Summary
Wir präsentieren eine Vorbereitung für die Visualisierung und Manipulation von Calcium-Signal in nativer, intakte mikrovaskulären Endothel. Endothelial Rohre frisch aus Maus Widerstand Arterien Skelettmuskel in vivo behalten Morphologie und dynamische Signalisierung innerhalb und zwischen benachbarten Zellen isoliert. Endothelzellen Rohre können aus Mikrogefäßen anderer Gewebe und Organe hergestellt werden.
Abstract
Die Steuerung des Blutflusses durch den Widerstand Gefäß regelt die Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen, gleichzeitig mit der Entfernung von Stoffwechselprodukten, wie durch die Ausübung Skelettmuskel veranschaulicht. Endothelzellen (ECs) säumen die Intima aller Widerstandsgefäße dienen und eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Durchmesser (zB Endothel-abhängige Vasodilatation) und damit die Größe und Verteilung der Gewebedurchblutung. Die Regulierung der Gefäßwiderstand durch ECs wird durch intrazelluläre Ca 2 +-Signalisierung, die die Produktion von diffusionsfähigen Autacoide (z. B. Stickstoffmonoxid und Arachidonsäure-Metaboliten) führt 1-3 und Hyperpolarisation bewirkt 4,5, die Entspannung der glatten Muskelzellen zu entlocken. So das Verständnis der Dynamik der endothelialen Ca 2 +-Signal ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis Mechanismen, die Blutflusskontrolle. Isolieren von endothelialen Rohre beseitigt Störvariablen mit bl verbundenenOOD im Gefäßlumen und mit umgebenden glatten Muskelzellen und perivaskuläre Nerven, die sonst EG Struktur und Funktion zu beeinflussen. Hier präsentieren wir die Isolierung von Endothel-Rohre von der A. epigastrica superior (SEA) mit einem Protokoll für dieses Schiff optimiert.
Um endothelialen Rohre von einer narkotisierten Maus zu isolieren, wird die SEA in situ ligiert, um Blut in das Gefäßlumen zu halten (zur Erleichterung bei der Präparation visualisieren), und das gesamte Blatt Bauchmuskel wird ausgeschnitten. Das Meer ist frei von umgebenden Skelettmuskulatur und Bindegewebe seziert, wird Blut aus dem Lumen gespült und milde enzymatische Verdauung wird durchgeführt, um die Entfernung der Adventitia, Nerven und Zellen der glatten Muskulatur mit sanften Verreiben zu ermöglichen. Diese frisch isoliert Vorbereitungen von intakten Endothel behalten ihre Mutter Morphologie, mit individuellen ECs bleibt funktionell miteinander gekoppelt sind, in der Lage, chemische und elektrische si übertragengnale interzellulär durch gap junctions 6,7. Neben der Bereitstellung von neuen Einblick in Calcium-Signal-und Membranbiophysik, diese Präparate ermöglichen molekulare Untersuchungen der Genexpression und Proteinlokalisierung in nativen mikrovaskulären Endothel.
Introduction
In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung von Endothelzellen Rohre von der Maus SEA. Die SEA ergibt sich aus der Brustwandarterie und liefert sauerstoffreiches Blut in der vorderen Bauchmuskulatur. Unsere Zusammenarbeit mit der SEA als Modell ist auf die Bereitstellung es relativ lange, unverzweigte Mikrogefäßsegmente, die für das Studium interzellulären Signalwege, die Rolle des Endothels bei der Steuerung und Koordination der Muskelzelle Entspannung der glatten zugrunde liegenden gut geeignet sind. Für diejenigen, die an anderen als Skelettmuskel Gewebe haben wir diese Technik, um ohne weiteres für den Erhalt von endothelialen Rohre von Mikrogefäße von Gehirn-, Darm und das lymphatische System angepasst werden gefunden.
Die wesentlichen Merkmale dieser Methode sind, dass intakte Längen (1-3 mm) der mikrovaskulären Endothel isoliert, vor einem Deckglas in einer Durchflusskammer, in der sie mit PSS strömt gesichert, und für die Ca 2 + Signal abgebildet 7-9 oderfür die elektrische Anzeige 6,8 aufgespießt. Innerhalb der Durchflusskammer, ist die obere Hälfte eines Rohres zum Superfusionslösung ausgesetzt und reagiert auf experimentelle Eingriffe, während die untere Hälfte (in Kontakt mit dem Deckglas) wird geschützt und bleibt ruhig. Neben dem Studium sowohl intra-und interzellulären Ca 2 + Signal Veranstaltungen können Endothelzellen Rohre für die quantitative Echtzeit-PCR verwendet werden, um die Genexpression 6,10, Immunhistochemie bewerten, um die Proteinexpression 6,10 untersuchen und elektrophysiologische Untersuchungen zur biophysikalischen Eigenschaften definieren der elektrische Leitungs 6,11.
