Summary
Nous présentons une préparation pour la visualisation et la manipulation de la signalisation calcique dans indigène, intact endothélium microvasculaire. Tubes endothéliales fraîchement isolées des artères de résistance de souris fournissant le muscle squelettique de conserver la morphologie in vivo et la signalisation dynamique au sein et entre les cellules voisines. Tubes endotheliales peuvent être préparés à partir de micro-vaisseaux d'autres tissus et organes.
Abstract
Le contrôle de la circulation sanguine par le système vasculaire de la résistance régule l'apport d'oxygène et de nutriments concomitante avec l'enlèvement des sous-produits métaboliques, comme exemplifié par l'exercice des muscles du squelette. Les cellules endothéliales (ECS) bordent l'intima de tous les vaisseaux de résistance et jouent un rôle clé dans le contrôle de diamètre (par exemple vasodilatation endothélium-dépendante) et, de ce fait, l'ampleur et la répartition de la circulation sanguine des tissus. La régulation de la résistance vasculaire par les EC s'effectue par Ca 2 + intracellulaire signalisation, ce qui conduit à la production de autacoïdes diffusibles (par exemple de l'oxyde nitrique et les métabolites de l'acide arachidonique) 1-3 et 4,5 hyperpolarisation qui provoquent la relaxation en douceur des cellules musculaires. Ainsi comprendre la dynamique de l'endothélium + signalisation Ca 2 est une étape clé vers des mécanismes régissant le contrôle de la circulation sanguine comprendre. Isoler tubes endothéliales élimine les variables confondantes associés à blood dans la lumière du vaisseau et entourant les cellules musculaires lisses et les nerfs périvasculaires qui, autrement, influent sur la structure et la fonction CE. Nous présentons ici l'isolement des tubes endothéliales de l'artère épigastrique supérieure (EES) en utilisant un protocole optimisé pour ce navire.
Pour isoler les tubes endothéliales à partir d'un souris anesthésiée, l'EES est ligaturé in situ pour maintenir le sang dans la lumière du vaisseau (pour faciliter la visualisation pendant la dissection), et la totalité de la feuille de muscle abdominal est excisé. L'EES est disséqué sans entourant les fibres musculaires squelettiques et du tissu conjonctif, le sang est vidé de la lumière, et la digestion enzymatique doux est effectué pour permettre l'enlèvement de adventice, les nerfs et les cellules musculaires lisses à l'aide de trituration douce. Ces préparations fraîchement isolés de l'endothélium intact conservent leur morphologie d'origine, avec le reste individuel EC couplé fonctionnellement à une autre, en mesure de transférer des produits chimiques et électriques SIgnaux intercellulaire par les jonctions communicantes 6,7. En plus de fournir un nouvel éclairage sur la biophysique de signalisation de calcium et de la membrane, ces préparations permettent études moléculaires de l'expression génique et la localisation des protéines dans endothélium microvasculaire natif.
Introduction
Dans ce protocole, nous décrivons l'isolement des tubes de cellules endothéliales de la mer de la souris. L'EES naît de l'artère et fournitures thoracique sang oxygéné interne de la musculature abdominale antérieure. Notre travail avec la mer comme un modèle est attribuable à elle fournir relativement longues, des segments de microvaisseaux non ramifiés qui sont bien adaptées à l'étude des événements de signalisation intercellulaires sous-tendent le rôle de l'endothélium dans la gouvernance et la coordination de relaxation lisse des cellules musculaires. Pour ceux qui s'intéressent à d'autres tissus que le muscle squelettique, nous avons trouvé cette technique pour être facilement adapté pour obtenir des tubes endothéliales de microvaisseaux de cerveau, l'intestin et le système lymphatique.
Les caractéristiques essentielles de ce procédé sont que les longueurs intacts (1-3 mm) de micro-vasculaire endothélium sont isolés, fixés contre une lamelle de verre dans une chambre d'écoulement dans laquelle ils sont perfusées avec PSS, et pour imager Ca 2 + ou de signalisation 7-9empalé pour la signalisation électrique de 6,8. Au sein de la chambre d'écoulement, la moitié supérieure d'un tube est exposé à la solution de surfusion et répond aux interventions expérimentales, tandis que la moitié inférieure (en contact avec la lamelle couvre-objet) est protégé et reste au repos. En plus d'étudier les deux de Ca 2 événements intra-et intercellulaires + signalisation, tubes endotheliales peuvent être utilisées pour la PCR quantitative en temps réel pour évaluer l'expression du gène de 6,10, l'immunohistochimie pour étudier l'expression des protéines de 6,10, et des études électrophysiologiques pour définir les propriétés biophysiques de 6,11 conduction électrique.
