Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

Published: November 25, 2013 doi: 10.3791/50759
Automatic Translation
1, 1,2
1Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 2Dalton Cardiovascular Research Center

Summary

Biz yerli, sağlam mikrovasküler endotel kalsiyum sinyalizasyon görselleştirme ve işlemek için bir hazırlık mevcut. Endotel tüpler taze iskelet kası komşu hücreleri içinde ve arasında vivo morfolojisi ve dinamik sinyalizasyon korumak besleyen fare direnç arterlerinin izole. Endotelyal tüp, diğer doku ve organların kılcal hazırlanabilir.

Abstract

Iskelet kas egzersiz ile örneklendiği gibi direnç damar kan akışının kontrolü, yan ürünleri metabolik çıkarılmasıyla oksijen kaynağı ve besin eşzamanlı düzenler. Endotel hücreleri (EC), tüm direnç damarlarının intima ve hat çapı kontrolünde önemli bir rol oynar (örneğin, endotele bağımlı damar genişlemesi) hizmet etmek ve doku kan akışı ve böylece, büyüklüğü ve dağılımı. EC'ler vasküler direnç düzenleme yayılabilir Otakoidlerin (örn. nitrik oksit ve arakidonik asit metaboliti) üretimine yol açan hücre içi Ca2 + sinyali ile gerçekleştirilir düz kas hücresi gevşeme ortaya 1-3 ve hiperpolarizasyon 4,5. Böylece endotelyal Ca 2 + sinyalizasyon dinamiklerini anlamak kan akış kontrolünü düzenleyen mekanizmaların anlaşılması yolunda önemli bir adımdır. Endotel tüpleri Yalıtımlı bl ile ilişkili karıştırıcı değişkenleri ortadan kaldırırdamar lümeninin ve çevreleyen yumuşak kas hücreleri ve başka türlü EC yapısını ve fonksiyonunu etkileyen perivasküler sinirler ile ood. İşte bu gemi için optimize edilmiş bir protokol kullanılarak üstün epigastrik arter (SEA) endotel boruların izolasyonu mevcut.

Bir anestezi uygulanmış fare endotelial tüpleri izole etmek için, SEA (diseksiyon sırasında görselleştirme kolaylaştırmak için) damar lümeni içinde kan korumak için yerinde bağlanır ve karın kasının tüm tabakanın eksize edilir. SEA iskelet kas lifleri ve bağ doku çevreleyen serbest kesilmiştir, kan lümeninden temizlenir ve hafif enzimatik sindirim kullanılarak dikkatlice toz haline getirilerek adventitia, sinirler ve düz kas hücrelerinin çıkarılmasını sağlamak için gerçekleştirilir. Sağlam endotel Bu taze izole edilmiş preparatlar, kimyasal ve elektrik si aktarabilmek, tek tek işlevsel EC birbirine bağlanmış kalan ile, kendi doğal morfolojisi korumakgap junction 6,7 ile hücre içinde gnals. Kalsiyum sinyal ve membran biyofizik yeni bakış açısı sağlamaya ek olarak, bu preparasyonlar, mikrovasküler endotel içinde yerli gen ifadesi ve protein lokalizasyonu moleküler çalışmalarına olanak sağlar.

Introduction

Bu protokol, fare SEA gelen endotel hücre tüpler izolasyonunu tarif eder. DENİZ karın ön kas için internal torasik arter ve gereçleri oksijenli kan kaynaklanmaktadır. Bizim bir model olarak SEA ile çalışırken düz kas hücre gevşeme yöneten ve koordine endotel rolünü yatan hücrelerarası sinyal olaylarını incelemek için uygundur nispeten uzun, dalsız mikrovasküler kesimleri sağlayan atfedilebilir. Iskelet kası dışındaki dokularda ilgilenenler için, kolayca beyin, bağırsak ve lenfatik sistemin mikrodamarlar endotel tüpleri elde etmek için adapte edilmesi için bu tekniği bulduk.

Bu yöntemin en önemli özellikleri, mikrovasküler endotel sağlam uzunlukları (1-3 mm) 7-9 işaret +, bunlar izole PSS ile süperfüze edildiği bir akış odası içinde bir cam lamel karşı emniyete ve Ca 2 görüntülü ya da vardırElektrik sinyal 6,8 için kazığa. Akış odası içinde, bir tüpün üst yarısı süperfüzyon çözeltisine maruz kalır ve deneysel müdahalelere yanıt, (lamel ile temas halinde) alt yarısında korunur iken ve hareketsiz kalır. Her iki içi ve hücre içi Ca2 + sinyal olaylarını okuyan ek olarak, endotel borular protein ekspresyonu 6,10 araştırmak için gen ekspresyonunu 6,10, immünohistokimya değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR için kullanılabilir ve elektrofizyolojik çalışmalar biyofiziksel özelliklerini tanımlamak Elektrik iletim 6,11 arasında.