Es gibt mehrere Vorteile für die endotheliale Rohrvorbereitung für das Studium der endothelialen Funktion. Zunächst erhält der Isolationsprozess bietet eine einfache Unterscheidung zwischen zwei Zellpopulationen: Endothelzellen (die Röhrenbildung bleiben) und glatten Muskelzellen (einzeln dissoziiert; normalerweise "C"-förmig ist, wennentspannt). Dies ermöglicht eine gezielte Probenahme und Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften Beitrag jeweiligen Zellen auf Gefäßfunktion zugrunde liegen. Zweitens, dieses Modell ermöglicht die Auflösung der Signalereignisse Eigen an das Endothel, unabhängig vom Einfluss des Blutflusses, die umliegenden glatten Muskulatur, Nerven und Parenchym. Drittens wird das Endothel untersucht, während frisch isolierten, wodurch jedoch Veränderungen in der Gen-oder Protein-Expression mit der Zellkultur.
Protocol
1. Vorbereitung der Ausrüstung: Flusskammer, Pipetten und Lösungen
- Flusskammer: Verwenden Sie eine Strömungskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas auf dem Boden, die isolierten Endothelzellen Rohre (siehe Abbildung 1A) superfuse. Vor der Montage der Kammer, waschen Sie die Deckgläser mit beiden 3% HCl und 70% Ethanol gründlich mit Reinstwasser und trocken mit Stickstoffgas.
- Pipetten: Drei verschiedene Arten von Pipetten werden in der Protokoll: Zugänge, Zerreiben und Pinning. Sowohl der Kanülierung und Pinning Pipetten vor dem Tag des Experiments werden, aber das Verreiben Pipette sollte der Tag, wie es die Kenntnis der Durchmesser des Behälters erfordert, um die Größe des Lumens geeignet gemacht werden.
- Kanülierung Pipetten: Um rote Blutzellen aus dem Lumen spülen, Borosilikatglas Kapillaren mit einer Mikropipette Puller, lange, sich verjüngende Enden zu ziehen. Brechen die Enden mit einer Pinzette an einem Außendurchmesser ca. 30% less als die der Arterien (~ 50-80 um), und Feuerpolitur die Spitze glatt zu sein (siehe Abbildung 1B). Es ist hilfreich, auch Winkel der Spitzen der Pipetten auf etwa 45 °.
- Verreiben Pipetten: Um mechanisch distanzieren die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von den Endothelzellen Rohre, stellen Verreiben Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren. Bereiten Kapillaren, wie oben, und brechen Sie das Ende mit einer Pinzette. Tipp: Verwenden Sie ein Glas Scoring-Gerät zu erleichtern, um die dickere Wand der Glaspipette Verreiben sauber brechen. Brechen die Pipette an den Innendurchmesser am Tag des Experiments etwa 10-20 um größer als die des äußeren Durchmessers des Gefäßes aus dem Endothel-Röhrchen isoliert werden bestimmt. Feuerpolitur die Bruchenden bis glatt (siehe Abbildung 1C).
- Pinning Pipetten: Zur Stabilisierung der endothelialen Rohr innerhalb der Durchflusskammer, stellen Pinning Pipetten, um die endotheliale t sichernUBE gegen das Deckglas Boden der Kammer. Ziehen Glaskapillaren in der gleichen Weise wie die Kanülierung Pipetten. Dann brechen die Enden mit einer Zange zu einem Durchmesser von ~ 100 um, und Feuerpolitur bis die Spitzen versiegelt sind, rund und glatt (siehe Abbildung 1D). Hinweis: Wenn die Spitze des Pinning Pipette nicht vollständig abgedichtet ist, wird Flüssigkeit in das Lumen eingeben kann und auch experimentelle Ergebnisse zu verwechseln.
- Lösungen: Alle Lösungen in hochreinem (18,2 M &OHgr;) H 2 O und sterilisieren durch einen 0,2 &mgr; m Filter. Stellen Sie sicher, die Osmolalität der Lösungen liegt zwischen 285-300 mOsm. Lösungen gut bleiben für etwa zwei Wochen bei 4 ° C gelagert
- Dissection Lösung: Die bei der Präparation der A. epigastrica superior verwendet Salzlösung wird von (in mmol / L) zusammen: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-Hydroxyethyl-N'-2-ethansulfonsäure ( HEPES), 10 Glucose, 0,01 Natriumnitroprussid (SNP), eind 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) mit einem pH-Wert von 7,4. Der NO-Donor SNP ist eingeschlossen, um zu entspannen glatten Muskelzellen, wodurch sie leichter, um die Arterie kanülieren und glatte Muskelzelle Entfernung während Verreiben erleichtern.