Il existe plusieurs avantages à la préparation de tube endothélial pour l'étude de la fonction endothéliale. La première est que le procédé d'isolement fournit un moyen simple de distinguer deux populations de cellules: les cellules endotheliales (qui restent dans la formation du tube) et les cellules musculaires lisses (dissocié individuellement; généralement en forme de "C" quanddétendu). Cela permet un échantillonnage sélectif et l'étude des propriétés uniques qui sous-tendent la contribution de cellules respectives à la fonction des vaisseaux. D'autre part, ce modèle permet la résolution des événements de signalisation intrinsèque à l'endothélium, indépendante de l'influence de l'écoulement du sang, qui entoure le muscle lisse, les nerfs, et le parenchyme. Troisièmement, l'endothélium est étudié tout fraîchement isolée, évitant ainsi des altérations dans l'expression de gène ou de la protéine associée à la culture cellulaire.
Protocol
Une. Préparation de l'équipement: chambre de flux, Pipettes et Solutions
- Couler chambre: utiliser une chambre d'écoulement avec un 24 mm x 50 mm lamelle de verre sur le fond pour les tubes superfuse endothéliales isolées (voir figure 1A). Avant de monter la chambre, se laver les lamelles de verre à la fois avec HCl à 3% et 70% d'éthanol, rincer avec de l'eau ultra-pure, et sécher avec de l'azote gazeux.
- Pipettes: Trois types de pipettes différents sont utilisés au cours du protocole: canule, trituration, et brochage. Tant la canulation et épinglage pipettes peuvent être effectués avant le jour de l'expérience, mais la pipette de trituration doivent être effectuées le jour de car il nécessite la connaissance du diamètre du vaisseau à la taille de la lumière de manière appropriée.
- pipettes de canulation: Pour rincer les globules rouges de la lumière, tirer des tubes capillaires en verre borosilicate aide d'un extracteur micropipette à avoir des extrémités longues, effilées. Cassez les extrémités avec une pince à un diamètre extérieur d'environ 30% less que celle des artères (~ 50-80 um), et le feu à ongles la pointe d'être lisse (voir la figure 1B). Il est utile de également angle des pointes des pipettes à environ 45 °.
- Pipettes de trituration: Pour dissocier mécaniquement les cellules musculaires lisses et l'adventice des tubes endothéliales, faire pipettes trituration à partir de tubes capillaires en verre de borosilicate. Préparer des tubes capillaires comme ci-dessus, et de briser la fin avec une pince. Astuce: Utilisez un dispositif de pointage verre pour le rendre plus facile à briser le mur plus épais du verre trituration de pipette propre. Rompre la pipette au diamètre intérieur déterminé le jour de l'expérience, environ 10 à 20 um plus grand que celui du diamètre extérieur de la cuve à partir de laquelle les tubes endothéliales seront isolés. vernis à feu les extrémités cassées jusqu'à consistance lisse (voir figure 1C).
- Épingler pipettes: Pour stabiliser le tube de l'endothélium dans la chambre d'écoulement, faire épingler pipettes pour garantir la endothéliale tUbe contre le fond de la lamelle de la chambre. Tirer les tubes capillaires de verre de la même manière que les pipettes de canulation. Puis casser les extrémités avec une pince pour un diamètre de ~ 100 um, et le feu à ongles jusqu'à ce que les conseils sont scellés, arrondi et lisse (voir figure 1D). Remarque: Si la pointe de la pipette épinglage n'est pas complètement étanche, le liquide va entrer la lumière et peut brouiller les résultats expérimentaux.
- Solutions: Préparer toutes les solutions à ultra-pure (18,2 MQ) H 2 O et les stériliser à travers un filtre de 0,2 um. Assurez-vous que l'osmolalité des solutions se situe entre 285-300 mOsm. Solutions restent bonnes pour environ deux semaines lorsqu'il est conservé à 4 ° C.