Endotel fonksiyonunu incelemek için endotel tüp hazırlanması için çeşitli avantajları vardır. Genellikle "C" şeklinde bir zaman, (tek tek ayrışmış (tüp oluşumu kalır), endotel hücrelerinin ve düz kas hücrelerinin: İlk izolasyon işlemi, iki hücre popülasyonları arasında basit bir ayrım sağlamasıdırrahat). Bu seçici numune alma ve damar fonksiyonu, ilgili hücrelerin katkısını temel eşsiz özelliklerini çalışması için izin verir. İkincisi, bu model düz kas, sinirler ve parankimi çevreleyen, kan akımının etkisinden bağımsız, endotele içsel olayları sinyal çözünürlüğü sağlar. Taze ve böylece bir gen ya da hücre kültürü ile ilişkili protein ifadesindeki değişiklikleri kaçınarak izole Üçüncü olarak, endotel incelenmiştir.

Protocol

1.. Ekipman Hazırlanması: Akış Odası, Pipetler ve Çözümleri

  1. Odasını Akış: izole endotel tüpleri (Şekil 1A bakınız) superfuse altındaki bir 24 mm x 50 mm cam lamel ile bir akış odasına kullanın. Odasını monte etmeden önce,% 3 HCl ve% 70 etanol hem cam lamelleri yıkayın ultra saf su ile durulayın, ve nitrojen gazı ile kuru.
  2. Pipetler: pipetler Üç farklı protokol sırasında kullanılır: kanülasyon, toz haline getirme, ve çivileme. Kanülasyon ve çivileme pipetler Her iki deney gününden önce yapılabilir, ancak uygun şekilde toz haline pipet lümen boyutuna kabın çapının bilgi gerektirir günüdür yapılmalıdır.
    1. Kanülasyon pipetler: lümeninden kırmızı kan hücreleri temizlemek uzun, konik uçları için bir mikropipet çektirmenin kullanılarak borosilikat cam kılcal boruları çekmek için. ~ Bir dış çapa forseps ile biter Arası% 30 learterler (~ 50-80 mikron), ve yangın cila pürüzsüz olması için ucu (Şekil 1B bakınız) daha ss. Yaklaşık 45 ° açı da pipet ipuçları yararlıdır.
    2. Triturasyon pipet: mekanik, endotel tüplerinden düz kas hücreleri ve adventisya ayırmak borosilikat cam kapiller tüpler öğütülerek pipetler yapmak için. Yukarıdaki gibi kılcal tüpleri hazırlayın ve forseps ile ucunu kırmak. İpucu: daha kolay temiz trituration pipet cam kalın duvar kırmak için yapmak için cam bir puanlama aygıtı kullanın. Endotel borular izole edilecek olan kabın dış çapından daha büyük, yaklaşık 10-20 um, denemenin gününde belirlenen iç çapı için pipet kırın. Yangın lehçe kırık uçları pürüzsüz kadar (Şekil 1C bakınız).
    3. Sabitleme pipetler: akış bölme içinde endoteliyal tüp stabilize etmek için, endotel t sağlamak için pipetler çivileme yapmakbölmenin lamel tabanına karşı UBE. Kanülasyon pipetler ile aynı şekilde, cam kılcal tüpler çekin. Uçları mühürlü kadar Sonra bir ~ 100 mikron çapında ve yangın lehçe için forseps ile biter kırmak, yuvarlak ve düz (Şekil 1D bakınız). Not: iğneleme pipet ucu tamamen kapalı değilse, sıvı lümen girecek ve deney sonuçlarını yanıltabilecek.
  3. Çözümler: ultra saf tüm çözümleri (M 18.2) H 2 O hazırlayın ve 0.2 mikron filtre ile sterilize. Çözeltilerinin osmolalitesi 285-300 mOsm arasında olduğundan emin olun. 4 ° C'de saklandığında, çözeltiler ise, yaklaşık iki hafta içinde iyi kalır
    1. Diseksiyon çözeltisi: üstün epigastrik arterin diseksiyon sırasında kullanılan tuz çözeltisi (mmol / L) olarak hazırlanmıştır: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit ( HEPES), 10 glikoz, 0.01 sodyum nitroprussid (SNP), bird,% 0.1 büyükbaş hayvan serum 7.4 'luk bir pH ile albumin (BSA). NO donörü SNP arter cannulate ve triturasyonun sırasında düz kas hücre çıkarılmasını kolaylaştırmak için daha kolay bunları yaparken, böylece düz kas hücreleri rahatlamanıza yardımcı dahildir.
    2. Ayrışma çözeltisi: endotel tüpün ayrışma sırasında kullanılan tuz çözeltisi (mmol / L) olarak hazırlanmıştır: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz, 2 CaCl2, ve% 0.1 BSA, 7.4 'lük bir pH değeri. Bu tamponun 1 ml'lik bir kısım için, ekleyin: 0.62 mg / ml papain, 1.5 mg / ml kolajenaz ve 1.0 mg / ml ditioeritritol. Farklı satıcılardan enzimler enzimatik aktivitesinin çeşitli düzeylerde olabilir için, bu iş için kullanılan ürün numaraları malzeme tablo içinde referans olarak dahil edilmiştir. Not: tedavisi sırasında enzim ile ayrışma tampon ve ayrışma tampon iki farklı aşamada kullanılır.
    3. Superfusion çözeltisi: superfusin için kullanılan fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)g izole edilmiş endotel boru (mmol / L) olarak hazırlanmıştır: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 7.4 'luk bir pH ile 10 glükoz ve 2 CaCl2,.
    4. Cerrahi işlemleri başlamadan önce tamponlar ve çözümler hazırlayın. 200 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine, 4 ° C ve kısım Diseksiyon tampon 50 ml çözüm kaldırma ve buz üzerine yerleştirin. Buna ek olarak, ayrışma kısım 50 ml enzimsiz tampon ve oda sıcaklığına dengelenmeye tezgah üzerine yerleştirin. 4 ° C ile süperfüzyon çözüm çıkarın ve tezgah üstünde oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın.