- Dissoziation Lösung: Das bei der Spaltung des endothelialer Gefäße verwendet Salzlösung von (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose, 2 CaCl 2 und 0,1% BSA, mit ein pH-Wert von 7,4. In ein 1 ml-Aliquot dieser Puffer hinzuzufügen: 0,62 mg / ml Papain, 1,5 mg / ml Kollagenase und 1,0 mg / ml Dithioerythritol. Da Enzyme, die von verschiedenen Lieferanten unterschiedlichem enzymatische Aktivität haben, sind die Produktnummern der für diese Arbeit verwendet als Referenz in der Tabelle von Materialien enthalten. Hinweis: Während der Protokoll sowohl Dissoziationspuffer und Dissoziationspuffer mit Enzymen an verschiedenen Schritten verwendet.
- Superfusion Lösung: Die physiologische Salzlösung (PSS) für superfusin verwendetg der isolierten Endothelzellen Rohr aus (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 2 CaCl 2, mit einem pH-Wert von 7,4.
- Bereiten Puffer und Lösungen vor Beginn der chirurgischen Eingriffen. Entfernen Sie die Lösungen von 4 ° C und 50 ml Aliquot Dissection Puffer in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben und legen Sie es auf Eis. Zusätzlich aliquote 50 ml Dissoziationspuffer ohne Enzyme und auf der Tischplatte auf Raumtemperatur kommen. Entfernen Sie die Superfusionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur auf der Bank oben ins Gleichgewicht.
2. Vorbereitung der Tiere
Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren und Protokolle mit Tieren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität bestätigtMissouri.
- Verwenden männlichen oder weiblichen Mäusen mindestens 9 Wochen alt und studieren jeweils einzeln. Betäuben eine Maus mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Spitze: Verdünnen der Pentobarbital 10 mg / ml in steriler Kochsalzlösung vor der Injektion verringert die Möglichkeit einer Überdosierung.
- Anästhesie beeinträchtigt Temperaturregelung, so halten Sie die Maus erwärmen unmittelbar nach der ersten Injektion von Pentobarbital. Mit einem Metallträger (belüftet Aluminium-Korb) auf einer Heizplatte (auf ~ 37 ° C kalibriert) funktioniert gut, um die Temperatur der Maus stabil zu halten. Alternativ können Sie auch eine Wärmelampe, kümmert sich um sie in einem angemessenen Abstand von der Maus zu positionieren. Überwachen Sie die Maus alle 5-10 Minuten, bis die entsprechende Ebene der Narkose erreicht ist (Mangel an Rücktritt bis Fuß oder Schwanz Prise). Nach 15-20 min kann eine Zusatzdosis erforderlich sein. Am besten ist es, langsam und mit Vorsicht vorgehen, um Überdosierung zu vermeiden, vor allem bei übergewichtigen, gealtert, oder Tiers anders betont.
- Entfernen Sie die Haare von der Bauchseite nach der Rasur sorgfältig mit kleinen Tierhaarschneidemaschinen. Besondere Aufmerksamkeit sollte getroffen werden, um ein Trauma des Tieres zu vermeiden. Es ist hilfreich, alle Haare aus einem Gebiet stammen aus den Achselhöhlen bis zum Schambereich zu entfernen. Entfernen Sie lose anhaftende Haare mit einem frischen Alkoholtupfer.
- Positionieren Sie die Maus auf den Rücken, wobei sowohl Vorder-und Hinterbeine verteilt, so viel von der Bauchwand wie möglich aussetzen liegt. Falls erforderlich, verwenden Labor Klebeband, um die Beine in einem Spread-Eagle Weise zu sichern.
3. Die Isolierung der A. epigastrica superior
- Einen kleinen Einschnitt durch die Haut unmittelbar über dem Bereich der Schamgegend. Stellen Sie sicher, dass nur die Haut wird geschnitten, während Vermeidung von Schäden an der zugrunde liegenden Bauchmuskeln, erweitern den Schnitt seitlich in jede Richtung aus, um entsprechende Hinterbeine. Weiterhin den Einschnitt rostral entlang der ventralen Mittellinie auf der Oberseite des Brustkorbs und dern verlängern den Schnitt seitlich in jede Richtung zu den jeweiligen Vorderbeine.