- solution de dissection: La solution de sel utilisé au cours de la dissection de l'artère épigastrique supérieure est composée de (en mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxyéthylpipérazine N'-2-éthanesulfonique ( HEPES), 10 glucose, 0,01 nitroprussiate de sodium (SNP), uned 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) avec un pH de 7,4. Le donneur SNP NO est inclus pour aider à détendre les cellules musculaires lisses, les rendant ainsi plus facile à canuler l'artère et à faciliter l'élimination en douceur des cellules musculaires pendant la trituration.
- solution de dissociation: La solution de sel utilisé au cours de la dissociation du tube endothélial est composé de (en mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 2 CaCl 2, et 0,1% de BSA, avec un pH de 7,4. A une aliquote de 1 ml de ce tampon, ajouter: papaïne 0,62 mg / ml, 1,5 mg / ml de collagénase et 1,0 mg / ml dithioérythritol. Puisque les enzymes provenant de différents fournisseurs peuvent avoir différents niveaux d'activité enzymatique, les numéros de produit de ceux utilisés pour ce travail sont inclus pour référence dans la table des matières. Remarque: Pendant le protocole tant tampon de dissociation et le tampon de dissociation avec des enzymes sont utilisées à différentes étapes.
- solution de surfusion: La solution de sel physiologique (PSS) utilisé pour superfusing tube endothélial isolé est composé de (en mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose et 2 CaCl 2, avec un pH de 7,4.
- Préparation des tampons et des solutions avant de commencer les procédures chirurgicales. Retirez les solutions de 4 ° C et aliquote de 50 ml de tampon de dissection dans un flacon de 200 ml Erlenmeyer et le placer sur la glace. En outre, aliquotes de 50 ml de tampon de dissociation sans enzymes et placez-le sur la paillasse s'équilibrer à la température ambiante. Retirer la solution de surfusion de 4 ° C et le laisser se stabiliser à la température ambiante sur la paillasse.
2. Préparation des animaux
Assurez-vous que toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux sont en accord avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les procédures décrites ici ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université deMissouri.
- Utilisez mâle ou femelle souris au moins 9 semaines et étudier chacun individuellement. Anesthésier une souris avec du pentobarbital sodique (60 mg / kg) par voie intrapéritonéale (ip) par injection. Astuce: La dilution du pentobarbital 10 mg / ml dans une solution saline stérile avant l'injection réduit le risque de surdosage.
- Anesthésie compromet régulation de la température, alors gardez la souris réchauffer immédiatement après la première injection de pentobarbital. L'utilisation d'un support métallique (panier d'aluminium ventilé) sur le dessus d'une plaque de chauffage (calibré à ~ 37 ° C) fonctionne bien pour maintenir la température de la souris stable. Vous pouvez également utiliser une lampe de chaleur, en prenant soin de le positionner à une distance appropriée de la souris. Surveillance de la souris chaque 5-10 min jusqu'à ce que le niveau approprié de l'anesthésie est réalisée (absence de retrait aux pieds ou pincement de la queue). Une dose supplémentaire peut être nécessaire après 15-20 min. Il est préférable de procéder lentement et avec prudence pour éviter un surdosage, en particulier l'obésité, âge, ou d'un animals ailleurs souligné.
- Enlever les poils de la face ventrale par raser soigneusement avec de petites tondeuses pour animaux de compagnie. Une attention particulière doit être prise pour éviter de traumatiser l'animal. Il est utile de retirer tous les poils d'une zone couvrant les aisselles à la région pubienne. Retirez les cheveux vaguement accroché avec une lingette imbibée d'alcool.
- Placez la souris sur le dos, se trouvant à la fois avant et postérieurs membres répartis à exposer autant de la paroi abdominale que possible. Si nécessaire, utilisez du ruban de laboratoire pour fixer les jambes de manière aigle déployé.
3. Isolement de l'artère épigastrique supérieure
- Faire une petite incision à travers la peau juste au-dessus de la surface de la région pubienne. Assurez-vous que seule la peau est réduit tout en évitant d'endommager le muscle abdominal sous-jacent; étendre l'incision latérale dans chaque direction vers postérieurs respectifs. Continuer le long de l'incision rostrale la ligne médiane ventrale vers le haut de la cage thoracique et de l'n prolonger l'incision latérale dans chaque direction pour les membres antérieurs respectifs.