2. Hayvan Preparasyon

Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler ve protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, Ulusal Enstitüleri ile uyum içinde olduğundan emin olun. Burada açıklanan prosedürleri Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildiMissouri.

  1. Erkek ya da en az 9 haftalık dişi fareler kullanın ve ayrı ayrı her bir çalışma. Intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile pentobarbital sodyum (60 mg / kg) ile bir fare anestezisi. Tip: Enjeksiyon aşırı doz alınması ihtimalini azaltır önce steril tuzlu su içinde 10 mg / ml pentobarbital seyreltilmesi.
  2. Anestezi hemen pentobarbital ilk enjeksiyondan sonra sıcaklık regülasyonu tavizler, bu yüzden sıcak fare tutmak. (~ 37 ° C'ye kalibre) bir ısıtma plakasının üstüne metal bir taşıyıcı (havalandırılan alüminyum sepet) ile stabil fare sıcaklığı tutmak için iyi çalışır. Alternatif olarak, fare uygun bir mesafede konumlandırmak için dikkatli bir şekilde bir ısı lambası kullanın. Uygun anestezi düzeyi (parmak veya kuyruk tutam çekilmesi eksikliği) elde edilinceye kadar fareye her 5-10 dk izleyin. Bir ek doz 15-20 dakika sonra gerekli olabilir. Özellikle, obez yaşlı, ya da hayvan ile, doz aşımı önlemek için yavaş ve dikkatli hareket etmek en iyisidirAksi vurguladı s.
  3. Dikkatle küçük pet saç kesme ile tıraş ventral tarafındaki saç kaldırmak. Özellikle dikkat hayvana travmayı önlemek için alınmalıdır. Bu kasık bölgesine koltukaltı kapsayan bir alanda tüm saç kaldırmak için yardımcı olur. Taze bir alkollü bez ile herhangi bir gevşek yapışan saç çıkarın.
  4. Mümkün olduğunca karın duvarının kadar açığa yaymak hem ön ve arka bacaklarda ile yatan, sırtında fare yerleştirin. Gerekirse, bir şoven bir şekilde bacaklarını korumak için laboratuvar bandı kullanın.