- Heben Sie die Haut und mit einer Schere durchtrennen das Bindegewebe hält die Haut an die darunter liegende Muskulatur, wodurch die gesamte Oberfläche der Bauchmuskulatur ausgesetzt (siehe Abbildung 3A). Spülen Sie die freiliegende Muskel mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung.
- Aufgrund der geringen Größe der SEA, positionieren Sie das Tier unter einem Stereomikroskop für weitere Verfahren. Heben Sie die Fettpolster an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette entfernt und einen Einschnitt durch. Setzen Sie den Schnitt entlang der unteren Rippe, dabei nicht zu tief in das darunter liegende Gewebe zu schneiden. Die SEA sollte sichtbar sein, darauf achten, nicht zu beschädigen. Nachdem der Schnitt fertig ist, bewässern die freiliegende Gewebe mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung.
- Nachdem die oberste Schicht der Skelettmuskulatur eingefahren hat, sind das Meer und die darunter liegende Muskulatur leicht zu erkennen. Tipp: Beachten Sie die Länge derdie SEA in vivo vor Isolierung zu endothelialen Rohre (die sich entlang ihrer Achse nach der Isolierung zu verkürzen) sich auf ihre ursprüngliche Länge nähern. Mit einer Pinzette und Schere, auszuschneiden sorgfältig die dünne Muskelschicht unter der SEA.
- Mit abgewinkelten Pinzette, passieren eine Länge von 6-0 Seidenfaden unter der SEA und Ligation der Arterie und den angrenzenden Vene, um es unter Druck und Blut in das Gefäßlumen zurückgehalten, um die Visualisierung während der nachfolgenden Isolierung und Reinigung zu erleichtern halten.
- Wiederholen Sie den Vorgang SEA-Ligation auf der kontralateralen Seite.
- Sobald beide SUP wurden ligiert, einen Einschnitt entlang der Mittellinie der Bauchmuskulatur zu den jeweiligen Seiten zu trennen.
- Erweitern der Einschnitt seitlich in jede Richtung, wie für die Haut durchgeführt, dann weiter der Schnitt vertikal entlang der Außenkante, um die Bauchmuskeln vollständig getrennt von dem Körper. Schäden an Gefäßen von der SEA zugeführt, um den Druck aufrecht zu erhalten Lumen vermeiden.
- Cut die SEA über der Ligation, um das Siegel zu erhalten, und legen Sie den isolierten Muskel und Arterie in einem 50 ml-Becherglas mit 10 ml 4 ° C Dissektion Puffer.
- Vorgang für die andere Seite des Bauches und Inkubation der Gewebe in der Präparation Puffer für 10 min.
- Legen Sie die Bauchmuskulatur, die die SEA in einem gekühlten (4 ° C) Präparation Kammer, die Dissektion Puffer (siehe Abbildung 3B). Die Präparation Kammer aus einer Petrischale mit einer Schicht aus Sylgard (Polydimethylsiloxan [PDMS]) an der Unterseite.
- Mit Insektenstifte (0,15 mm), strecken die isoliert SEA-und Bauchmuskel aus, um in vivo Längen (siehe oben) annähernd und befestigen Sie sie am Sylgard. Tipp: Orientieren den Muskel, so dass die dünne Schicht mit Blick auf das Bauchfell ist oben macht mit Durchleuchtung der SEA gut sichtbar.
- Mit Hilfe feiner Mikrodissektion Instrumente und Arbeits von der stromaufwärts Ligationsstelle in Richtung derstromabwärts gelegenen Ende, deaktivieren Sie das Meer von seiner gepaart Vene und dem umgebenden Gewebe, bis der erste große Zweigstelle (1-2 cm). Dann auszuschneiden die SEA, indem es direkt über der Zweigstelle und knapp unterhalb der Ligation.
- Um Blut in das Gefäßlumen beibehalten entfernen, kanülieren das Meer und spülen Sie es mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit einem Stück Silasticschlauch, befestigen Sie das hintere Ende einer Kanülisier Pipette auf eine 5 ml Spritze mit eiskaltem Puffer Dissektion und sichern die Mikropipette in einem Mikromanipulator zu ihrer Spitze innerhalb der Dissektion Kammer zu positionieren, um die SEA kanülieren.
- Sobald alle Erythrozyten werden ausgespült, entfernen Sie das Meer von der Kanülierung Pipette, und heben Sie die Pipette aus der Dissektion Gericht.
- Schneiden Sie die SEA in kleinere Segmente jeweils 1-3 mm in der Länge. Diese kürzere Segmente ermöglichen die Isolierung von Endothelzellen Röhren.
