometer, en vuur polijsten tot de uiteinden zijn afgedicht, afgerond en glad (zie figuur 1D). Opmerking: als de punt van de pinning pipet wordt niet volledig afgesloten, zal vloeistof het lumen te voeren en kunnen experimentele resultaten verwarren.
- Oplossingen: Bereid alle oplossingen in ultrapuur (18.2 MQ) H 2 O en steriliseer ze door een 0,2 um filter. Zorg ervoor dat de osmolaliteit van de oplossingen is tussen 285-300 mOsm. Oplossingen blijven goed gedurende ongeveer twee weken indien bewaard bij 4 ° C.
- Dissection oplossing: De zoutoplossing tijdens de dissectie van de superieure epigastrische slagader bestaat uit (in mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur ( HEPES), 10 glucose, 0,01 natriumnitroprusside (SNP), eend 0,1% runderserumalbumine (BSA) met een pH van 7,4. De NO donor SNP is opgenomen om te helpen ontspannen gladde spiercellen, waardoor ze makkelijker om de slagader canule en gladde spiercellen verwijdering gedurende fijnwrijving vergemakkelijken.
- Dissociatie oplossing: De zoutoplossing tijdens de dissociatie van de endotheliale buis bestaat uit (in mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 2 CaCl2 en 0,1% BSA, met een pH van 7,4. Een 1 ml van deze buffer, voeg: 0,62 mg / ml papaïne 1,5 mg / ml collagenase en 1,0 mg / ml dithioerythritol. Omdat enzymen van verschillende leveranciers verschillende niveaus van enzymatische activiteit hebben, worden de artikelnummers van die voor dit werk opgenomen als referentie in de tabel van materialen. Opmerking: Tijdens het protocol zowel dissociatie buffer en dissociatie buffer met enzymen worden op verschillende stappen.
- Superfusie oplossing: De fysiologische zoutoplossing (PSS) gebruikt voor superfusing de geïsoleerde endotheliale buis bestaat uit (in mmol / L): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose en 2 CaCl2, met een pH van 7,4.
- Bereid buffers en oplossingen voor het begin van chirurgische procedures. Verwijder de oplossingen van 4 ° C en de hoeveelheid 50 ml van Dissection buffer in een 200 ml erlenmeyer en plaats het op het ijs. Daarnaast aliquot van 50 ml van dissociatie buffer zonder enzymen en plaats het op de bank top om op kamertemperatuur komen. Verwijder de superfusie oplossing van 4 ° C en laat het op kamertemperatuur op de bank top.
2. Bereiding van dieren
Zorg ervoor dat alle procedures en protocollen met dieren zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit vanMissouri.
- Gebruik mannelijke of vrouwelijke muizen ten minste 9 weken oud en studie elk afzonderlijk. Verdoven een muis met natriumpentobarbital (60 mg / kg) via de intraperitoneale (ip) injectie. Tip: Verdunning de pentobarbital 10 mg / ml in steriele zoutoplossing voor injectie vermindert de mogelijkheid van overdosering.
- Anesthesie compromissen temperatuurregeling, dus houd de muis warm onmiddellijk na de eerste injectie van pentobarbital. Met een metalen drager (geventileerd aluminium mand) op een verwarmingsplaat (gekalibreerd op ~ 37 ° C) werkt goed om de temperatuur van de muis stabiel. U kunt ook een warmtelamp, en zorg ervoor dat de stand op een geschikte afstand van de muis. Toezicht houden op de muis om de 5-10 min tot het juiste niveau van de anesthesie wordt bereikt (het ontbreken van terugtrekking tot teen of staart knijpen). Een aanvullende dosis kan nodig zijn na 15-20 minuten. Het beste is om langzaam en voorzichtig te werk gaan om overdosering te vermijden, vooral bij zwaarlijvige, leeftijd, of dierlijkes anders benadrukt.
- Verwijder het haar van de buikzijde door zorgvuldig te scheren met klein huisdier tondeuses. Bijzondere aandacht moet worden genomen om trauma aan het dier te voorkomen. Het is nuttig om alle haren uit een gebied verspreid over de oksels om de schaamstreek te verwijderen. Verwijder eventuele losjes vasthouden haar met een frisse alcoholdoekje.