- Soulevez délicatement la peau et utiliser des ciseaux pour couper le tissu conjonctif tenue de la peau au muscle sous-jacent, exposant ainsi toute la surface de la musculature abdominale (voir la figure 3A). Irriguer le muscle exposé à une température ambiante de solution saline à 0,9%.
- En raison de la petite taille de l'EES, positionner l'animal sous une loupe binoculaire pour d'autres procédures. Soulevez le coussinet adipeux situé au bas du sternum avec une pince, et faire une incision à travers elle. Continuer l'incision le long de la nervure inférieure, en veillant à ne pas couper trop profondément dans le tissu sous-jacent. L'EES doit être visible; prendre soin de ne pas l'endommager. Une fois que l'incision est terminée, irriguer le tissu exposé à la température ambiante, une solution saline à 0,9%.
- Après la couche supérieure du muscle squelettique a été retiré, la mer et le muscle sous-jacent sont facilement identifiables. Astuce: Notez la longueur del'EES in vivo avant d'isoler d'étendre tubes endothéliales (qui raccourcissent le long de leur axe sur l'isolement) pour se rapprocher de leur longueur initiale. En utilisant des pinces et ciseaux, exciser soigneusement la couche musculaire mince sous le SEA.
- En utilisant des pinces inclinées, passer d'une longueur de fil de suture en soie 6-0 sous la SEA et ligaturer l'artère et de sa veine adjacente à maintenir sous pression le sang et retenu à l'intérieur de la lumière du vaisseau pour faciliter la visualisation pendant l'isolement et le nettoyage ultérieur.
- Répétez la procédure de ligature de l'EES sur le côté opposé.
- Une fois les deux EES ont été ligaturé, faire une incision le long de la ligne médiane des muscles abdominaux pour séparer les côtés respectifs.
- Elargir l'incision latérale dans chaque direction comme cela se fait pour la peau, puis continuer l'incision verticale le long du bord externe de séparer complètement le muscle abdominal de l'organisme. Éviter d'endommager le système vasculaire alimenté par la mer pour maintenir la lumière sous pression.
- Cut le SEA-dessus de la ligature pour maintenir l'étanchéité, et placer le muscle et l'artère isolée dans un bécher de 50 ml contenant 10 ml de 4 ° C tampon de dissection.
- Répéter la procédure pour l'autre côté de l'abdomen et incuber les tissus dans le tampon de dissection pendant 10 min.
- Placez le muscle abdominal contenant le SEA dans un (4 ° C) tampon de dissection de la chambre de dissection contenant réfrigéré (voir la figure 3B). La chambre de dissection se compose d'une boîte de Petri avec une couche de Sylgard (polydiméthylsiloxane [PDMS]) en bas.
- Utilisant des broches d'insectes (0,15 mm), étirer le SEA isolé et muscle abdominal à se rapprocher longueurs in vivo (mentionnés ci-dessus) et le fixer à la Sylgard. Astuce: Orienter le muscle tels que la couche mince face à la péritoine est sur le dessus fait l'EES facilement visible à l'aide transillumination.
- Utilisant des instruments de microdissection fines et de travailler à partir du site en amont de la ligature vers l'extrémité aval, désactivez la mer depuis son veine jumelé et le tissu environnant jusqu'à ce que le premier site de la branche principale (1-2 cm). Puis exciser le SEA en coupant juste au-dessus du site de succursale et juste en dessous de la ligature.
- Pour éliminer le sang conservé dans la lumière du vaisseau, canuler l'EES et le rincer avec du tampon de glace de dissection froide. L'utilisation d'un morceau de tube silastic, attacher l'extrémité arrière d'une pipette de cathétérisme pour une seringue de 5 ml contenant un tampon de dissection glacée et sécuriser la micropipette dans un micromanipulateur pour placer sa pointe dans la chambre de dissection à canuler l'EES.
- Une fois toutes les érythrocytes sont évacuées, enlever la mer de la pipette de cathétérisme, et soulever la pipette sur le plat de dissection.