4. Isolierung des Endothelrohr
- Füllen Sie eine 12 mm x 75 mm Glas KultAbbildung Rohr halb mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit abgewinkelten Pinzette, übertragen Sie die Arterienstücke in die Kulturröhrchen und legen auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt verbinden die Verdauungsenzyme mit Dissoziationspuffers auf ein Endvolumen von 1 ml in einem separaten 12 mm x 75 mm Kulturröhrchen (siehe 1.3.2 Solutions) vorzuwärmen und die Lösung auf 37 ° C mit einem Heizblock.
- Während die Dissoziation Puffer und Enzyme werden aufgewärmt, sorgfältig absaugen Dissektion Puffer aus dem Kulturröhrchen so dass eine kleine Band mit den Gefäßsegmente.
- Hinzufügen vorsichtig Raumtemperatur Dissoziationspuffer ohne Enzyme abzuwaschen restlichen Dissektion Puffer. Tipp: Fügen Sie die Dissoziation Puffer langsam, so dass die Arterienstücke bleiben auf dem Boden der Kulturrohr um Zeit zu sparen warten, bis sie umzusiedeln. Heben die Puffer Temperaturen über mehrere Schritte von Eis (4 ° C), auf Raumtemperatur (~ 24 ° C), auf 37 ° C bis Schock zu minimieren.
- Die dissoc vorsichtig absaugenausstrahle Puffer aus dem Kulturröhrchen, wieder sicher zu sein, eine kleine Band mit den Gefäßsegmente zu verlassen.
- Entfernen Sie die Vorwärmung Dissoziationspuffer mit Enzymen aus dem Heizblock, übertragen Sie die 1 ml Enzymlösung zu dem Kulturröhrchen, das die Gefäßsegmente und legen Sie die Kulturröhrchen wieder in den Thermoblock. Inkubieren bei 37 ° C für 30 min.
- Während der Inkubation mit Enzymen, bereiten Sie das Verreiben Pipette verfüllen es mit Mineralöl und sichern Sie sie auf einer Mikro, die in einem Mikromanipulator montiert ist. Dann Einfahren der Kolben, um die Mikropipette mit 2 nl der Dissoziation Puffer zu füllen und die Position der Pipettenspitze über die Flusskammer.
- Am Ende der 30 min Inkubation entfernen Kulturröhrchen aus dem Heizblock und sorgfältig absaugen Puffer wie oben.
- Mit 4 ml Raumtemperatur Dissoziationspuffers waschen Arteriensegmente. Anmerkung: Es ist nicht mehr notwendig, den Behälter zu halten segmenten am Boden des Kulturröhrchen, Störung der arteriellen Stücke tatsächlich dazu beiträgt, sicherzustellen, daß restliche Enzyme wirksam entfernt werden.
- Übertragung eines Gefäßsegments zu der Strömungskammer durch vorsichtiges Ansaugen mit einer 1 ml-Mikropipette, und sie in der Durchflusskammer mit 1 ml der Spaltpuffer.
- Mit Hilfe der Mikromanipulator, der die Mikro, positionieren Sie die Spitze der Pipette in der Nähe von Verreiben ein Ende des Gefäßsegments.
- Saugen Sie den Gefäßsegment (500 nl zurückgezogen) in das Verreiben Pipette langsam (225 nl / s), um nicht zu mechanischen Belastungen an den ECs verursachen, und werfen Sie sie in die Kammer zurück. Wenn die Verdauung erfolgreich war, werden die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von der endothelialen Rohr getrennt werden.
- Wiederholen Sie das Verreiben, bis alle Zellen der glatten Muskulatur dissoziiert. Seien Sie sich bewusst, dass die übermäßige Verreiben (4x oder mehr) können die ECs beschädigen und sie reagieren nicht auf Agonisten. Tipp:Verreiben mit der Pipette, bewegen Sie die Adventitia von der endothelialen Röhre so schnell wie möglich, um es von verwickelten den Schlauch halten. Anmerkung: Mit dem Verreiben Pipette kann das isolierte Endothelzellen Rohr angesaugt und in eine separate Kammer überführt werden.
- Positionieren Sie den Endothelzellen Rohr in der Mitte des Flusskammer, entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet ist, und entfernen Sie das Verreiben Pipette.
- Sichere Pinning Pipetten Mikromanipulatoren an jedem Ende der Durchflusskammer angeordnet ist, und die Position ihrer Spitze an den jeweiligen Enden der endothelialen Rohr.