3. Üstün Epigastrik Arter İzolasyonu

  1. Sadece kasık bölgesinin alanının üzerinde deri yoluyla küçük bir kesi olun. Altta yatan karın kası hasara kaçınarak sadece cilt kesiliyor emin olmak; ilgili arka ayaklarında dışarı her yönde lateral kesi uzatmak. Rostrally ventral göğüs kafesinin üst orta hat ve birlikte kesi devamn, ilgili ön ayakları için her iki yönde yanal olarak kesi uzanır.
  2. Cildi nazikçe kaldırın ve bağ dokusu (bkz. Şekil 3A), böylece karın kaslarındaki tüm yüzeyini açığa altta yatan kas cilt tutan koparmaya makas kullanın. Oda sıcaklığında% 0.9 'luk tuzlu su çözeltisi ile maruz kas yıkayınız.
  3. SEA küçük boyutu nedeniyle, ayrıca prosedürleri için bir stereomikroskop altında hayvan yerleştirin. Forseps ile sternum alt kısmında bulunan yağ yastığı kaldırın ve bunun üzerinden bir kesi yapmak. Altta yatan doku içine çok derin kesmek için değil emin olun, alt kaburga boyunca kesi devam edin. DENİZ görünür olmalıdır; bunu zarar vermemek için özen. Kesi tamamlandıktan sonra, oda sıcaklığında,% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile maruz doku yıkayınız.
  4. Iskelet kasının üst katmanı geri çekildikten sonra, DENİZ ve altta yatan kas kolayca tespit edilir. İpucu: uzunluğu Notorijinal uzunluğu yaklaştığı (izolasyon üzerine ekseni boyunca kısaltmak) endotel tüpleri uzatmak için izole önce in vivo DENİZ. Forseps ve makas kullanılarak, dikkatli bir SEA altındaki ince kas tabakası tüketim.
  5. Açılı forseps kullanarak, SEA altında 6-0 ipek sütür uzunluğu geçmek ve basınçlı ve sonraki izolasyon ve temizlik sırasında vizüalizasyon damar lümeninde tutulan kan tutmak için arter ve komşu ven Arter.
  6. Karşı tarafta DENİZ ligasyonu işlemi tekrarlayın.
  7. Her iki SEA bağlandı edildikten sonra, ilgili tarafları ayırmak için karın kaslarının orta hat boyunca bir kesi yapmak.
  8. Cilt için yapıldığı gibi tamamen vücuttan abdominal kas ayırmak için dikey olarak dış kenarı boyunca devam kesi sonra, her iki yönde yanal olarak kesi uzatın. Basınçlı lümen korumak için SEA beslenen damar zarar görmesini önlemek.
  9. Csızdırmazlığı muhafaza etmek için ligasyon, yukarıdaki SEA ut ve 4 ° C diseksiyon tamponu 10 ml içeren 50 ml'lik bir beher içinde izole edilmiş kas ve arter yerleştirin.
  10. Karın diğer tarafında için prosedürü tekrar edin ve 10 dakika boyunca disseksiyon tampon maddesi içinde inkübe dokuları.
  11. (Şekil 3B) soğutulmuş (4 ° C) içeren diseksiyon odası diseksiyon tamponunda SEA içeren karın kas yerleştirin. Diseksiyon odası alt Sylgard (polidimetilsiloksan [PDMS]) ihtiva eden bir tabaka ile bir Petri kabı oluşur.
  12. Böcek işaretçilerine (0,15 mm) kullanılarak, in vivo uzunlukları (yukarıda belirtilen) yaklaştığı ve Sylgard sabitlemek için izole SEA ve karın kas germek. İpucu: Bu tür kas yönlendirmek peritonunu bakan ince tabaka üstünde olduğunu transillüminasyonun kullanarak DENİZ kolayca görünür hale getirir.
  13. Ince mikrodisseksiyon enstrümanları kullanan ve doğru ligasyon yukarı sitesinden çalışmaaşağı ucu, ilk büyük şube sitesinde (1-2 cm) kadar olan eşleştirilmiş ven ve çevresindeki doku SEA temizleyin. Sonra sadece şube sitenin üstünde ve sadece ligasyon aşağıya keserek SEA tüketim.
  14. Damar lümeninde tutulan kan kaldırmak için, SEA cannulate ve buz soğuk diseksiyon tamponu ile yıkayın. Silastic boru parçası kullanarak, buz, soğuk diseksiyon tampon içeren 5 ml şırınga bir kanülasyon pipet arka ucunu bağlamak ve SEA cannulate diseksiyon odasının içindeki ucu konumlandırmak için bir micromanipulator mikropipet sabitleyin.
  15. Eritrositlerin tüm dışarı kızarmış sonra, kanülasyon pipetle SEA kaldırmak ve diseksiyon çanak dışına pipet kaldırın.
  16. Küçük bölümler halinde her uzunluğu 1-3 mm SEA kesti. Bu kısa bölümler endotel tüplerin izolasyonunu kolaylaştırmak.