- Couper le SEA en segments plus petits chaque 1-3 mm de longueur. Ces segments plus courts de faciliter l'isolement des tubes endothéliales.
4. Isolement du tube endothélial
- Remplissez un culte 12 mm x 75 mm de verretube ure à mi-chemin avec un tampon de dissection glacée. En utilisant des pinces angulaires, transférer les morceaux artérielles dans le tube de la culture et de placer sur la glace. A ce moment, combiner les enzymes de digestion avec du tampon de dissociation à un volume final de 1 ml dans un tube de culture de 12 mm x 75 mm à part (voir 1.3.2 Solutions) et préchauffer la solution à 37 ° C avec un bloc de chauffage.
- Alors que le tampon de dissociation et les enzymes se réchauffent, aspirer soigneusement le tampon de dissection du tube de culture en laissant un petit volume contenant les segments de vaisseaux.
- Ajouter délicatement la chambre tampon de dissociation de température sans enzymes pour laver tampon de dissection restant. Astuce: Ajoutez le tampon de dissociation lente tels que les pièces artérielles restent sur le fond du tube de culture pour gagner du temps d'attente pour eux de se réinstaller. Augmenter la température des tampons au cours des étapes multiples à partir de glace (4 ° C), à température ambiante (~ 24 ° C), à 37 ° C afin de minimiser le choc.
- Aspirer soigneusement le dissociation tampon du tube de culture, de nouveau en étant sûr de laisser un petit volume contenant les segments de vaisseaux.
- Retirer le tampon de dissociation de préchauffage avec des enzymes à partir du bloc de chauffage, le transfert de 1 ml de solution d'enzyme dans le tube de culture contenant les segments de vaisseaux, et de placer le tube de culture en arrière dans le bloc de chauffage. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Au cours de l'incubation avec des enzymes, de préparer la pipette de trituration, de remblayer avec de l'huile minérale et le fixer sur une microseringue qui est monté dans un micromanipulateur. Puis rentrer le piston microseringue à remplir la pipette avec 2 nl de tampon de dissociation et positionner la pointe de la pipette sur la chambre d'écoulement.
- A la fin de l'incubation de 30 min, retirer le tube de culture à partir du bloc de chauffage et soigneusement aspirer le tampon que ci-dessus.
- Laver les segments artériels avec 4 ml de tampon de dissociation de la température ambiante. Remarque: Il n'est plus nécessaire de maintenir la segm de navireents dans le bas du tube de culture; déranger les pièces artérielles permet effectivement d'assurer que les enzymes résiduels sont éliminés efficacement.
- Transférer un segment de vaisseau à la chambre d'écoulement en aspirant doucement avec une micropipette de 1 ml, et le placer dans la chambre d'écoulement avec 1 ml de tampon de dissociation.
- En utilisant le micromanipulateur contenant la microseringue, positionner la pointe de la pipette d'une trituration à proximité d'une extrémité du segment de vaisseau.
- Aspirer le segment de vaisseau (500 nl retiré) dans la pipette trituration lentement (225 nl / sec), de manière à ne pas provoquer une déformation mécanique à l'EC, puis l'éjecter dans la chambre arrière. Si la digestion a été un succès, les cellules et l'adventice des muscles lisses seront dissociées du tube endothélial.
- Répéter la trituration jusqu'à ce que toutes les cellules musculaires lisses sont dissociés. Soyez conscient que la trituration excessive (4x ou plus) peut endommager l'EC et de les rendre insensibles aux agonistes. Astuce:aide de la pipette de trituration, déplacer l'adventice loin du tube endothélial dès que possible pour l'empêcher de l'enchevêtrement du tube. Remarque: En utilisant la pipette de trituration, le tube endothélial isolé peut être aspiré et transféré dans une chambre séparée.
- Positionner le tube endothélial dans le centre de la chambre d'écoulement, orienté selon la direction de l'écoulement, et enlever la pipette trituration.
- Sécurisés 'ancrage des pipettes en micro-manipulateurs montés à chaque extrémité de la chambre d'écoulement, et positionnent leurs conseils aux extrémités respectives du tube endothélial.