- Absenken eines Pinning Pipette über ein Ende des Rohrs, um es gegen die Unterseite der Kammer zu drücken. Positionieren der zweiten Pinning-Pipette in gleicher Weise an dem gegenüberliegenden Ende des Rohres. Hinweis: Die Platzierung der Pipetten Pinning ist ein Trade-off zwischen dem Befestigungsrohr (indem sie weiter von dem Ende des Rohrs) und sorgt für mehr Imaging / Versuchsfläche (indem sie näher an dem Ende des Rohrs). Auffinden tSaum ~ 50 &mgr; m von jedem Ende des Rohrs funktioniert gut. So wie der Pinning-Pipette das Rohr berührt, langsam zurückzuziehen entlang der Achse des Rohres, wodurch Ausdehnung auf in vivo Länge nähern; drücken Sie dann die Pipette gegen den Kammerboden, um das Rohr zu sichern.
- Beginnen Sie den Fluss der Superfusionslösung und damit der endothelialen Rohr, für mindestens 20 Minuten ruhen und ins Gleichgewicht zu halten (siehe Abbildung 3C). Nutzen Sie eine peristaltische Pumpe, um konstante Fluidstrom (Superfusion) durch die endotheliale Rohr zu halten. Hinweis: Pinning Pipetten entfernt werden kann, sobald der endothelialen Rohr auf den Boden der Strömungskammer (~ 25 min) verklebt oder an Ort und Stelle gelassen, um sicherzustellen, dass die endotheliale Rohr nicht wegrutschen.
5. Farbstoffbeladung und Calcium Imaging
- Um intrazellulären Calcium-Antworten zu visualisieren, laden Sie die endotheliale Rohr mit Fluo-04.00 Farbstoff bei Raumtemperatur (~ 24 ° C). Stopp-Fluidströmung in der Wanne, und fügen Fluo-4Uhr mit der Kammer mit einer Endkonzentration von 10 uM. Warten Sie 10 Minuten, damit der Farbstoff in die Zellen eindringen, dann superfuse die endotheliale Rohr mit frischen PSS für 20 Minuten, um sicherzustellen, extrazellulären Farbstoff entfernt wird und dass die intrazelluläre Farbstoff vollständig entes worden.
- Führen Kalzium-Imaging. Für diese Arbeit eine aufrechte Mikroskop (siehe Fig. 2) mit einer drehenden Scheibe konfokalen Abbildungssystem ausgestattet war, bei Raumtemperatur verwendet. Excite das fluoreszierende Kalzium-Farbstoff mit einem 491-nm-Laser und Bilder zu erwerben (bei 500-550 nm Emission) unter Verwendung einer Digitalkamera intensiviert.
Representative Results
Calcium Antworten können in frisch isolierten Endothelzellen Rohre mit Acetylcholin (ACh) eingeleitet werden. In diesem Film wird eine endotheliale Rohr mit 10 uM Fluo-04.00 beladen mit Superfusion von 1 uM ACh (Movie 1) stimuliert. Klicken Sie hier, um Film anzusehen . Der Farbstoff wird bei 491 nm angeregt und Emission von 500 bis 550 nm unter Verwendung eines verstärkten ladungsgekoppelte Vorrichtung Kamera aufgezeichnet. Bild Stapel werden mit 120 Bildern / s für eine 25 Sekunden Zeitraum erfasst und können dann gemittelt werden (zB zu 40 Bilder / s). Repräsentative Fluoreszenzbilder im Laufe der Zeit sind in Abbildung 4 dargestellt.
Fig. 1 ist. Flusskammer und Pipetten bei der Isolierung von Endothel-Rohre verwendet. A) Die Flusskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas als Basis. B montiert) Beispiele für eine gezogen (links) und einer gezogen, gebrochen, polierte und abgewinkelte (rechts) Kanülierung Pipette. Diese Pipette wird verwendet, um Erythrozyten aus dem Lumen der Arterie zu spülen folgenden Dissektion. Maßstabsbalken = 200 um. C) Beispiele für eine gezogen (links) und einer zog, gebrochen und poliert (rechts) Verreiben Pipette. Der Innendurchmesser dieser Pipette wird der Außendurchmesser der Arterie bestimmt. Maßstabsbalken = 200 um. D) Beispiele für eine gezogen (links) und einer zog, gebrochen und poliert (rechts) Pinning Pipette. Die Spitze dieses Pipette wird abgerundet und vollständig abgedichtet, um die Endothel-Röhre in der Strömungskammer zu sichern. Maßstabsbalken = 200 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Spinning Disc-Konfokalmikroskop für die Bildgebung von Ca 2 +-Signale. A) Upright-Mikroskop für Calcium-Bildgebung verwendet. B) (a) Die konfokale Spinning Disc-Einheit mit einem (b) intensiviert charge coupled device Kamera. C) Immersionsobjektive (a) 63X ( NA = 1) und (b) 20x (NA = 0,5) für die Bildgebung verwendet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Isolation der Bauchmuskulatur und A. epigastrica superior. A (also dort, wo Schiffe sollten ligiert werden). Maßstabsbalken = 1 cm. B) Isolierte Bauchmuskel (unilateral) und SEA in einer Dissektion Kammer für die Mikrodissektion merken. Rote Pfeil zeigt die erste große Verzweigungsstelle der SEA (dh der Punkt, an dem die Reinigung der Behälter wird gestoppt). Maßstabsbalken = 1 cm. C) Isolierte Endothelzellen Rohr von einer SUP. Differential-Interferenz-Kontrast-Bild eines Endothelrohr folgenden 1 h Inkubation bei Raumtemperatur. Die Endothelzellen Rohr wurde mit Superfusion-Puffer bei 3 ml / min überspült. Maßstabsbalken = 50 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. Calcium-Fluoreszenz in einer Endothelzelle Rohr. Repräsentative Fluoreszenzbildern eines endothelialer Gefäße in Reaktion auf die Stimulierung mit 1 uM Acetylcholin. A) Fluoreszenz vor der Stimulation. B) Endothelrohr Fluoreszenz bei der Verabreichung von Acetylcholin, t = 0 sek. C) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 5 Sekunden. D) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 10 Sekunden. E) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 15 Sekunden. F) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 20 Sekunden. Maßstabsbalken = 40 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Discussion
Hier beschreiben wir die Isolierung von Endothel-Röhrchen aus dem Meer und die Verwendung dieser Zubereitung zu visualisieren Ca 2 + Signalereignisse innerhalb seiner konstituierenden ECs. Dieses Verfahren wurde von einem ursprünglich entwickelt, um Rohre von endothelialen Arteriolen der Hamstercremaster-Muskel zu isolieren 8 angepasst. Feed Arterien des Hamsters Aufroller Muskel-und Backentasche Arteriolen 10, Maus A. epigastrica superior 6,7,9, Maus mesenterialen und zerebralen: Verwendung geringfügige Variationen der Techniken, die hier vorgestellten, haben wir endothelialen Rohre aus einer Vielzahl von Gefäßbetten, einschließlich getrennt Arterien und lymphatischen Mikrogefäßen (unveröffentlichte Beobachtungen; Referenzen werden zur Isolierung Mesenterialgefäße 12 und Hirngefäße 13 enthalten). Isolieren von endothelialen Rohre von neuen Gefäßbetten kann Veränderungen an der ursprünglichen Protokoll. Wenn Trennung nicht erfolgreich ist, ist es am besten, durch Änderung Aufschlusszeiten beginnen:Erhöhen Sie die Zeit, wenn die Verdauung endothelialen Röhren sind schwer von glatten Muskelzellen und Adventitia isolieren und reduzieren Verdauungszeit, wenn die Endothelzellen Rohr nicht intakt bleiben. Wenn eine Änderung der Verdauung mal nicht erfolgreich ist, die Konzentration der Verdauung Enzyme oder die Verdauung Temperatur sollte versucht werden. Eine weitere Option ist es, den Innendurchmesser der Pipette Verreiben, die Scherkraft bei der Beseitigung von Zellen der glatten Muskulatur erhöht reduzieren. Erhöhung der Geschwindigkeit der Fluidausstoß können auch für den gleichen Effekt versucht werden, ist aber eher die Herstellung beschädigen. Es sollte erkannt werden, dass es nicht möglich sein, intakten Endothelzellen Rohre von Gefäßen, in denen Endothelzellen nicht gut miteinander durch Junction-Proteinen verbunden isolieren.
Die Dissoziation von glatten Muskelzellen folgende enzymatische Verdauung wurde zunächst unter Verwendung eines Hand-style-Pipette 8. Wir haben das Verfahren verfeinert Verreiben mit einem microsyringe System, das konsequent Isolierung von Endothelzellen mehr Rohre (bis zu 3 mm) 6 ermöglicht hat. Bei Verwendung dieses Systems wird die Pipette Verreiben mit Mineralöl aufgefüllt, um eine kontinuierliche Flüssigkeitssäule zwischen dem Kolben Steuern der Fluidbewegung und PSS-Segment enthält, das Gefäß zu liefern. Die Inkompressibilität des Fluids zusammen mit dem konstanten Antriebskraft der Mikrokolben Ergebnisse in konstanten Scher wie der Behälter wird durch die Pipettenspitze gedrückt. Demgegenüber Handtechniken oft zum Dissoziieren von Zellen (z. B. Quetschen Gummidichtung am Ende einer Pasteur-Pipette) beinhaltet die Kompression der Luft, die Variabilität in der Antriebsdruck führt und dadurch an der Pipettenspitze ausgeübte Scher.
Es gibt mehrere Vorteile für die Rohrvorbereitung für das Studium endotheliale Funktion in Mikrogefäßen. Die erste ist, dass die Isolationsprozess bietet verschiedene homogene nativen Zellpopulationen von ECs und glatt muscle Zellen. Da die ECs bleiben physisch als Rohre verbunden, sind sie sich von einzelnen Zellen der glatten Muskulatur, die ein "C"-Konfiguration beibehalten, wenn sie während Verreiben entspannt bleiben. Somit jeweiligen Zelltypen leicht unterscheiden, z. B. bei Erhalt einer Probe zur molekularen Techniken, wie Echtzeit-PCR und Immunhistochemie 10. Da mehrere Rohre aus einem einzelnen Behälter (oder von bilateralen Gefäße für das SEA gemacht) isoliert, können molekulare Daten und Funktionsdaten aus den gleichen Gefäßen von einem bestimmten Tier erhalten werden. So Molekular Ausdruck kann mit der Funktionsverhalten von mikrovaskulären Endothelzellen korreliert werden. Weiterhin können sowohl intra-und interzellulären Signalereignisse intrinsische mikrovaskulären Endothel unabhängig vom Einfluss der hämodynamischen Kräfte (Druck, Durchfluss), vasoaktiven Substanzen in die Blutbahn (zB Hormone) durchgeführt aufgelöst werden kann, oder aus den umliegenden Zellen der glatten Muskulatur (z. B.60; über myoendothelial Kupplung 14-16), Nerven 17, 18 oder Gewebe Parenchym.
Wichtig ist, da das Endothel von frisch isolierten Mikrogefäßen bezeichnet, gibt es keine Veränderung des Phänotyps, die sonst mit Kultivierungs ECs 19-21 zugeordnet ist. Zum Beispiel, kultivierte ECs verlieren Muscarin-Rezeptor-Expression und dadurch ihre Calcium-Signal-Profile zu ändern. Weiterhin können elektrophysiologischen Eigenschaften von ECs in Kultur 22 ändern. Da in den einzelnen ECs bleiben durch funktionelle Gap Junction Kanälen verbunden ist, stellt die endotheliale Rohr ein ideales Modell für die Untersuchung die Leitung der elektrischen und Ca 2 +-Signale zwischen den Zellen 6,7. Es sollte auch erkannt, dass die dissoziiert glatten Muskelzellen sind leicht mit Patch-Clamp-Techniken für komplementäre Datenmikrovaskulären Funktion 23 zugrunde liegenden sucht werden.
Ein Schlüssel Beschränkung auf die endotheliale Rohr modell ist die Instabilität der Herstellung mit zunehmender Temperatur. Während die Vorbereitungen von der SEA haben bei Raumtemperatur (~ 24 ° C) und für mehrere Stunden bei 32 ° C stabil und gesund erwiesen, treten morphologische und funktionelle Abbau in weniger als einer Stunde bei 37 ° C 9. Eine zweite wichtige Einschränkung der endothelialen Rohr ist der Verlust der myoendothelial Kreuzungen und ihre inhärente Signaldomänen, die integral mit EC-Funktion in intakten Gefäßwand 14-16 sind. Es sollte auch erkannt werden, dass, während längere Rohre ermöglichen interzellularen Signalisierung über relativ große Entfernungen 6 Herstellung von Rohren ist kompliziert zu untersuchen, da sie länger werden, weil es schwieriger wird, vollständig dissoziieren umgebenden glatten Muskelzellen und Adventitia. Wir haben festgestellt, dass Rohre länger als 1-2 mm sind auch schwieriger zu positionieren und zu sichern in der Strömungskammer. Im Gegensatz dazu, während kürzere Rohre (z. B. <1 mm) ENABLE Ca 2 + und elektrische Signale zu unter 8 sind, sind sie schwierig während der Superfusion in der Strömungskammer aufrechtzuerhalten. Schließlich, auch mit optimaler Isolierung von Rohren bilateral, gibt es genügend Material für die traditionellen Quantifizierung der Proteinexpression mittels Western Blots, obwohl Immunomarkierung liefert einen Index von Protein-Expression und Lokalisation. Trotz dieser Einschränkungen stellt die endotheliale Rohr eine neue Vorbereitung für die Bereitstellung neuer Einblick in die Mechanismen der mikrovaskulären Endothelzellen Funktion in vivo.
Disclosures
Keine.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Pooneh Bagher und Dr. Erika Westcott für redaktionelle Kommentare bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health unter preisNummern R37-R01-und HL041026 HL086483 SSS und F32-HL107050 zu MJS unterstützt. Dieser Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