4. Endotel Tüp izolasyonu

  1. 12 mm x 75 mm cam kült doldurunbuz gibi soğuk diseksiyon tamponu ile ure tüp yarıya. Açılı forseps kullanılarak, kültür tüpüne arteryel parçaları aktarmak ve buz üzerine yerleştirin. Şu anda, ayrı bir 12 mm x 75 mm kültür tüp içinde 1 ml 'lik bir son hacme ayrışma tamponu ile sindirim enzimleri birleştiren (1.3.2 Çözümler bakınız) ve bir ısıtma bloğu ile birlikte 37 ° C'ye kadar ön ısıtma çözeltisi.
  2. Ayrışma tampon ve enzimler ısınıyor olsa da, dikkatli bir damar segmentleri içeren küçük bir hacim bırakarak kültür tüpünden diseksiyon tampon aspire.
  3. Yavaşça kalan diseksiyonu tampon yıkayacak enzimler olmadan oda sıcaklığı ayrışma tamponu ekleyin. İpucu: arteriyel parçaları, onları yerleşmek için bekleyen zaman kazanmak için kültür tüpün alt kalması ayrışma tampon yavaş yavaş böyle ekleyin. Çarpmasını en aza indirmek için 37 ° C, oda sıcaklığı (~ 24 ° C), buz (4 ° C) birden fazla aşamada tampon sıcaklıkları kaldırın.
  4. Dikkatle dissoc aspireiation damar segmentleri içeren küçük bir hacim bırakmak için emin olmak yine, kültür tüp tampon.
  5. , Isıtma bloğundan enzimleri ile ön-ısıtma ayrışma tamponunu çıkarın damar parçaları içeren kültür tüpüne enzim çözeltisinin 1 ml transferi ve ısıtma bloğu geri kültür tüpü yerleştirin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Enzimler ile İnkübasyon sırasında, toz haline getirme pipet hazırlamak mineral yağ ile dolgu ve bir mikromanipülatör içinde monte edilmiş bir mikroenjektör üzerine sabitleyin. Ardından ayrışma tamponu 2 nl ile pipet doldurmak ve akış odasının üzerinde pipet konumlandırmak için mikroenjektör pistonu geri.
  7. 30 dakika inkübasyon sonunda, ısıtma bloğundan kültür tüpü çıkarın ve dikkatli bir şekilde yukarıdaki gibi tampon aspire.
  8. Oda sıcaklığı ayrışma 4 ml tampon ile arter parçalarının yıkayın. Not: Bu, damar segm tutmak için gerekli artıkkültür tüpün dibinde veliler, arteriyel parçaları rahatsız aslında kalıntı enzimler etkili kaldırılır sağlamak için yardımcı olur.
  9. Yavaşça 1 ml mikropipet ile aspire ve ayrışma 1 ml tampon ile akış odasının içine yerleştirin ile akış odasına transfer bir damar segmenti.
  10. Mikroenjektör içeren mikromanipülatör kullanarak, damar segmentinin bir ucuna yakın olarak toz haline pipet ucu yerleştirin.
  11. EC'lere mekanik zorlanmalara neden, ve sonra tekrar odasına çıkartmak için değil, böylece triturating pipet yavaşça (225 nl / sn) içine damar segmentini (çekilmiş 500 nl) aspire. Sindirim başarılı olursa, düz kas hücreleri ve adventisya endotel tüpünden ayrışmış olacaktır.
  12. Her yumuşak kas hücreleri kesilerek kadar öğütme tekrarlayın. Aşırı öğütme (4x veya daha fazla) ECS zarar ve agonistlerinin bunları tepkisiz hale farkında olun. İpucu:tritürasyon pipet kullanarak, boru harmanlama onu tutmak için en kısa sürede uzak endotel tüpten adventisya hareket ettirin. Not: toz haline pipet kullanarak, izole edilmiş endotel boru aspire edilir ve ayrı bir bölme içerisine transfer edilebilir.
  13. Akış yönü boyunca hizalanmış akış odasının merkezinde, endotel tüp getirin ve öğütülerek pipet çıkarın.
  14. Mikromanipülatörler Güvenli çivileme pipetler akış odasının her iki ucunda monte edilmiş ve endotel tüpün ilgili uçlarında kendi ipuçları pozisyon.
  15. Bölmenin tabanına karşı bastırın tüpün bir ucuna bir iğneleme pipet indirin. Borunun karşı ucunda, aynı şekilde ikinci çivileme pipet yerleştirin. Not: çivileme pipetler Sıralama bir değiş tokuş tüp (uzak tüpün ucundan yerleştirerek) güven altına almak ve fazla görüntüleme / deneme alanında (yakın tüpün ucuna yerleştirerek) için izin arasındadır. T Bulmahem ~ borunun her bir ucundan 50 um iyi çalışır. Iğneleme pipet tüp dokunur gibi, yavaş yavaş ve böylece in vivo uzunluğu yaklaştığı uzatmakla, borunun ekseni boyunca geri çekilmesi, daha sonra tüp sabitlemek için hazne tabanına karşı pipet basın.
  16. Süperfüzyon çözelti akışını başlayın, (Şekil 3C), endotel boru dengeye uymak için ve en az 20 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. Endotel boru boyunca sabit sıvı akışını (süperfüzyon) muhafaza edilmesi için bir peristaltik pompa kullanmaktadır. Not: endotel boru akış odasının altındaki (~ 25 dakika) yapıştırılmış veya endotel boru yerinden oynamış olmaz sağlamak üzere sol sonra Sabitleme pipetler kaldırılabilir.