- Abaisser la pipette épinglant sur une extrémité du tube pour le presser contre le fond de la chambre. Positionner la deuxième pipette de piégeage de la même façon à l'extrémité opposée du tube. Remarque: Le placement des pipettes 'ancrage est un compromis entre la fixation du tube (en les plaçant loin de la fin du tube) et permettant une plus grande image / zone expérimentale (en les plaçant près de l'extrémité du tube). Localisation tourlet ~ 50 um à partir de chaque extrémité du tube fonctionne bien. Tout comme la pipette épinglant touche le tube, retirer lentement le long de l'axe du tube, étendant ainsi à rapprocher longueur in vivo, puis appuyez sur la pipette contre le fond de la chambre à fixer le tube.
- Commencez l'écoulement de la solution de surfusion, et laisser le tube de l'endothélium se reposer pendant au moins 20 min à s'équilibrer et adhérer (voir la figure 3C). Utiliser une pompe péristaltique pour maintenir le débit de fluide constant (de surfusion) à travers le tube endothélial. Remarque: pipettes épinglage peuvent être retirés une fois que le tube de l'endothélium a adhéré à la partie inférieure de la chambre d'écoulement (~ 25 min) ou laissé en place pour assurer le tube endothélial ne devient pas délogé.
5. Dye Chargement en cours et Imagerie calcique
- Pour visualiser les réponses intracellulaires de calcium, de charger le tube de l'endothélium avec fluo-quatre heures colorant à la température ambiante (~ 24 ° C). Arrêter l'écoulement du fluide dans le bain, et ajouter fluo-4AM de la chambre à une concentration finale de 10 uM. Attendre 10 min à permettre au colorant de pénétrer dans les cellules, puis superfuse le tube endothélial avec PSS fraîche pendant 20 minutes pour assurer colorant extracellulaire est retiré et que le colorant intracellulaire a été complètement dé-estérifiée.
- Effectuer imagerie calcique. Pour ce travail, un microscope droit (voir la figure 2) équipé d'un système d'imagerie confocale à disque rotatif a été utilisé à la température ambiante. Exciter le colorant fluorescent de calcium avec un laser 491 nm et acquérir des images (à 500-550 nm émission) à l'aide d'une caméra numérique intensifiée.
Representative Results
réponses de calcium peuvent être engagées dans des tubes endothéliales fraîchement isolées à l'aide de l'acétylcholine (ACH). Dans ce film, un tube endothélial chargé avec 10 uM fluo-quatre heures est stimulé par surfusion de 1 uM ACh (film 1). Cliquez ici pour voir le film . Le colorant est excité à 491 nm et l'émission est enregistrée 500-550 nm en utilisant un appareil photo de dispositif à couplage de charge intensifiée. piles d'images sont acquises à 120 images / sec pour une période de 25 secondes et peut ensuite calculer la moyenne (par exemple à 40 images / sec). Représentatifs des images de fluorescence au cours du temps sont représentées sur la figure 4.
Figure 1. Couler chambre pipettes et utilisées au cours de l'isolement des tubes endothéliales. A) La chambre de flux assemblé avec un 24 mm x 50 mm lamelle de verre comme base. B) Exemples de tiré (à gauche) et un tiré, cassé, poli et angle (à droite) canulation pipette. Cette pipette est utilisée pour rincer les érythrocytes à partir de la lumière de l'artère suite à dissection. Barre d'échelle = 200 um. C) Exemples de tiré (à gauche) et un tiré, cassée et polie (à droite) trituration pipette. Le diamètre intérieur de cette pipette est déterminé par le diamètre extérieur de l'artère. Barre d'échelle = 200 um. D) Exemples de tiré (à gauche) et une pipette droite) épinglant tiré, cassée et polie (. La pointe de cette pipette est arrondi et complètement étanche à fixer le tube de l'endothélium dans la chambre d'écoulement. Barre d'échelle = 200 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Spinning disque microscope confocal pour l'imagerie de Ca 2 + signaux. A) Microscope droit utilisé pour l'imagerie de calcium. B) (a) de l'unité de disque en rotation confocale avec un (b) l'intensification caméra à dispositif à couplage de charge. C) Les objectifs à immersion (a) 63X ( NA = 1) et (b) 20X (NA = 0,5) utilisé pour l'imagerie. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Isolement de la musculature abdominale et de l'artère épigastrique supérieure. A (c'est à dire où les navires doivent être ligaturées). Barre d'échelle = 1 cm. B) muscle isolé abdominale (unilatérale) et SEA épinglé dans une chambre de dissection pour microdissection. La flèche rouge indique le premier grand site de bifurcation de la mer (c'est à dire le moment où le nettoyage de la cuve est à l'arrêt). Barre d'échelle = 1 cm. C) isolé tube de cellules endothéliales de l'EES. Image de contraste d'interférence différentielle d'un tube endothelial suivant une heure d'incubation à la température ambiante. Le tube de l'endothélium a été superfusée superfusion avec du tampon à 3 ml / min. Barre d'échelle = 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. fluorescence de calcium dans un tube de cellules endotheliales. Images fluorescentes représentatives d'un tube endothelial en réponse à une stimulation avec 1 pM de l'acétylcholine. A) Fluorescence avant la stimulation. B) de la fluorescence du tube endothélial au moment de l'administration de l'acétylcholine, t = 0 sec. C) la fluorescence du tube endothélial à t = 5 sec. D) le tube endothélial fluorescence à t = 10 s. E) endothéliale fluorescence du tube à t = 15 s. F) endothéliale de fluorescence du tube à t = 20 sec. Barres d'échelle = 40 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Discussion
Nous décrivons ici l'isolement des tubes endothéliales de la mer et de l'utilisation de cette préparation de visualiser Ca 2 + événements de signalisation dans son constitutive EC. Cette procédure a été adapté à partir de celui initialement mis au point pour isoler tubes endothéliales de artérioles du muscle crémaster hamster 8. Utilisant des variations mineures des techniques présentées ici, nous avons isolé tubes endothéliales à partir d'une variété de lits vasculaires, y compris: les artères d'alimentation du muscle hamster enrouleur et joue artérioles de la poche 10, la souris supérieure artère épigastrique 6,7,9, mésentériques de souris et cérébrale les artères et les microvaisseaux lymphatiques (observations non publiées; références sont inclus pour isoler les vaisseaux mésentériques 12 et 13 vaisseaux cérébraux). Isoler tubes endothéliales de nouveaux lits vasculaires peut exiger des modifications au protocole original. Si l'isolement est infructueuse, il est préférable de commencer par modifier les temps de digestion:Augmenter le temps de digestion si tubes endothéliales sont difficiles à isoler des cellules et l'adventice musculaires lisses et réduire le temps de digestion si le tube de l'endothélium ne reste pas intact. Si la modification des temps de digestion est infructueuse, l'ajustement de la concentration des enzymes de la digestion ou de la température de digestion doit être jugé. Une autre option consiste à réduire le diamètre intérieur de la pipette de trituration, ce qui augmente la force de cisaillement dans l'élimination des cellules musculaires lisses. L'augmentation de la vitesse d'éjection de fluide peut également être jugé pour le même effet, mais est plus susceptible d'endommager la préparation. Il convient de reconnaître qu'il peut ne pas être possible d'isoler des tubes endothéliales intactes à partir de navires, dans lequel les cellules endothéliales sont pas ainsi reliés les uns aux autres par des protéines de jonction.
La dissociation des cellules des muscles lisses après une digestion enzymatique a été initialement réalisée à l'aide d'une pipette à main de type 8. Nous avons affiné la procédure de trituration en utilisant un microsyrsystème Inge, qui a permis l'isolement cohérente des tubes endothéliales plus (jusqu'à 3 mm) 6. Lors de l'utilisation de ce système, la pipette de trituration est rempli à nouveau avec de l'huile minérale pour fournir une colonne de fluide continu entre le piston commandant le mouvement de fluide et PSS contenant le segment de vaisseau. L'incompressibilité du fluide en même temps que la force d'entraînement constante du résultat de la microseringue de piston en cisaillement constante lorsque le récipient est forcé à travers l'embout de pipette. En revanche, les techniques de main souvent utilisés pour des cellules de dissociation (par exemple en serrant poire en caoutchouc à l'extrémité d'une pipette Pasteur) implique la compression d'air, ce qui introduit des variations dans la pression d'entraînement et, de ce fait, de cisaillement exercée sur la pointe de pipette.
Il ya plusieurs avantages à la préparation du tube pour l'étude de la fonction endothéliale dans les microvaisseaux. La première est que le processus d'isolement fournit populations distinctes homogènes indigènes cellulaires d'ECS et mu lissecellules SCLE. Depuis le EC restent physiquement connecté sous forme de tubes, ils sont distincts des cellules musculaires lisses individuelles, qui conservent une configuration "C" si elles restent détendus pendant trituration. Types cellulaires ainsi respectives se distinguent facilement, par exemple lors de l'obtention des échantillons pour les techniques moléculaires telles que PCR en temps réel et immunohistochimie 10. Depuis plusieurs tubes sont isolés à partir d'un seul navire (ou de navires bilatéraux comme pour le SEA), les données moléculaires et les données fonctionnelles peuvent être obtenus à partir des mêmes navires d'un animal donné. Ainsi, l'expression moléculaire peut être corrélée avec le comportement fonctionnel de l'endothélium microvasculaire. En outre, des événements de signalisation à la fois intra-et intercellulaires intrinsèques à micro-vasculaire endothélium peuvent être réglés indépendamment de l'influence des forces hémodynamiques (pression, débit), des agents vasoactifs transportées dans la circulation sanguine (par exemple les hormones), ou à partir entourant les cellules musculaires lisses (par exemple,60; par couplage myoendothelial 14-16), 17 des nerfs, ou parenchyme de tissu 18.
Surtout, étant donné que l'endothélium est fraîchement isolées à partir de micro-vaisseaux désignés, il n'y a pas d'altération du phénotype qui est par ailleurs associée à la mise en culture de 19 à 21 EC. Par exemple, EC cultivées perdent expression des récepteurs muscariniques et modifient ainsi leurs profils de signalisation de calcium. En outre, les propriétés électrophysiologiques des EC peuvent changer dans la culture 22. Parce que les EC individuelles restent couplés par des canaux de jonction écart fonctionnels, le tube endothélial présente un modèle idéal pour l'étude de la conduction de signaux électriques 2 + et Ca 6,7 entre les cellules. Il convient également de reconnaître que les cellules de muscles lisses dissociées sont facilement étudiées par des techniques de patch-clamp pour des données complémentaires sous-jacents fonction microvasculaire 23.
Une limite importante au tube de l'endothélium modèle est l'instabilité de la préparation avec une température croissante. Alors que les préparatifs de la mer ont prouvé stable et en bonne santé à la température ambiante (~ 24 ° C) et pendant plusieurs heures à 32 ° C, la dégradation morphologique et fonctionnelle se produit en moins d'une heure à 37 ° C 9. Une seconde limitation importante du tube endothélial est la perte de jonctions myoendothelial et leurs domaines de signalisation inhérentes qui font partie intégrante de la fonction CE dans la paroi du vaisseau intact de 14 à 16. Il faut aussi reconnaître que, bien que des tubes plus longs permettent signalisation intercellulaire être étudié sur des distances relativement grandes 6, la préparation de tubes est compliqué car ils deviennent plus car il devient plus difficile de dissocier complètement entourant les cellules musculaires lisses et l'adventice. Nous avons constaté que les tubes de plus de 2.1 mm sont également plus difficiles à positionner et à fixer dans la chambre d'écoulement. En revanche, si des tubes plus courts (par exemple <1 mm) enable de Ca 2 + et des signaux électriques à étudier 8, ils sont difficiles à maintenir au cours de surfusion dans la chambre d'écoulement. Enfin, même avec une isolation optimale des tubes bilatéralement, manque de matière, pour la quantification traditionnel de l'expression des protéines en utilisant des Western blots, bien immunomarquage fournit un indice de l'expression de protéine et la localisation. Malgré ces limites, le tube de l'endothélium représente une nouvelle préparation pour fournir un nouvel éclairage sur les mécanismes de la fonction des cellules endothéliales microvasculaires in vivo.
Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Pooneh Bagher et le Dr Erika Westcott pour les éditoriaux dans la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung and Blood Institute des National Institutes of Health, sous les numéros d'attribution R37-HL041026 et R01-HL086483 de SSS et F32-HL107050 à MJS. Ce contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