- Plaats de muis op de rug liggen met zowel voor-en achterpoten gespreid om zoveel mogelijk van de buikwand mogelijk bloot. Gebruik indien nodig laboratorium tape om de benen te beveiligen in een spread-eagle manier.
3. Isolatie van de Superior Epigastrische Artery
- Voeg een kleine incisie door de huid boven het gebied van de schaamstreek. Zorg ervoor dat alleen de huid wordt gesneden terwijl het vermijden van schade aan de onderliggende buikspier; uitbreiding van de incisie lateraal in elke richting te onderscheiden achterpoten. Verdere rostraal incisie langs de ventrale middellijn naar de top van de ribbenkast en den lateraal uitstrekken de incisie in elke richting om respectieve voorpoten.
- Til de huid met een schaar te verbreken het bindweefsel die de huid aan de onderliggende spieren, waardoor het gehele oppervlak van de buikspieren bloot (zie figuur 3A). Irrigeren de blootgestelde spier met kamertemperatuur 0,9% zoutoplossing.
- Vanwege de geringe omvang van de zee, op het dier onder een stereomicroscoop voor verdere procedures. Til het vet pad aan de onderkant van het borstbeen met een tang en een insnijding maken doorheen. Blijven de incisie langs de onderste rib en zorg ervoor niet te diep te snijden in het onderliggende weefsel. De SEA moet zichtbaar zijn; zorg om beschadiging te voorkomen. Zodra de incisie is voltooid, irrigeren de blootgestelde weefsel met kamertemperatuur 0,9% zoutoplossing.
- Na teruggetrokken is de bovenste laag van de skeletspieren, worden de SEA en de onderliggende spier gemakkelijk te herkennen. Tip: Let op de lengte vande SEA in vivo voor het isoleren van endotheliale buizen (die verkorten langs hun as na isolatie) uit te breiden tot hun oorspronkelijke lengte benaderen. Met behulp van een tang en schaar, accijnzen zorgvuldig de dunne spierlaag onder de SEA.
- Met behulp van schuine pincet, langs een lengte van 6-0 zijden hechtdraad onder de SEA en afbinden van de slagader en de aangrenzende ader om het onder druk en bloed vastgehouden binnen het lumen van het vat te visualisatie tijdens de daaropvolgende isolatie en het schoonmaken te vergemakkelijken houden.
- Herhaal de SEA ligatie procedure aan de contralaterale zijde.
- Zodra beide SEA zijn geligeerd, maken een incisie langs de middellijn van de buikspieren aan de respectievelijke zijden scheiden.
- Verleng de incisie lateraal in elke richting zoals voor de huid, dan blijven de incisie verticaal langs de buitenkant volledig scheiden van de buikspier uit het lichaam. Voorkom schade aan het vaatstelsel gevoed door de zee naar het lumen onder druk te handhaven.
- Cut de SEA boven de ligatie om de afdichting te behouden en plaats de geïsoleerde spier en slagader in een bekerglas van 50 ml die 10 ml 4 ° C dissectie buffer.
- Herhaal deze procedure voor de andere kant van de buik en incubeer de weefsels in de dissectie buffer gedurende 10 minuten.
- Plaats de buikspier met de zee in een gekoelde (4 ° C) dissectie cupje met dissectie buffer (zie figuur 3B). De ontleding kamer bestaat uit een petrischaal met een laag Sylgard (polydimethylsiloxaan [PDMS]) onderaan.
- Met behulp insect pinnen (0,15 mm), strek de geïsoleerde SEA en buikspier aan in vivo lengtes (hierboven vermeld) benaderen en bevestig deze aan de Sylgard. Tip: Oriënteren de spier zodanig dat de dunne laag tegenover het buikvlies is op de top maakt het SEA gemakkelijk zichtbaar met behulp transillumination.
- Gebruik te maken van fijne microdissection instrumenten en werken vanuit de stroomopwaartse plaats van de eileiders naar destroomafwaartse einde, schakelt de zee vanaf het gepaarde ader en het omliggende weefsel tot de eerste grote filiaalsite (1-2 cm). Accijnzen dan de zee door te snijden net boven de filiaalsite en net onder de ligatie.
- Om bloed vastgehouden binnen het lumen van het vat te verwijderen, canule de zee en spoelen met ijskoud dissectie buffer. Met behulp van een stuk van flexibele buizen, bevestigt u de back-end van een cannulatie pipet een 5 ml spuit met ijskoude dissectie buffer en zet de micropipet in een micromanipulator om de punt te positioneren binnen de dissectie kamer naar de SEA canule.
- Zodra alle van de erytrocyten worden gespoeld, verwijder de SEA van de infusen pipet, en til de pipet uit de dissectie schotel.
- Snijd de SEA in kleinere segmenten elke 1-3 mm in lengte. Deze kortere segmenten vergemakkelijkt het isoleren van endotheliale buizen.
4. Isolatie van de endotheliale Tube
- Vul een 12 mm x 75 mm glas culture buis halverwege met ijskoud dissectie buffer. Met behulp van gebogen tang, overdracht van de arteriële stukken in de cultuur buis en plaats op ijs. Op dit moment, combineren de spijsverteringsenzymen met dissociatie buffer tot een eindvolume van 1 ml in een afzonderlijke 12 mm x 75 mm kweekbuis (zie 1.3.2 Solutions) en verwarm de oplossing tot 37 ° C met een verwarmingsblok.
- Terwijl de dissociatie buffer en enzymen zijn warming-up, zorgvuldig aspireren de dissectie buffer van de cultuur buis verlaten van een klein volume met daarin de segmenten vat.
- Voeg zachtjes kamertemperatuur dissociatie buffer zonder enzymen weg te wassen overgebleven dissectie buffer. Tip: Voeg de dissociatie buffer langzaam zodat de arteriële stukken blijven op de bodem van de cultuurbuis om tijd wachten tot ze vestigen. Til de buffer temperatuur over meerdere stappen uit ijs (4 ° C), op kamertemperatuur (~ 24 ° C), tot 37 ° C om de schokken te minimaliseren.
- Zuig voorzichtig de dissociation buffer van de cultuur buis, opnieuw en zorg ervoor dat een klein volume met daarin de segmenten vaartuig te verlaten.
- Verwijder de voorverwarming dissociatie buffer met enzymen uit de verwarmingsblok, overdragen 1 ml enzymoplossing de cultuur buis met de segmenten vat en plaats de cultuurbuis weer het verwarmingsblok. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Tijdens de incubatie met enzymen, bereiden de tritureren pipet, opvulling met minerale olie en zet hem op een micro die in een micromanipulator is gemonteerd. Trekken dan de micro-zuiger om de pipet te vullen met 2 nl van dissociatie buffer en plaats de pipet tip over de stroom kamer.
- Aan het eind van de 30 min. incubatie, verwijder de cultuur buis uit het verwarmingsblok en zorgvuldig zuig de buffer als hierboven.
- Was de arteriële segmenten 4 ml kamertemperatuur dissociatie buffer. Opmerking: Het is niet meer nodig om het schip segm houdenouders onderaan de cultuurbuis, verstoren de arteriële stukken daadwerkelijk helpt te waarborgen dat resterende enzymen effectief worden verwijderd.
- Overdracht een vaartuig segment de stroom kamer voorzichtig opzuigen met een 1 ml micropipet, en plaats deze in de stroom kamer met 1 ml van de dissociatie buffer.
- Gebruik makend van de micromanipulator met de injectiespuit, plaats de punt van de pipet aanwrijving nabij een uiteinde van het segment vaartuig.
- Zuig het vaartuig segment (500 nl teruggetrokken) in de tritureren pipet langzaam (225 nl / s), zodat er geen mechanische belasting veroorzaken aan de EC en uitwerpen terug in de kamer. Als de spijsvertering succesvol was, zal de gladde spiercellen en adventitia los worden gezien van de endotheliale buis.
- Herhaal de aanwrijving totdat alle gladde spiercellen kunnen worden gescheiden. Wees ervan bewust dat overmatig wrijven (4x of meer) van de EC kan beschadigen en ze niet reageren op agonisten maken. Tip:met behulp van de tritureren pipet, verplaats de adventitia weg van de endotheliale tube zo snel mogelijk om te voorkomen dat verstrikken de buis. Opmerking: Het gebruik van de tritureren pipet, kan de geïsoleerde endotheliale buis worden opgezogen en overgebracht naar een aparte kamer.
- Plaats de endotheliale buis in het midden van de stromingskamer, uitgelijnd langs de stromingsrichting, en verwijder het fijnwrijven pipet.
- Veilig pinning pipetten op micromanipulators gemonteerd aan weerszijden van de stromingskamer en plaats de uiteinden bij respectieve einden van de endotheliale buis.
- Laat een pinning pipet op een uiteinde van de buis te drukken tegen de bodem van de kamer. Plaats de tweede pinning pipet op dezelfde wijze aan het andere uiteinde van de buis. Opmerking: als de pinning pipetten is een afweging tussen het vastzetten van de buis (door ze verder van het uiteinde van de buis) en waardoor meer beeldvorming / experimentele omgeving (door ze dichter bij het einde van de buis). Lokaliseren tzoom ~ 50 micrometer van elk uiteinde van de buis werkt goed. Zoals de pinning pipet raakt de buis langzaam uitlopen en langs de as van de buis, waardoor het verlenging van de in vivo lengte aangepast; druk de pipet tegen de kamer beneden naar fixeren.
- Begin de stroom van superfusie oplossing en laat de endotheliale buis vervolgens gedurende ten minste 20 minuten in evenwicht komen en zich (zie figuur 3C). Maken gebruik van een peristaltische pomp om een constante vloeistofstroom (superfusie) over de endotheliale buis handhaven. Opmerking: Pinnen pipetten kan worden verwijderd zodra het endotheel buis gehecht aan de bodem van de stromingskamer (~ 25 minuten) of links getroffen om de endotheliale buis niet verdreven wordt.
5. Dye laden en Calcium Imaging
- Om intracellulair calcium reacties te visualiseren, laadt de endotheliale buis met fluo-04:00 kleurstof bij kamertemperatuur (~ 24 ° C). Stop vloeistofstroom in het bad, en voeg fluo-4AM de kamer bij een eindconcentratie van 10 uM. Wacht 10 minuten zodat de kleurstof om cellen in te voeren en superfuse de endotheliale buis met verse PSS 20 min om te zorgen extracellulaire kleurstof wordt verwijderd en dat intracellulaire kleurstof is volledig gedeësterificeerd.
- Voer calcium beeldvorming. Voor dit werk, een rechtopstaande microscoop (zie figuur 2) met een draaiende schijf confocale beeldvorming werd gebruikt bij omgevingstemperatuur. Prikkelen de fluorescerende calcium kleurstof met een 491 nm laser en het verwerven van beelden (bij 500-550 nm emissie) met behulp van een intensievere digitale camera.
Representative Results
Calcium reacties kunnen worden geïnitieerd in vers geïsoleerde endotheliale buizen met behulp van acetylcholine (ACh). In deze film wordt een endotheliale buis geladen met 10 uM fluo-04:00 gestimuleerd met superfusie van 1 uM ACh (Film 1). Klik hier om de film te bekijken . De kleurstof wordt geëxciteerd bij 491 nm en de emissie is geregistreerd 500-550 nm met een geïntensiveerde ladingsgekoppelde inrichting camera. Afbeelding stapels worden verworven bij 120 frames / seconde voor een periode van 25 seconden en kan dan worden gemiddeld (bijv. 40 frames / sec). Representatieve fluorescentiebeelden tijd worden getoond in Figuur 4.
Figuur 1. Flow kamer en pipetten tijdens isolatie van endotheliale buizen. A) De stromingskamer gemonteerd met een 24 mm x 50 mm glas dekglaasje als de basis. B) Voorbeelden van een getrokken (links) en een getrokken, gebroken, gepolijst en schuin (rechts) canulatie pipet. De pipet wordt gebruikt om erythrocyten spoelen van het lumen van de slagader na dissectie. Schaal bar = 200 micrometer. C) Voorbeelden van een getrokken (links) en een getrokken, gebroken en gepolijst (rechts) fijnwrijving pipet. De binnendiameter van de pipet wordt bepaald door de buitendiameter van de slagader. Schaal bar = 200 micrometer. D) Voorbeelden van een getrokken (links) en een getrokken, gebroken en gepolijst (rechts) pinning pipet. De tip van deze pipet wordt afgerond en volledig afgesloten om het endotheel te fixeren in de stroom kamer. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Spinning disk confocale microscoop voor beeldvorming van Ca 2 +-signalen. A) Upright microscoop gebruikt voor calcium beeldvorming. B) (a) confocale draaiende schijf unit met een (b) geïntensiveerd charge-coupled device camera. C) Immersion doelstellingen (a) 63x ( NA = 1) en (b) 20X (NA = 0.5) gebruikt voor de beeldvorming. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Isolatie van de buikspier en superieure epigastrische slagader. A (dwz waar schepen moet worden afgebonden). Schaal bar = 1 cm. B) Geïsoleerde buikspier (eenzijdig) en SEA gespeld in een dissectie kamer voor microdissection. Rode pijl geeft de eerste grote splitsing plaats van de SEA (dwz het punt waarop het schoonmaken van het schip is gestopt). Schaal bar = 1 cm. C) Geïsoleerde endotheelcellen buis van een SEA. Differentieel interferentie contrast beeld van een endotheel buis na 1 uur incuberen bij kamertemperatuur. De endotheliale buis werd superfused met superfusieapparaat buffer bij 3 ml / min. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Calcium fluorescentie in een endotheelcellen buis. Representatieve fluorescente beelden van een endotheliale buis als reactie op stimulatie met 1 uM acetylcholine. A) Fluorescentie vóór stimulatie. B) endotheliale buis fluorescentie op het moment van acetylcholine toediening, t = 0 sec. C) endotheliale buis fluorescentie bij t = 5 sec. D) endotheliale buis fluorescentie bij t = 10 sec. E) endotheliale buis fluorescentie bij t = 15 sec. F) endotheliale buis fluorescentie bij t = 20 sec. Schaal bars = 40 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .
Discussion
Hier beschrijven we de isolatie van endotheliale buizen van de zee en het gebruik van dit preparaat te visualiseren Ca 2 +-signalen gebeurtenissen binnen haar constitutieve EC. Deze procedure werd aangepast ve aanvankelijk ontwikkeld endotheliale buizen isoleren van arteriolen van de hamster cremasterspier 8. Gebruikmakend kleine wijzigingen van de hier gepresenteerde technieken hebben we geïsoleerde endotheliale buizen van verschillende vasculaire bedden, inclusief: voer slagaders van de hamster retractor spier en wangzak arteriolen 10, muis superieure epigastrische slagader 6,7,9, muis mesenterische en cerebrale slagaders en lymfatische haarvaten (ongepubliceerde waarnemingen; referenties zijn opgenomen voor het isoleren van mesenteriale vaten 12 en hersenvaten 13). Isoleren van endotheliale buizen uit nieuwe vaatbedden kunnen aanpassingen aan het oorspronkelijke protocol nodig. Als isolatie is mislukt, is het het beste om te beginnen door het veranderen van de spijsvertering tijden:Verhoog de spijsvertering tijd als endotheliale buizen zijn moeilijk te isoleren van gladde spiercellen en adventitia en vermindert digestie tijd als de endotheliale buis niet intact. Als het veranderen van de spijsvertering keer is mislukt, het aanpassen van de concentratie van de spijsvertering enzymen of de spijsvertering temperatuur moet worden berecht. Een andere optie is om de inwendige diameter van het tritureren pipet, die dwarskracht in het verwijderen van gladde spiercellen verhoogt verminderen. Het verhogen van de snelheid van vloeistof uitwerpen kan worden geprobeerd voor hetzelfde effect maar eerder de bereiding beschadigen. Erkend moet worden dat het niet mogelijk is om intacte endotheliale buizen isoleren van vaten waarin endotheelcellen niet goed met elkaar verbonden door verbindings eiwitten.
Dissociatie van gladde spiercellen na enzymatische digestie werd aanvankelijk uitgevoerd met een hand stijl pipet 8. We hebben de aanwrijving procedure verfijnd met behulp van een microsyringe systeem dat constante isolatie langere endotheliale buizen (tot 3 mm) 6 heeft ingeschakeld. Bij gebruik van dit systeem wordt het tritureren pipet opgevuld met minerale olie om een continue vloeistofkolom tussen de zuiger controle vloeiende beweging en PSS met het segment schip. De onsamendrukbaarheid vocht samen met de constante drijvende kracht van de micro-zuiger resultaten in constante afschuiving als het schip wordt gedwongen door de pipet tip. Daarentegen hand technieken vaak gebruikt voor het dissociëren van de cellen (bijvoorbeeld knijpen rubberen bol aan het einde van een Pasteur pipet) omvat het comprimeren van lucht, die variabiliteit in de aandrijfdruk introduceert en daardoor afschuiving bij de pipetpunt uitgeoefend.
Er zijn vele voordelen aan de buis voorbereiding voor het bestuderen endotheelfunctie in microvaatjes. De eerste is dat de isolatie proces biedt duidelijke homogene inheemse cellulaire populaties van EC en glad muSCLE cellen. Aangezien de EC blijven fysiek aangesloten zoals buizen, die verschillen van individuele gladde spiercellen, die een "C"-configuratie behouden, wanneer ze blijven ontspannen tijdens trituratie. Zo respectievelijke celtypen worden gemakkelijk onderscheiden, bijvoorbeeld bij het verkrijgen van monsters voor moleculaire technieken zoals real-time PCR en immunohistochemie 10. Aangezien meerdere buizen worden geïsoleerd uit een enkel schip (of uit bilaterale schepen zoals voor het SEA), kunnen moleculaire data en functionele gegevens worden verkregen uit dezelfde vaartuigen van een bepaald dier. Zo moleculaire expressie kan worden gecorreleerd met het functionele gedrag van microvasculaire endotheel. Verder kunnen zowel intra-en intercellulaire signalering gebeurtenissen inherent aan microvasculair endotheel onafhankelijk worden opgelost van de invloed van hemodynamische krachten (druk, debiet), vasoactieve middelen vervoerd in de bloedstroom (bijv. hormonen), of omringende gladde spiercellen (bv.60; via myoendothelial koppeling 14-16), zenuwen 17 of weefsel parenchym 18.
Belangrijk, omdat het endotheel vers geïsoleerd uit microvaatjes aangeduid, is er geen verandering in fenotype die anders is geassocieerd met kweken EC 19-21. Bijvoorbeeld, gekweekte EC verliezen muscarine receptor expressie en daardoor hun calcium signalering profielen wijzigen. Verder kan elektrofysiologische eigenschappen van EC te veranderen in cultuur 22. Omdat individuele EC blijven gekoppeld door middel van functionele gap junction kanalen, de endotheliale buis presenteert een ideaal model voor het bestuderen van de geleiding van elektrische en Ca 2 +-signalen tussen cellen 6,7. Er moet ook worden erkend dat de gedissocieerde gladde spiercellen gemakkelijk worden bestudeerd met patch-clamp technieken om aanvullende gegevens waarop microvasculaire functie 23.
Een belangrijke beperking van het endotheel buis mOdel is de instabiliteit van het preparaat met toenemende temperatuur. Terwijl onze voorbereidingen van de SEA stabiele en gezonde hebben bewezen bij kamertemperatuur (~ 24 ° C) en gedurende enkele uren bij 32 ° C, morfologische en functionele achteruitgang bij minder dan een uur bij 37 ° C 9. Een tweede belangrijke beperking van de endotheliale buis is het verlies van myoendothelial knooppunten en hun inherente signalering domeinen die integraal EC functie in de intacte vaatwand 14-16 zijn. Ook moet worden ingezien dat, terwijl langere buizen staat intercellulaire signalering bestudeerd worden over relatief grote afstanden 6, bereiding van buizen ingewikkeld als ze langer worden omdat het moeilijker volledig dissociëren omringende gladde spiercellen en adventitia. We hebben gevonden dat buizen langer dan 1-2 mm zijn ook moeilijker te positioneren en vastzetten in de stromingskamer. Daarentegen, terwijl kortere buizen (bijv. <1 mm) enable Ca2 + en elektrische signalen worden bestudeerd 8, deze moeilijk tijdens superfusieapparaat in de stroom kamer te handhaven. Tenslotte, zelfs met een optimale isolatie van buizen bilateraal, er onvoldoende materiaal voor traditionele kwantificering van eiwitexpressie middels Western blots, maar immunokleuring geeft een index van eiwitexpressie en lokalisatie. Ondanks deze beperkingen, de endotheliale buis vertegenwoordigt een nieuwe voorbereiding gemaakt om nieuwe inzichten in de mechanismen van microvasculaire endotheliale celfunctie in vivo.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
De auteurs danken dr. Pooneh Bagher en Dr Erika Westcott voor redactionele commentaar in de voorbereiding van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health onder award nummers R37-HL041026 en R01-HL086483 aan SSS en F32-HL107050 naar MJS. Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