5. Boya Yükleme ve Kalsiyum Görüntüleme

  1. , Hücre içi kalsiyum yanıtlar görselleştirmek oda sıcaklığında fluo-04:00 boya endotelyal tüp yerleştirmek için (~ 24 ° C). Banyoda sıvı akışını durdurmak ve fluo-4 eklemek10 uM bir nihai yoğunlukta bölmeye AM. Daha sonra, hücre dışı boya çıkarılır ve hücre içi boya tamamen de-esterifiye edilmiş sağlamak için 20 dakika boyunca, taze PSS ile endoteliyal tüp superfuse, boya hücrelere girmesine izin vermek için 10 dakika bekleyin.
  2. Kalsiyum görüntüleme gerçekleştirin. Bu iş için, dik bir mikroskop dönen bir disk konfokal görüntüleme sistemi ile donatılmış, çevre oda sıcaklığında kullanılmıştır (Şekil 2). Bir 491 nm lazer ile floresan kalsiyum boya heyecanlandırmak ve yoğun bir dijital fotoğraf makinesi kullanarak (500-550 nm emisyona) görüntü kazanır.

Representative Results

Kalsiyum tepkiler asetilkolin kullanarak taze izole endotel tüpleri (ACh) başlatılabilir. Bu filmde, 10 uM fluo-04:00 ile yüklü bir endotel tüpü 1 mcM ACh (Film 1) ve süperfüzyomu ile uyarılır. filmi görmek için buraya tıklayın . Boya 491 nm heyecanlı ve emisyon yoğun bir şarj çiftli aygıt kamera kullanarak 500-550 nm kaydedilir. Görüntü yığınları bir 25 saniye süreyle / sn 120 kare elde edilir ve daha sonra (örneğin, 40 kare / sn) ortalama olabilir. Zaman içinde Örnek floresans görüntüleri, Şekil 4 'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Odası ve endotel boruların izolasyonu sırasında kullanılan pipetler akış. A) a çekti, kırık cilalı ve açılı (sağ) kanulasyonun pipet çekti (solda) ve taban. B olarak 24 mm x 50 mm cam lamel ile monte akış odası) örnekler. Bu pipet diseksiyon sonra arterin lümeninden eritrositleri temizlemek için kullanılır. Ölçek çubuğu = 200 mikron. C) a çekti, kırık ve cilalı (sağ) trituration pipet çekti (solda) ve örnekleri. Bu pipet iç çapı arterin dış çapı tarafından belirlenir. A (çekti kırık ve cilalı sağ) iğneleme pipet çekti (solda) ve Ölçek çubuğu = 200 mikron. D) örnekler. Bu pipet ucu yuvarlatılmış ve tam akış odası içindeki endotelyal tüp sağlamak için sızdırmaz kılınmıştır. Ölçek çubuğu = 200 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .


Şekil 2. Ca 2 + sinyalleri görüntüleme. A) kalsiyum görüntüleme için kullanılan Dik mikroskop. B), bir (b) yoğun şarj akuplaj düzenli bir kamera. C) Daldırma hedefleri (a) 63X ((a) Konfokal eğirme disk ünitesi için disk konfokal mikroskop İplik NA 1) = ve (b) 20X (NA = 0.5) görüntüleme için kullanılır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Karın kas izolasyonu ve üstün epigastrik arter. A (yani damarlar bağlandı olmalıdır) girin hangi yağ yastıkları altında siteleri işaretleyin. Ölçek çubuğu = 1 cm. B) Mikrodiseksiyon için bir diseksiyon odasından dışarı tutturulmuş izole karın kası (tek taraflı) ve SEA. Kırmızı ok (Geminin temizlik durduğu nokta yani) SEA ilk büyük çatallanma siteyi gösterir. Bir SEA'dan Ölçek çubuğu = 1 cm. C) İzole endotel hücre tüp. Oda sıcaklığında 1 saat süren kuluçkalamadan sonra bir endotel tüp diferansiyel-interferans-kontrast görüntüsü. Endotelyal tüp, 3 ml / dk 'da Superfusion tamponu ile süperfüze edildi. Ölçek çubuğu = 50 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .


Şekil 4. Bir endotel hücre tüp içinde kalsiyum floresan. 1 uM asetilkolin asetilkolin tatbikat zamanında uyarılması. Oda yapılmıştır. A) Floresans) endotel floresan tüp ile uyarılmaya yanıt olarak endotel tüp Örnek floresan görsel t = 5 saniye ile t = 0 saniye. ° C) endotel floresan tüpü. t D) endotel tüp floresan t = 15 sn 10 sn. E) endotel tüp floresan t = 20 sn. F) endotel tüp floresan. Ölçek bar = 40 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Burada denizden endotel boruların izolasyonu ve kurucu EC'ler olan sinyal olaylarını + Ca 2 görselleştirmek için bu preparatın kullanımını tarif eder. Bu prosedür, ilk olarak bir hamster Cremaster'ın kas 8 arteryollerin endotel tüpleri izole edilmesi için geliştirilmiş bir uyarlanmıştır. Hamster ekartör kas ve yanak yem arterlerin kese arteriyoller 10, fare üstün epigastrik arter 6,7,9, fare mezenterik ve serebral: Burada sunulan tekniklerin küçük varyasyonları kullanarak, biz de dahil olmak üzere vasküler yataklar çeşitli endotel tüpleri, izole var arterler ve lenfatik mikrodamarlar (yayımlanmamış gözlemler; referansları mezenterik damarlarma 12 ve serebral damarları 13 izole dahil edilmiştir). Yeni vasküler yatak endotel tüpleri Yalıtımlı orijinal protokole değişiklikler gerekebilir. Izolasyon başarısız ise, sindirim kez değiştirerek başlamak en iyisidir:Endotel tüpleri düz kas hücreleri ve adventisyanın gelen izole ve endotel tüp sağlam kalır yoksa sindirim süresini azaltmak için zor ise sindirim süresini artırın. Sindirim sürelerinin değiştirilmesi başarısız olursa, sindirim enzim konsantrasyonunun ya da sindirim sıcaklığının ayarlanması denenmelidir. Başka bir seçenek de, düz kas hücreleri giderilmesinde kesme kuvvetini arttırır toz haline getirilmesi, pipet, iç çapı azaltmaktır. Sıvı ejeksiyon hızım artırmak da aynı etki için denenmiş, ancak hazırlama zarar daha olasıdır edilebilir. Bu endotel hücreleri de birleştirilecek proteinleri ile birbirine bağlı olmayan edildiği damarlardan sağlam endotel tüpleri izole edilmesi mümkün olmayabilir olduğu kabul edilmelidir.

Enzimatik sindirme takiben yumuşak kas hücrelerinin ayrışma başlangıçta elle pipet 8 tarzı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bir microsyr ile toz haline getirme işlemi rafinedaha endotel boruların sürekli izolasyonu (en fazla 3 mm) 6 sağladı inge sistemi. Bu sistemi kullanarak zaman, toz haline getirme pipet sıvı hareketi ve kap kısmı ihtiva PSS kontrol piston arasında sürekli bir akışkan sütunu temin etmek üzere, mineral yağ ile geri doldurulur. Kabı olarak sabit bir kesme kuvvetinde piston mikroenjektör sonuç sabit bir itici güç ile birlikte sıvı sıkıştırılamazlık pipet ucu ile zorlanır. Buna karşılık, genellikle ayrıştırma hücreleri için elle kullanılan bir teknikler (örneğin, bir Pasteur pipeti sonunda kauçuk ampulü sıkma) işletme basıncı değişkenliği getirmektedir hava sıkıştırma, ve böylece, kesme pipet ucunda uygulanan içerir.

Kılcal endoteliyal işlev incelemek için boru hazırlanması için birden çok avantajı vardır. İlk izolasyon işlemi EC'ler belirgin homojen yerli hücre popülasyonları ve pürüzsüz mu sağlamasıdırsklero hücreleri. EC fiziksel tüpler gibi bağlı kaldığından, bunlar toz haline getirme sırasında rahat kalması halinde, bir "C" konfigürasyonu korumak tek düz kas hücreleri, farklıdır. Böylece ilgili hücre tipleri kolayca, ayırt edilir örneğin gerçek zamanlı PCR ve immünohistokimyasal 10 gibi moleküler teknikler için numune alırken. Birden çok boru tek bir tekneden (veya deniz için yapılan iki taraflı olarak cam kaplarından) izole edilmiş olması nedeniyle, molekül verileri ve işlevsel veri belirli bir hayvanın aynı damarlarından elde edilebilir. Böylece moleküler ifade mikrovasküler endotel fonksiyonel davranışları ile ilişkili olabilir. Bundan başka, mikrovasküler endotel iç içi ve hem de hücre içi sinyal olaylarının hemodinamik kuvvetleri (basınç, akış), kan akışı (örneğin, hormonlar) içinde taşınan vazoaktif ajanlar etkisinden bağımsız olarak çözülebilir veya çevresindeki düz kas hücrelerinden (örn.60; myoendothelial bağlantı 14-16 üzeri), sinirler 17 veya doku parankima 18.

Endotelyum taze belirlenen kılcal izole çünkü Önemli bir şekilde, aksi takdirde kültürlenmesi EC 19-21 ile ilişkili fenotipin herhangi bir değişiklik yoktur. Örneğin kültürlenmiş EC muskarinik reseptör ifadesini vermek ve böylece kalsiyum sinyal profillerini değiştirmek. Ayrıca, ECS elektrofizyolojik özellikleri kültüründe 22 değiştirebilirsiniz. Bireysel EC fonksiyonel boşluk kavşak kanallardan birleştiğinde kalır, çünkü, endotel hücreleri tüp 6,7 arasında elektrik ve Ca 2 + sinyalleri iletimi çalışmak için ideal bir model sunuyor. Ayrıca, ayrışmış düz kas hücreleri hali hazırda mikrovasküler fonksiyon 23 temel tamamlayıcı veriler için patch-clamp teknikleriyle incelendiğinde olduğu kabul edilmelidir.

Endotel tüp m bir anahtar sınırlamasıOdel sıcaklık artışı ile hazırlanması istikrarsızlığıdır. Denizden eden preparasyonlar çevre oda sıcaklığında (~ 24 ° C) ve 32 ° C'de birkaç saat boyunca stabildir ve sağlıklı kanıtlanmış olmasına rağmen, morfolojik ve fonksiyonel bozulma, 37 ° C'de 9 da bir saatten daha kısa bir süre içinde meydana gelir. Endotel tüpün ikinci önemli sınırlama sağlam damar duvarında 14-16 EC işlevi ayrılmaz bir parçasıdır myoendothelial kavşaklar ve kendi içsel sinyal alanlarının kaybı. Ayrıca tanınması gerektiğini, bu uzun tüpler onlar uzadıkça tamamen düz kas hücreleri ve adventisya çevredeki ayırmak daha zor olur çünkü tüpler hazırlanması karmaşık nispeten büyük mesafeler 6, üzerinde çalışılacak hücrelerarası sinyalizasyon kılarken. Biz, 1-2 mm'den daha uzun borular, aynı zamanda pozisyon ve akış odası içinde sabitlemek için daha zor olduğu bulunmuştur. Buna karşılık, daha kısa tüpler (örneğin, <1 mm) ise ena8, incelenecek ble Ca 2 + ve elektrik sinyalleri, bu akış odası içinde süperfüzyon sırasında bakımı zordur. Immün protein ekspresyonu ve lokalizasyon bir indeks sağlar da Son olarak, hatta çift taraflı tüplerin en uygun yalıtımı ile, Western blot kullanılarak protein ekspresyonu geleneksel miktar için yeterli malzeme vardır. Bu tür kısıtlamalara rağmen, endotel tüp in vivo mikrovasküler endotel hücre fonksiyonu mekanizmalarına yeni anlayışlar sağlamak için yeni bir hazırlık dönemini temsil etmektedir.

Disclosures

Yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar yazının hazırlanmasında editoryal yorumlar için Dr Pooneh bagher ve Dr Erika Westcott teşekkür ederim. Bu çalışma ödül numaraları R37-HL041026 ve SSS için R01-HL086483 ve MJS F32-HL107050 altında Ulusal Kalp, Akciğer ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Kan Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Bu içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Fisher S642-212
Potassium Chloride Sigma P9541
Magnesium Sulfate Sigma M2643
Calcium Chloride Sigma C1016
Sodium Nitroprusside Sigma 431451
Bovine Serum Albumin USB Products 9048-46-8
Papain Sigma P-4762
Collagenase Sigma C-8051
Dithioerythritol Sigma D-8255
Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) Warner Instruments G150-4
Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) World Precision Instruments 4897
Nanoliter Injector Microsyringe World Precision Instruments B203MC4 Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000
Micro4 Controller World Precision Instruments SYS-MICRO4
12 mm x 75 mm Culture Tubes Fisher 14-961-26
3-Axis Micromanipulator Siskiyou Corp DT3-100 Holding and positioning the pinning pipettes
Flow Chamber Warner Instruments RC-27N
100-1,000 µl Pipette Eppendorf 3120000062 For transferring digested vessel segment to the flow chamber
1 ml Pipette Tips Fisher 02-707-405 For transferring digested vessel segment to the flow chamber
Upright Microscope Olympus BX51W1 The actual microscope is up to the user
Spinning Disc Confocal System Yokogawa CSU-X1 Confocal imaging is optional
XR/TURBO EX Camera Stanford Photonics XR/TURBO EX Ideal for our needs; may vary with user
Piper Control Software Stanford Photonics Imaging software for TURBO EX camera
Stereo Microscrope Leica MZ8 may vary with user
Sylgard Dow Corning 184
Microdissection Scissors Fine Science Tools 15003-08
Dumont Forceps Fine Science Tools #5/45
Minutiens Insect Pins Austerlitz M size 0.15 mm
GP Millipore Express PLUS Membrane Millipore SCGPT05RE
Pipette Scoring Device Austin Flameworks Small Handheld Scoring Tool austinflameworks.com
Compact Pet Trimmer Wahl Clipper Corp. Model 9966 Clean well after each use to maintain life

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
  2. Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
  3. Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
  4. Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
  5. Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
  6. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
  7. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
  8. Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
  9. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
  10. Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
  11. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
  12. Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
  13. Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
  14. Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
  15. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
  16. Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
  17. Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
  18. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
  19. Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
  20. Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
  21. Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
  22. Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
  23. Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).

Tags

Temel Protokol Sayı 81 endotel tüpler mikrosirkülasyon kalsiyum sinyalizasyon direnç damar mikroskopisi
Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation … More

Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries. J. Vis. Exp. (81), e50759, doi:10.3791/50759 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter