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Biology

एक को लागू करने के लिए प्रोटोकॉल Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50762
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 2, 4
1Department of Biology, California Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, California Institute of Technology, 3Synthetic Biology Center, Department of Bioengineering, Massachusetts Institute of Technology, 4School of Physics and Astronomy, University of Minnesota
* These authors contributed equally

Summary

इस पांच दिवसीय प्रोटोकॉल सभी कदम, उपकरण, और आधारित एक कुशल अंतर्जात कोलाई खरोंच से सीए-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली बनाने और चलाने के लिए आवश्यक पूरक सॉफ्टवेयर रूपरेखा. अभिकर्मकों के साथ, प्रोटोकॉल 8 सेटअप करने के लिए घंटे या उससे कम एक प्रतिक्रिया, जमा है, और प्रक्रिया डेटा लेता है.

Abstract

आदर्श सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम सैद्धांतिक रूप से एक इन विट्रो मंच में नियंत्रित. 1 यह एक नियंत्रित तरीके से प्रोटीन और आनुवंशिक सर्किट व्यक्त करने के साथ ही सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक प्रोटोटाइप वातावरण प्रदान करने के लिए के लिए उपयोगी है. 2,3 में एक Vivo में सेलुलर पर्यावरण अनुकरण कर सकते हैं बाद के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, संरक्षित है कि सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम अंतर्जात कोलाई प्रतिलेखन अनुवाद तंत्र और अधिक सही T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रतिलेखन के आधार पर उन लोगों की तुलना में vivo सेलुलर गतिशीलता को प्रतिबिंबित करने में सक्षम हैं. हम एक कुशल अंतर्जात ई. की तैयारी और क्रियान्वयन का वर्णन इसी तरह की वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए एक 98% लागत में कमी पर T7 आधारित प्रणाली के रूप में प्रोटीन के बराबर मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं कि कोलाई आधारित प्रतिलेखन अनुवाद (सीए-टीएल) सेल से मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली. 4,5 buffers और कच्चे तेल की सेल निकालने की तैयारी कर रहे हैं एक का निष्पादन, साथ ही वर्णिततीन ट्यूब TX-टीएल प्रतिक्रिया. पूरे प्रोटोकॉल तैयार करने के लिए पांच दिन लगते हैं और एक तैयार करने में 3000 एकल प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त सामग्री पैदावार. एक बार तैयार, प्रत्येक प्रतिक्रिया डेटा संग्रह और विश्लेषण करने के लिए सेटअप से 8 घंटे के तहत लेता है. ई. के लिए विनियमन और प्रतिलेखन एक्सोजेनस के तंत्र कोली, ऐसे लाख / TET repressors और T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के रूप में, पूरक हो सकता है. ऐसे mRNA और डीएनए गिरावट दरों के रूप में 6 अंतर्जात गुण, भी समायोजित किया जा सकता है. 7 TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए प्रदर्शन किया गया बड़े पैमाने सर्किट विधानसभा, जैविक घटना की खोज, और दोनों T7 और अंतर्जात प्रमोटरों के तहत प्रोटीन की अभिव्यक्ति. 6,8 उनके साथ गणितीय मॉडल उपलब्ध हैं. 9,10 जिसके परिणामस्वरूप प्रणाली एक प्रोटोटाइप वातावरण के रूप में सिंथेटिक जीव विज्ञान में अद्वितीय आवेदन किया है, या "TX- टीएल biomolecular breadboard. "

Introduction

सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी T7 जीवाणुभोजी डीएनए का उपयोग कर युग्मित प्रतिलेखन अनुवाद तंत्र धरना साल बाद आगे बढ़ाने, विशुद्ध रूप से translational के रूप में 1950 के दशक में शुरू हुआ. 11,12 तब से, कई प्रयासों कच्चे तेल की सेल निकालने का सृजन (या ई अनुकूलन करने के लिए बनाया गया है . कोलाई S30 निकालने). 13,14 इन अनुकूलन एटीपी उत्थान या तनाव संशोधनों के माध्यम से कोशिका मुक्त प्रोटीन संश्लेषण के समय को बढ़ाने, और प्रोटोकॉल के समय और लागत को कम करने में शामिल हैं. 15-17 वैकल्पिक सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम मौजूद है कि कच्चे तेल की एवज में इस्तेमाल के पुनर्गठन घटकों अभिव्यक्ति के लिए सेल निकाल सकते हैं. 5 क्रूड सेल निकालने और पुनर्गठन तरीकों दोनों वाणिज्यिक उपयोग के लिए विकसित किया गया है.

सिंथेटिक जीव विज्ञान के आगमन के साथ, इंजीनियर जैविक मॉड्यूल और सर्किट का परीक्षण करने और व्यक्त करने के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता मंच के लिए एक वृद्धि की जरूरत है. 18,19 इस मंच होना चाहिएबहुमुखी अच्छी तरह से विशेषता, हेरफेर करने के लिए सरल है, और उपयोगकर्ता की आपूर्ति घटकों पर ध्यान केंद्रित किया. आधी सदी पहले विकसित होने के बावजूद, सेल मुक्त प्रणालियों ई. पर आधारित वे विकास और चयापचय की जटिलता के बिना सेलुलर प्रक्रियाओं के इन विट्रो प्रतिनिधित्व में एक सरल रूप में कोली आंतरिक रूप से, इन आवश्यकताओं को साझा करें. इसके अतिरिक्त, ई. पर विवो काम में से मूलभूत ज्ञान के सभी कोलाई ई. को आसानी से लागू होता है कोली सेल मुक्त प्रणाली.

सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम सबसे सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों का लक्ष्य आज तक, सिंथेटिक जीव विज्ञान में आवेदन कर सकते हैं हालांकि प्रोटीन और metabolite उपज को अधिकतम कर दिया गया है. इस T7 प्रमोटरों द्वारा संचालित दृश्यों के T7 जीवाणुभोजी प्रतिलेखन का उपयोग करके पूरा किया है. 20 अभिव्यक्ति कुशल और मजबूत है, इन प्रणालियों एक अति विशिष्ट उद्देश्य की सेवा. सेल विनियमन तरीकों सीमित हैं, लक्ष्य डीएनए टेम्पलेट्स होना चाहिएT7 प्रमोटरों शामिल करने के लिए reengineered, और इस तरह के ribosomal परिसरों के रूप में कुछ दृश्यों के लिखित और इकट्ठे नहीं किया जा सकता. 21,22 मौजूदा सेल से मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम अंतर्जात विनियामक तंत्र, सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए आवश्यक एक बहुमुखी प्रतिभा के संरक्षण, जबकि उच्च पैदावार बनाए रखने में असमर्थ हैं.

हम एक अंतर्जात ई. विकसित किया है पिछले प्रणाली द्वारा प्रदर्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति की दक्षता को बरकरार रखता है, लेकिन अनुमति देकर अतिरिक्त बहुमुखी प्रतिभा कहते हैं कि कोलाई सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली अभिव्यक्ति और (T7 या अन्य) तंत्र अंतर्जात और exogenous दोनों पर आधारित विनियमन. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मूल रूप से. Kigawa एट अल के आधार पर (2004) और लियू एट अल. (2005), लेकिन महत्वपूर्ण संशोधन किया है. यह वृद्धि की दक्षता के लिए मिलीग्राम और कश्मीर एसीटेट से अधिक मिलीग्राम और कश्मीर ग्लूटामेट का इस्तेमाल 2-mercaptoethanol निकालता है, और एक मनका डिब्बा का उपयोग कोशिकाओं lyses. 17,23,24 मनका पिटाई homogenization पर चुना जाता है,कारण प्रतिस्पर्धा प्रणालियों को अपनी कम लागत और तुलनीय पैदावार के लिए दबाव आधारित विधियों, या sonication. 23 3 phosphoglyceric एसिड (3 पीजीए) यह creatine फॉस्फेट की तुलना में जब बेहतर प्रोटीन पैदावार दे पाया था के रूप में ऊर्जा के स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है phosphoenolpyruvate. 4,25 हमारे सिस्टम या तो लैम्ब्डा-फेज ऑपरेटरों के साथ एक sigma70 आधारित प्रमोटर या अन्य वाणिज्यिक प्रणालियों से पैदावार करने के लिए इसी तरह की एक T7 संचालित प्रमोटर, का उपयोग संवाददाता प्रोटीन की 0.75 मिलीग्राम / एमएल उत्पादन कर सकते हैं. 4,6 पांच दिन सभी आवश्यक अभिकर्मकों (चित्रा 1) के उत्पादन के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, यह तुलनीय वाणिज्यिक सेल मुक्त प्रणालियों की तुलना में एक 98% लागत में कमी प्रदान करता है - माल की लागत श्रम (चित्रा 2) शामिल के साथ $ 0.26 उगता है जो 10 μl प्रतिक्रिया प्रति $ 0.11 रहे हैं.

Protocol

1. क्रूड सेल निकालने की तैयारी

तीन दिनों में कच्चे तेल की सेल निकालने की तैयारी कुशलता से संचालन करने के लिए दो लोगों की आवश्यकता है. संस्कृति विकास (1.1 कदम 1.11 कदम करने के लिए), सेल (1.37 कदम करने के लिए कदम 1.12), और स्पष्टीकरण (कदम 1.38 1.52 कदम के लिए) निकालें: प्रोटोकॉल कार्यात्मक तीन हिस्से होते हैं. यह सुविधा के लिए दिन में विभाजित प्रस्तुत किया है. आदर्श निकालने प्लाज्मिड pBEST-OR2-or1-पीआर-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40,019), और प्रोटीन की 27-30 मिलीग्राम / एमएल के बीच एक कच्चे सेल निकालने एकाग्रता है. 4 से deGFP की 0.75 मिलीग्राम / एमएल उत्पादन कर सकते हैं लेकिन , निकालने विशेषताओं बैच से बैच के लिए बदलती हैं. निम्नलिखित नुस्खा लगभग 3,000 एकल प्रतिक्रियाओं (6 मिलीग्राम कच्चे तेल की सेल निकालने) के लिए पर्याप्त आपूर्ति करती है. नीचे स्केलिंग हैं, तो यह कम नहीं है यहाँ दी मूल्यों का 1/6 से अधिक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. कारण समय की कमी को, ऊपर स्केलिंग की सिफारिश नहीं है.

दिन 1

  1. तैयार करें जीवाणु संस्कृति मीडिया, संस्कृतिऊपरी प्लेट, और मीडिया की खुराक के रूप में तालिका 1 में वर्णित है. व्यंजनों के लिए पूरक सामग्री 1 देखें.
  2. . स्ट्रीक BL21-Rosetta2 एक 2xYT + पी + सेमी अगर प्लेट पर -80 डिग्री सेल्सियस से तनाव और 37 डिग्री सेल्सियस या कालोनियों में आसानी से दिखाई दे रहे हैं जब तक कम से कम 15 घंटे के लिए सेते नोट: Chloramphenicol (मुख्यमंत्री) एक प्लाज्मिड के लिए चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है BL21-Rosetta2 तनाव में दुर्लभ tRNAs एन्कोडिंग.

दिन 2

  1. Buffers और 2 तालिका में वर्णित के रूप में की खुराक तैयार करें. व्यंजनों के लिए पूरक सामग्री 1 देखें.
  2. सहित 3 दिन के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करने और बाँझ: एल्यूमीनियम पन्नी आवरण (autoclaved) के साथ 6 x 4 एल Erlenmeyer बोतल, 4 एक्स 1 एल बाँझ अपकेंद्रित्र बोतलें, कीप (autoclaved), 0.1 मिमी ग्लास मनकों की 100 ग्राम (autoclaved), 2 हलचल सलाखों (autoclaved), 1 एल और 500 मिलीलीटर सिलेंडर (autoclaved), (autoclaved) 2 एक्स 1 एल बीकर, 18 जी सुई (बाँझ) के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज, 2-3 FL स्नातक की उपाधिजई buoys, 2-3 10k MWCO डायलिसिस कैसेट (बाँझ), cuvettes.
  3. मिनी संस्कृति 1 तैयार करें. एक 12 मिलीलीटर बाँझ संस्कृति ट्यूब और पूर्व गर्म 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक 2xYT + पी मीडिया के 4 एमएल और मुख्यमंत्री के 4 μl जोड़ें.
  4. 2xYT + पी + सेमी अगर थाली से एक कॉलोनी के साथ मिनी संस्कृति 1 टीका लगाना. , 220 rpm पर 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.
  5. 7 घंटा और 30 मिनट के बाद, मिनी संस्कृति 2 तैयार करते हैं. 30 मिनट के लिए एक बाँझ 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क और पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक 2xYT + पी मीडिया के 50 एमएल और मुख्यमंत्री के 50 μl जोड़ें.
  6. मिनी संस्कृति 1 की 100 μl के साथ मिनी संस्कृति 2 टीका लगाना और 8 घंटे के लिए, 220 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.

3 दिन

  1. 3 तालिका में चार खाली बाँझ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और रिकॉर्ड जन वजन. बर्फ पर फाल्कन ट्यूबों चिल, ये बाद में कदम 1.18 में इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. कदम 1.8 के बाद 7 घंटा और 30 मिनट, अंतिम जीवाणु संस्कृति मीडिया तैयार करते हैं. एक बाँझ 1 एल का प्रयोग सिलेंडर, स्थानांतरण 2xYT + पी मीडिया की 660 मिलीलीटर स्नातक की उपाधि प्राप्त मैं. 30 मिनट के लिए नोट: छह 4 एल Erlenmeyer बोतल और पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस के प्रत्येक Nto: 4 एल या बड़ा Erlenmeyer बोतल उचित वेंटिलेशन के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
  3. प्रत्येक 4 एल Erlenmeyer फ्लास्क में मिनी संस्कृति 2 की 6.6 मिलीलीटर जोड़ें. संस्कृति (मध्य लॉग विकास के चरण के लिए इसी) 600 एनएम पर 1.5-2.0 के एक आयुध डिपो तक पहुँच जाता है जब तक 220 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. शुद्धता के लिए एक 1:10 संस्कृति कमजोर पड़ने के साथ समय - समय आयुध डिपो की जाँच यह कदम कोई 3 से अधिक घंटा लेना चाहिए - 3 घंटा 45 मिनट;. तेजी मध्य लॉग चरण के दौरान विकास और संग्रह निकालने की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. तुरंत वृद्धि के बाद, बैक्टीरियल गोली कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 5000 XG पर चार 1 एल अपकेंद्रित्र बोतलें और अपकेंद्रित्र में समान रूप से सभी संस्कृतियों हस्तांतरण.
  5. 1 एम डीटीटी पहले से तैयार S30A के 2 एल के 4 मिलीलीटर जोड़कर पूरा S30A बफर तैयारी centrifuging है. मिक्स और बर्फ पर बफर बनाए रखें.
  6. Centrifuging समाप्त हो गया है, पूरी तरह से deca द्वारा कदम 1.12 से सतह पर तैरनेवाला हटायेंnting और एक बाँझ कागज तौलिया पर अपकेंद्रित्र बोतलें सोख्ता.
  7. चार अपकेंद्रित्र बोतलों में से प्रत्येक को 4 डिग्री सेल्सियस पर S30A बफर के 200 मिलीलीटर जोड़ें, और गोली पूरी तरह से कोई शेष clumps के साथ solubilized है जब तक सख्ती बोतलें हिला. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 5000 ग्राम से कम चार बोतलें अपकेंद्रित्र
  8. पूरी तरह से एक बाँझ कागज तौलिया पर अपकेंद्रित्र बोतलें decanting और सोख्ता द्वारा पिछले चरण से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  9. दोहराएँ 1.15 और 1.16 दोहराएँ.
  10. प्रत्येक अपकेंद्रित्र बोतल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 एमएल S30A बफर जोड़ें. .) 1.9 से एक ठंडा फाल्कन ट्यूब में प्रत्येक गोली और S30A संयोजन स्थानांतरण नोट: यह कदम एक छोटे कंटेनर में छर्रों स्थानांतरित करने के लिए है.
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 2,000 ग्राम पर फाल्कन ट्यूबों अपकेंद्रित्र Decanting से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  12. पुनः अपकेंद्रित्र फाल्कन ट्यूबों 2 मिनट के लिए 2,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से पिपेट द्वारा अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला हटायें. बर्फ पर रखें.
  13. च वजन3 तालिका में गोली और रिकॉर्ड जन के साथ हमारे फाल्कन ट्यूबों. गोली जन, जरूरत S30A बफर मात्रा और 3 तालिका में विशिष्ट सूत्र के आधार पर जरूरत के मोती की जन गणना.
  14. गोली की सही लदान और मनका पिटाई गुणवत्ता निकालने बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, और सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है. यह प्रयास करने से पहले वीडियो की समीक्षा करने की सिफारिश की है. हवाई बुलबुले से बचने और समान रूप से मोती वितरित करने में विफलता अक्षम निकालने में परिणाम होगा.
  15. समरूप तक प्रत्येक फाल्कन ट्यूब, भंवर तालिका 3 में गणना की S30A बफर की राशि जोड़ें, और बर्फ पर लौटें.
  16. बर्फ पर अन्य फाल्कन ट्यूबों रखते हुए, 30 सेकंड के लिए, मोतियों की प्रत्येक विभाज्य के अलावा के बाद. तीन aliquots, कुल मोती का 1/3 का उपयोग करते हुए प्रत्येक में एक भी फाल्कन ट्यूब रहकर भंवर मोती जोड़ें. भंवर कदम और अंतिम भंवर के बाद दोनों के बीच बर्फ पर फाल्कन ट्यूब रखें. पिछले विभाज्य गयी है, के बाद सुनिश्चितमोती समान रूप से वितरित कर रहे हैं. एक मोटी पेस्ट का गठन किया जाना चाहिए.
  17. एक 3-4 मिमी खोलने बनाने के लिए एक बाँझ धार का उपयोग अंत काटने से एक 5 मिलीलीटर (मात्रा) विंदुक टिप तैयार करें. 2 मिलीलीटर विंदुक डायल नोट: अलग पिपेट सेट और सुझावों खींच और मोटी मनका सेल समाधान जारी करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता कि चूषण के विभिन्न मात्रा में उपलब्ध कराने, हटाया अंत के साथ एक 1 एमएल पिपेट टिप एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है..
  18. बर्फ पर 20 मनका पिटाई ट्यूबों रखें.
  19. संशोधित pipet का उपयोग सेल मनका समाधान के उच्च चिपचिपापन सत्यापित करें. यह मात्र इंजेक्शन दौरान पिपेट टिप बाहर निकलने के मुद्दे पर चिपचिपा होना चाहिए. बहुत चिपचिपा है, 1.25 कदम के अनुसार पिपेट टिप फिर से समायोजित. काफी चिपचिपा यदि नहीं, तो मोती (गोली जन * 5.1) की एक अधिकतम द्रव्यमान के लिए, (गोली जन * 0.05) की वेतन वृद्धि में जोड़ा जा सकता है. मोती, 30 सेकंड के लिए भंवर के बाद इसके अलावा और बर्फ पर लौटें. चिपचिपाहट के एक प्रदर्शन के लिए चित्रा 3A देखें.
  20. संशोधित pipet का उपयोग फाल्कन ट्यूब से मनका सेल समाधान निकालें, और एक बाँझ मनका पिटाई ट्यूब में स्थानांतरित, यह मनका सेल समाधान के साथ पूर्ण तीन चौथाई भरने. मोती redistributing बिना हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक काउंटर मिनी अपकेंद्रित्र पर अत्यंत संक्षिप्त (1s) स्पिन. मनका पिटाई ट्यूब लोड हो रहा है अभी भी छवियों के लिए आंकड़े 3 बी डी देखें.
  21. एक अवतल meniscus फार्म को मनका सेल समाधान जोड़ना खत्म.
  22. टोपी के बाहर होंठ बाधित नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है, एक मनका पिटाई ट्यूब टोपी के अंदर पर मनका सेल समाधान का एक बहुत ही छोटी सी बूंद जोड़ें, अन्यथा, मनका पिटाई ट्यूब नहीं करेंगे करीब sufficientl वाई. एक सपाट सतह पर टोपी ठोकर और टोपी के तल पर कोई हवाई बुलबुले हैं कि सत्यापित.
  23. पिछले चरण से मनका पिटाई टोपी के साथ मनका पिटाई ट्यूब टोपी. मनका पिटाई के लिए सहायक के लिए हाथ. सही ढंग से किया है, टोपी कसकर कोई हवाई बुलबुले Shoul, बंद किया जाना चाहिएदृश्यमान होगा, और थोड़ा (यदि हो तो) मनका सेल समाधान अतिप्रवाह चाहिए. हवा के बुलबुले दृश्य या टोपी करता है पूरी तरह से बंद नहीं कर रहे हैं अगर लदान प्रक्रिया फिर से करें.
  24. शेष मनका सेल समाधान के साथ कदम 1.24 से भंवर फाल्कन ट्यूब मोती का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए. फाल्कन ट्यूब खाली है जब तक दोहराएँ 1.28-1.31 कदमों, तो प्रत्येक अतिरिक्त फाल्कन ट्यूब के लिए 1.31 के लिए कदम 1.24 दोहराएँ.
  25. आचार एक साथ 1.33-1.38 कदम. सहायक ले मनका पिटाई 1.31 से ट्यूब और बर्फ पर जगह भर दिया है. दो भरे मनका पिटाई ट्यूब एकत्र किया गया है और कम से कम एक मिनट के लिए बर्फ पर किया गया है एक बार, मनका पिटाई शुरू करते हैं.
  26. 46 rpm पर 30 सेकंड के लिए एक ट्यूब मारो. अन्य ट्यूब पिटाई करते हुए 30 सेकंड के लिए उल्टा बर्फ पर रखें.
  27. प्रत्येक भरा मनका पिटाई ट्यूब 1 मिनट कुल के लिए हरा दिया गया है कि इस तरह के पिछले चरण दोहराएँ.
  28. दोहराएँ 8 भरा मनका पिटाई ट्यूब (या अपकेंद्रित्र पकड़ कर सकते हैं अधिकतम राशि) घंटे तक 1.33-1.35 कदमोंसंसाधित किया गया AVE. फिर, 15 मिलीलीटर फाल्कन (चित्रा 3E) से फिल्टर तंत्र का निर्माण. एक 15 मिलीलीटर फाल्कन की तह तक, एक नया मनका पिटाई टोपी, फ्लैट हिस्सा चेहरे को जोड़ें. पूरी तरह से सील कर दिया जब तक फिर मजबूती से संसाधित मनका पिटाई ट्यूब के अंत पर संसाधित मनका पिटाई ट्यूब और प्रेस सूक्ष्म क्रोमैटोग्राफी स्तंभ से टोपी को हटा दें. सूक्ष्म क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के क्षालन अंत बंद स्नैप, और सूक्ष्म क्रोमैटोग्राफी स्तंभ जगह, क्षालन खाली मनका beading ट्यूब में, नीचे अंत. 15 मिलीलीटर फाल्कन में इस जटिल रखें. सभी 8 भरा मनका पिटाई ट्यूबों के लिए दोहराएँ, जब पूरा बर्फ पर रहते हैं.
  29. अपकेंद्रित्र 8 फिल्टर apparatuses, फाल्कन ट्यूब uncapped, मोतियों से निकालने और गोली अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6000 ग्राम पर.
  30. सत्यापित प्रत्येक मनका पिटाई ट्यूब व्यवहार्य निकालने का उत्पादन किया गया. ठीक से हराया निकालने परेशान नहीं किया जाएगा, और गोली दो अलग परतों होगा. सभी परेशान ट्यूब त्यागें, और गैर परेशान ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण मैंजितना संभव हो कम गोली लेने Nto व्यक्ति 1.75 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब,. सभी मनका पिटाई ट्यूब संसाधित किया गया है, जब तक बर्फ पर रखें. एक सही ढंग बनाम गलत ढंग से संसाधित मनका पिटाई ट्यूब की तुलना 3F आंकड़ा देखें.
  31. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 जी पर पिछले चरण से अपकेंद्रित्र सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों
  32. स्थानांतरण गोली से मुक्त एक नया मनका पिटाई ट्यूब में 500 μl को मजबूत बनाने, एक pipet का उपयोग खाली मनका पिटाई ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला.
  33. 220 rpm पर हटाया मनका पिटाई टोपियां, 80 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ, पिछले चरण सेते हैं. यह कदम मनका beading प्रक्रिया के दौरान जारी अंतर्जात exonucleases का उपयोग न्यूक्लिक एसिड शेष हज़म, और एक टिशू कल्चर ट्यूब में मनका पिटाई ट्यूब खड़े करके किया जा सकता है.
  34. डायलिसिस सामग्री तैयार करें. 1 एम डीटीटी पहले से तैयार S30B के 2 एल के 2 मिलीलीटर जोड़कर पूरा S30B बफर तैयारी. मिक्स और दो सेंट में से प्रत्येक में 900 मिलीलीटर जोड़ने1 एल बीकर erile. प्रत्येक बीकर में बाँझ चुंबकीय दोषी जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना
  35. कदम 1.41 के बाद, निकालने परेशान दिखना चाहिए. 1.75 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 1.5 मिलीलीटर aliquots में निकालने मजबूत है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12000 जी पर अपकेंद्रित्र
  36. एक pipet का प्रयोग, बर्फ पर 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में गोली मुक्त सतह पर तैरनेवाला मजबूत है, और ट्यूब और inverting कैपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. कदम 1.47 के लिए बर्फ पर सतह पर तैरनेवाला के 10 μl बचाओ.
  37. उत्पादित निकालने की कुल राशि का निर्धारण करते हैं, और कैसेट प्रति निकालने की 2.5 मिलीलीटर संभालने, 2 मिनट के लिए S30B में submersing द्वारा 10k MWCO डायलिसिस कैसेट की आवश्यक संख्या हाइड्रेट.
  38. निकालने के 2.5 मिलीलीटर के साथ कैसेट लोड करें. प्रत्येक बीकर 2 कैसेट तक का समय लग सकता है; dialyze, क्रियाशीलता, 3 घंटा नोट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर: कैसेट का आंशिक लदान स्वीकार्य है.. Dialyzing प्रोटीन के उत्पादन पैदावार बढ़ जाती है.
  39. पिछले चरण के दौरान, निकालने के लिए प्रोटीन की विशेषताएँकदम 1.44 में बचाया निकालने का उपयोग कर एक ब्रैडफोर्ड परख के साथ एकाग्रता,. जानकारी के लिए पूरक सामग्री 2 देखें.
  40. डायलिसिस 1.75 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 1.5 मिलीग्राम से, पूरी विभाज्य निकालने के बाद. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र एक गोली ट्यूब के नीचे बनेगी.
  41. बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में pipetting द्वारा पिछले चरण से स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला एकीकरण. 5-10x inverting द्वारा homogenize.
  42. कदम 1.47 में ब्रैडफोर्ड द्वारा निर्धारित एकाग्रता के आधार पर, व्यक्ति 1.75 मिलीलीटर ट्यूबों में विभाज्य निकालने की राशि का निर्धारण. प्रत्येक व्यक्ति ट्यूब कुल प्रोटीन का 810-900 मिलीग्राम के साथ एक मात्रा होनी चाहिए. निकालें 27 मिलीग्राम / एमएल से अधिक कुल प्रोटीन एकाग्रता होनी चाहिए. उदाहरण के लिए, 30 μl 28 मिलीग्राम / एमएल विभाज्य निकालने, और विभाज्य निकालने 32 में, एकाग्रता अधिक है अगर विभाज्य 30 μl aliquots में 30 मिलीग्राम / एमएल नीचे निकालने, और बड़े पैमाने:. यह कदम expediently नोट संचालन करने के लिए सहायता की आवश्यकता है28.1 μl द्वारा मिलीग्राम / एमएल.
  43. बुलबुले से बचने के ख्याल रख रही है कदम 1.50 निम्नलिखित विभाज्य निकालने,. तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज निकालने नोट:. बुलबुले के साथ Aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifuging द्वारा हटाया जा सकता है
  44. एक झरनी का उपयोग तरल नाइट्रोजन से ट्यूबों निकालें और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस सुरक्षा पर स्टोर: सुरक्षात्मक eyewear पहनें; निकालने ट्यूब की टोपी के कारण तरल नाइट्रोजन और कमरे के तापमान तापमान के बीच अंतर को बंद आ सकता है.

2. एमिनो एसिड के घोल तैयार करना

एमिनो एसिड समाधान थोक में तैयार किया जाना चाहिए. निम्नलिखित नुस्खा लगभग 11,000 एकल प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त आपूर्ति, आरटीएस एमिनो एसिड पारखी की एक पूरी किट का इस्तेमाल करता. नीचे स्केलिंग हैं, यह कोई कम से कम आधे से एक किट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. स्टॉक में प्रत्येक अमीनो एसिड 140 मिमी leucine के लिए छोड़कर, 1.5 मिलीग्राम, 168 मिमी पर आपूर्ति की है. एमिनो एसिड समाधान की अंतिम रचना है:leucine, 5 मिमी, अन्य सभी अमीनो एसिड, 6 मिमी. इस 4x काम कर एकाग्रता है.

  1. -20 डिग्री सेल्सियस से सभी 20 अमीनो एसिड निकालें और कमरे के तापमान पर पिघलना. एक बार thawed, भंवर अमीनो एसिड, भंग यदि आवश्यक हो तो 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating तक. अमीनो एसिड भंग हो जाने के बाद, कमरे के तापमान पर रखा जाता है जो Asn, पीएचई, और Cys के अलावा बर्फ पर सभी अमीनो एसिड डाल दिया. CYS पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है.
  2. बर्फ पर, एक बाँझ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब बाँझ पानी की 12 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बाद फाल्कन ट्यूब भंवर और बर्फ पर समाधान रखने के लिए, देखभाल 1.5 निम्न क्रम में प्रत्येक अमीनो एसिड के मिलीलीटर जोड़ें: आला, Arg, Asn, एएसपी, Gln, ग्लू, Gly, उनकी, इले, लिस, मेट, पीएचई, प्रो, आनंद, THR, वैल, टीआरपी, Tyr, लियू, Cys. CYS इसके बाद, भंवर समाधान जब तक आवश्यक हो तो 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating, अपेक्षाकृत स्पष्ट है. एक निलंबन के रूप में जोड़ा जा सकता है. CYS पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है.
  4. 50 ट्यूब पर में विभाज्य एमिनो एसिड समाधानबर्फ पर 26 μl प्रत्येक. बर्फ पर ट्यूब प्रति 500 ​​μl में आराम विभाज्य. 500 μl aliquots बफर तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि aliquoting, भंवर मुख्य शेयर अक्सर निलंबन के असमान वितरण से बचने के लिए जबकि 26 μl aliquots., निकालने औजार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  5. -80 डिग्री सेल्सियस सुरक्षा पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज aliquots: सुरक्षात्मक eyewear पहनें; निकालने ट्यूब की टोपी के कारण तरल नाइट्रोजन और कमरे के तापमान तापमान के बीच अंतर को बंद आ सकता है.
  6. वैकल्पिक: पहले किए गए एमिनो एसिड समाधान के खिलाफ नव निर्मित एमिनो एसिड समाधान के एक गतिविधि परख आचरण.

3. ऊर्जा समाधान तैयार

ऊर्जा समाधान कच्चे तेल की सेल निकालने के औजार के लिए और बफर बनाने के लिए दोनों का इस्तेमाल किया जाता है, और थोक में तैयार किया जाना चाहिए. निम्नलिखित नुस्खा लगभग 10000 एकल प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त आपूर्ति करती है. नीचे स्केलिंग हैं, तो यह recomme हैकोई कम से कम यहां दिए गए मूल्यों के 1/24 से अधिक का उपयोग करने के लिए nded. ऊर्जा समाधान एक महत्वपूर्ण मौद्रिक लागत है, पहली बार उपयोगकर्ताओं को 1/24 पैमाने पर तैयार करने के लिए चाहते हो सकता है. ऊर्जा समाधान की अंतिम रचना है: HEPES पीएच 8 700 मिमी, एटीपी 21 मिमी, जीटीपी 21 मिमी, CTP 12.6 मिमी, UTP 12.6 मिमी, tRNA 2.8 मिलीग्राम / एमएल, सीओए 3.64 मिमी, NAD 4.62 मिमी, शिविर 10.5 मिमी, folinic एसिड 0.95 मिमी, spermidine 14 मिमी, 3 पीजीए 420 मिमी. इस 14x काम कर एकाग्रता है. अगर वांछित, 4 तालिका में प्रत्येक व्यक्ति के मद बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

  1. -80 डिग्री सेल्सियस से 4 तालिका में सभी रसायनों निकालें, -20 में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए सी, या 4 डिग्री सेल्सियस.
  2. तालिका 4 में वर्णित के रूप में शेयर समाधान तैयार करें. व्यंजनों के लिए पूरक सामग्री 1 देखें. तैयारी के बाद बर्फ पर सभी समाधान रखें.
  3. एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में, के बाद इसके अलावा फाल्कन ट्यूब भंवर ख्याल रख रही है, निम्न क्रम में जोड़ने के लिए और ओ समाधान रखने के लिएn बर्फ: 3.6 मिलीलीटर 2 एम HEPES, 144 μl पानी, 1.39 मिलीग्राम न्यूक्लीओटाइड मिश्रण, 576 μl 50 मिलीग्राम / एमएल tRNA, 576 μl 65 मिमी कोए, 276 μl 175 मिमी NAD, 170 μl 650 मिमी शिविर, 288 μl 33.9 मिमी Folinic एसिड , 144 μl 1 एम spermidine, और 3.09 मिलीग्राम 1.4 एम 3 पीजीए.
  4. बर्फ पर 7 μl प्रत्येक पर 50 ट्यूबों में अशेष ऊर्जा समाधान. बर्फ पर ट्यूब प्रति 150 μl में आराम विभाज्य. 150 μl aliquots बफर तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि 7 μl aliquots aliquoting, भंवर मुख्य स्टॉक जबकि अक्सर., निकालने औजार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  5. -80 डिग्री सेल्सियस सुरक्षा पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज aliquots: सुरक्षात्मक eyewear पहनें; निकालने ट्यूब की टोपी के कारण तरल नाइट्रोजन और कमरे के तापमान तापमान के बीच अंतर को बंद आ सकता है.
  6. वैकल्पिक: पहले किए गए ऊर्जा समाधान के खिलाफ हाल में किए गए ऊर्जा समाधान की एक गतिविधि परख आचरण.

4. बफर तैयारी

Buffer तैयारी तैयार करना, एमिनो एसिड के घोल तैयार करना, और ऊर्जा समाधान तैयार निकालें क्रूड सेल के पूरा होने की आवश्यकता है. प्रत्येक बफर कच्चे तेल की सेल निकालने के एक बैच के लिए अद्वितीय है. मिलीग्राम ग्लूटामेट, कश्मीर ग्लूटामेट, और डीटीटी (उस क्रम में) अभिव्यक्ति की अधिकतम स्तर के साथ प्रतिक्रियाओं का उत्पादन करने के लिए इस खंड में अनुकूलित कर रहे हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल पूर्व तैयार कच्चे तेल की सेल निकालने जांचना और बफर तैयार करने के लिए एक पूर्व लिखित टेम्पलेट, TXTL_e (टेम्पलेट) _calibration_JoVE.xlsx (पूरक सामग्री 3) का इस्तेमाल करता. हालांकि, एक भी कच्चे तेल की सेल निकालने जांचना और निकालने के साथ, यह एक कुल प्रतिक्रिया मात्रा का 75% है कि मैन्युअल रूप मिलीग्राम ग्लूटामेट, कश्मीर ग्लूटामेट, और डीटीटी के अनुकूलन और ऐसे बफर की स्थापना करके टेम्पलेट के बिना बफर तैयार कर सकते हैं. मैन्युअल रूप से औजार हैं, अंतिम स्थितियों की प्रतिक्रिया चरण 5 में पाया जा सकता है.

  1. "सामान्य डेटा" फार्म पूरा करें.
  2. बर्फ 100 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट (4 डिग्री सेल्सियस), 3 एम कश्मीर ग्लूटामेट (4 डिग्री सेल्सियस) पर पिघलना, 6मिमी एमिनो एसिड के घोल (26 μl, -80 डिग्री सेल्सियस), ऊर्जा समाधान (7 μl, -80 डिग्री सेल्सियस), 100 मिमी डीटीटी (-20 डिग्री सेल्सियस), सकारात्मक नियंत्रण डीएनए (-20 डिग्री सेल्सियस), 40% खूंटी . 8000 (4 डिग्री सेल्सियस), कच्चे तेल की सेल निकालने (-80 डिग्री सेल्सियस), और पानी (4 डिग्री सेल्सियस) नोट: का प्रयोग करें 1 एनएम काम कर एकाग्रता pBEST-OR2-or1-पीआर-UTR1-deGFP-T500 (Addgene प्लाज्मिड 40019) सकारात्मक नियंत्रण (उत्तेजना 485 एनएम, उत्सर्जन 525 एनएम), या उच्च तीव्रता संकेत पैदा करता है जो एक और संदर्भ के लिए. 4
  3. व्यक्तिगत सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्टॉक मिलीग्राम ग्लूटामेट के सेट मात्रा aliquoting द्वारा, 4-10 मिमी अतिरिक्त मिलीग्राम ग्लूटामेट के एक परीक्षण रेंज से, सात 10.5 μl प्रतिक्रियाओं को तैयार है. नोट: 10.5 μl प्रतिक्रियाओं शुरू में तैयार कर रहे हैं, अंतिम प्रतिक्रिया 10 μl है.
  4. कश्मीर ग्लूटामेट की एक अतिरिक्त 80 मिमी जोड़ने ", मिलीग्राम ग्लूटामेट अंशांकन 'के तहत टेम्पलेट में संकेत के रूप में मास्टर मिश्रण तैयार करें. प्रत्येक आइटम के बाद इसके अलावा बर्फ और भंवर पर रखें ध्यान दें:. यहाँ और टेम्पलेट में दिए गए मान रहे हैंमिलीग्राम ग्लूटामेट, कश्मीर ग्लूटामेट, और कच्चे तेल की सेल निकालने बनाने के लिए इस्तेमाल S30B बफर में डीटीटी वर्तमान की मात्रा के अलावा.
  5. मिलीग्राम ग्लूटामेट युक्त नमूने के मास्टर मिश्रण जोड़ें और प्रतिक्रियाओं तैयार करते हैं. कदम विस्तृत निर्देशों के लिए 5.10-5.13 देखें.
  6. एक मशीन या एक प्लेट रीडर में या तो 29 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया चलाएँ.
  7. . अंत अभिव्यक्ति के स्तर और प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्रा -4 ए) की अधिकतम दर से इष्टतम मिलीग्राम ग्लूटामेट एकाग्रता का निर्धारण नोट: Runtimes प्रयोग पर लेकिन आम तौर पर पिछले 8 घंटा तहत निर्भर है.
  8. दोहराएँ कदम 4.7 में पाए जाने वाले के मिलीग्राम ग्लूटामेट स्तर स्थापित ", कश्मीर ग्लूटामेट अंशांकन" के तहत कश्मीर ग्लूटामेट के लिए 4.2-4.7 कदम.
  9. दोहराएँ कदम 4.8 में पाए जाने वाले कदम 4.7 और कश्मीर ग्लूटामेट स्तर में पाए जाने वाले के मिलीग्राम ग्लूटामेट स्तर स्थापित ", डीटीटी अंशांकन 'के तहत डीटीटी के लिए 4.2-4.7 कदमों नोट:. हम डीटीटी काफी अंत को प्रभावित नहीं करता गयी पाया है कि अभिव्यक्ति के स्तर.
  10. उपयोगतैयार होने के लिए बफर की संरचना निर्धारित करने के लिए 'बफर रचना' के तहत अंशांकन में पाया मूल्यों. उत्पादित कच्चे तेल की सेल निकालने की राशि के आधार पर, एक मास्टर मिश्रण नुस्खा बफ़र्स की एक निर्धारित राशि के लिए उत्पादन किया जाता है.
  11. बर्फ पर मास्टर मिश्रण नुस्खा में सूचीबद्ध के रूप में aliquots पिघलना. एक बार thawed, प्रत्येक आइटम के बाद इसके अलावा बर्फ और vortexing पर रखने, मास्टर मिश्रण तैयार करें.
  12. राशि से विभाज्य के तहत कहा गया है 'बफर रचना. " फ्लैश फ्रीज बफर तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों. Aliquoting, भंवर मुख्य स्टॉक जबकि अक्सर.
  13. एक झरनी का उपयोग तरल नाइट्रोजन से ट्यूबों निकालें और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस सुरक्षा पर स्टोर: सुरक्षात्मक eyewear पहनें; निकालने ट्यूब की टोपी के कारण तरल नाइट्रोजन और कमरे के तापमान तापमान के बीच अंतर को बंद आ सकता है.

5. एक TX-टीएल प्रतिक्रिया की प्रायोगिक निष्पादन

अंतिम प्रतिक्रिया शर्तें हैं: 8.9-9.9 मिलीग्राम / एमएल proteleucine, 1.25 मिमी leucine, 50 मिमी HEPES, 1.5 मिमी एटीपी और सिवाय (कच्चे तेल निकालने से) में, 4.5 मिमी 10.5 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट, 40-160 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 0.33-3.33 मिमी डीटीटी, 1.5 मिमी प्रत्येक अमीनो एसिड जीटीपी, 0.9 मिमी CTP और UTP, 0.2 मिलीग्राम / एमएल tRNA, 0.26 मिमी कोए, 0.33 मिमी NAD, 0.75 मिमी शिविर, 0.068 मिमी folinic एसिड, 1 मिमी spermidine, 30 मिमी 3 पीजीए, 2% खूंटी-8000. एक बुनियादी सीए कच्चे तेल की सेल निकालने, बफर, और डीएनए: टीएल प्रतिक्रिया 3 भागों (ट्यूब) है. अनुपात है: 75% बफर और निकालने, 25% डीएनए प्रतिक्रियाओं मात्रा में भिन्न हो सकते हैं, और हम प्रतिक्रिया मात्रा को कम करने और एक 384 अच्छी तरह से थाली में चल रहा सक्षम करने के लिए सम्मेलन द्वारा 10 μl का उपयोग करें.. बड़ी मात्रा में उचित oxygenation के लिए आंदोलन की आवश्यकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक 10 μl प्रतिक्रिया संचालन करने के लिए, एक पूर्व लिखित टेम्पलेट, TXTL_JoVE.xlsx (पूरक सामग्री 4) का इस्तेमाल करता है. बैंगनी में आइटम उपयोगकर्ता के इनपुट मूल्यों से संकेत मिलता है, और नीले रंग में आइटम प्रतिक्रिया को जोड़ने के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों संकेत मिलता है. हालांकि, एक भी एक प्रतिक्रिया बुद्धि का संचालन कर सकते हैंHout ऊपर उल्लिखित शर्तों प्रतिक्रिया निम्न द्वारा टेम्पलेट.

  1. "सामान्य डेटा" फार्म पूरा करें.
  2. के तहत "मास्टर मिक्स तैयार करना," बैंगनी बॉक्स में 4.1 कदम से निकालने प्रतिशत मान डालें.
  3. "मास्टर मिक्स तैयार" (पंक्तियों 10-17) और "डीएनए की तैयारी" (पंक्तियों 19-50) वर्गों का उपयोग सिलिको में अपना प्रयोग डिज़ाइन. चर "डीएनए की तैयारी" खंड में डाला जा सकता है, जबकि आम तौर पर, स्थिरांक, "मास्टर मिक्स तैयार" खंड में रखा जा सकता है. नमूना वाष्पीकरण और प्रयोगात्मक शुरू समय पूर्वाग्रह से बचने के लिए प्रयोग प्रति नमूनों को छोटा करें. एक नमूना स्थापना के लिए 6 चित्र देखें.
  4. के तहत "मास्टर मिक्स तैयार करना," एक निरंतर एकाग्रता में सभी नमूनों में जाना होगा जो इस तरह के inducers या प्रोटीन के रूप में अभिकर्मकों, जोड़ें. पंक्ति 14 के साथ शुरू, प्रत्येक पंक्ति में एक अभिकर्मक रखने, नीले छायांकित क्षेत्रों को भरें. इकाइयों रिश्तेदार अनुपात रहे हैं.
  5. के तहत "डीएनए तैयार करना," नमूना विशिष्ट हो जाएगा जो डीएनए जोड़ेंआईसी. नमूना सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए आईडी के # # 1 और 2 अनुरूप है, क्रमशः. नमूना आईडी के ऊपर # 3 और उपयोगकर्ता के परिवर्तनीय डीएनए के लिए, एनजी / μl में शेयर एकाग्रता, बेस जोड़े में लंबाई, समुद्री मील में वांछित अंतिम एकाग्रता, और (10 μl प्रतिक्रियाओं का) दोहराता हैं. वांछित अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए शेयर डीएनए की मात्रा स्वतः गणना की है. . n दोहराता की संख्या जहां 10.5 * एन, के लिए पंक्ति रकम भर में कुल नोट: अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 10 μl है, गणना प्रतिक्रिया प्रति 10.5 μl की कुल मात्रा मान, pipetting दौरान खो मात्रा के लिए खाते.
  6. के तहत "डीएनए तैयार करना," अभिकर्मकों या नीले स्तंभों के लिए नमूना विशिष्ट हो जाएगा जो अतिरिक्त डीएनए जोड़ें. नमूना विशिष्ट अभिकर्मकों 10.5 * n की कुल प्रतिक्रिया मात्रा पर आधारित पुस्तिका गणना की आवश्यकता होती है, जबकि समुद्री मील में शेयर डीएनए सांद्रता "डीएनए तैयार करना," के तहत की गणना की जा सकती है. में प्रवेश किया संस्करणों में एक ही पंक्ति के पानी की मात्रा के बाहर घटाया जाता है.
  7. जरूरत numbe निकालें-20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस से बफर, कच्चे तेल की सेल निकालने, और तहत सकारात्मक नियंत्रण के ट्यूब "पिघलना करने के लिए ट्यूबों," आर और बर्फ पर पिघलना.
  8. डीएनए के नमूने तैयार. प्रत्येक नमूना आईडी, विभाज्य बाहर के लिए संकेत डीएनए, पानी, और कमरे के तापमान पर एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में "डीएनए की तैयारी" खंड, प्रति उपयोगकर्ता की आपूर्ति आइटम नोट:. नमूना नुकसान से बचने के लिए, हाल ही में pipets और कम छड़ी calibrated पिपेट सुझाव और सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों सिफारिश कर रहे हैं.
  9. कदम 5.7 से ट्यूब thawed रहे हैं, प्रत्येक आइटम के बाद इसके अलावा बर्फ और vortexing पर रखने, बफर, निकालने, और नारंगी छायांकित बक्से पर आधारित किसी भी वैश्विक उपयोगकर्ता की आपूर्ति आइटम से मिलकर मास्टर मिश्रण तैयार नोट:. निकालें अत्यंत है चिपचिपा. बुलबुले के साथ aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifuging द्वारा हटाया जा सकता है
  10. प्रत्येक डीएनए नमूने लिए "डीएनए की तैयारी" (स्तंभ ओ) के तहत नारंगी कोशिकाओं में संकेत मास्टर मिश्रण की मात्रा को जोड़ें, और कमरे के तापमान पर रखनाture. रिएक्शन शुरू समय के रूप में इस का इलाज.
  11. भंवर प्रत्येक नमूने, और किसी भी अवशिष्ट नमूना नीचे लाने के लिए और बुलबुले को कम करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
  12. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रतिक्रिया का आयोजन करते हैं, तो 29 डिग्री सेल्सियस पर सीधे सेते . अन्यथा, एक 384 अच्छी तरह से थाली में पिपेट नमूना के 10 μl नोट: 10 μl से अधिक से अधिक मात्रा में प्रतिक्रियाओं oxygenation के लिए आंदोलन की आवश्यकता हो सकती.
  13. किसी भी अवशिष्ट नमूना नीचे लाने के लिए और बुलबुले को कम करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4000 XG पर अपकेंद्रित्र थाली. वाष्पीकरण को रोकने के लिए बाद में थाली सील.
  14. 29 डिग्री सेल्सियस नोट पर चलाने के लिए प्रतिक्रिया: Runtimes प्रयोग पर निर्भर करता है, लेकिन आम तौर पर 8 घंटे के तहत पिछले बदलती हैं.

Representative Results

हम TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली आधारित एक अंतर्जात कोलाई की तैयारी के लिए एक पाँच दिन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. कच्चे तेल की सेल निकालने और बफर - - अभिकर्मकों बनाने के लिए एक नमूना समय चित्र 1 में पाया जा सकता है. एक बार बनाया, इन अप करने के लिए एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. अभिकर्मकों बनाया जाता है के बाद, प्रयोगात्मक सेटअप और निष्पादन कम से कम 8 घंटे में किया जा सकता है.

इसके अलावा, हम TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली की अभिव्यक्ति की स्थिति अनुकूलित. ऐसे बफ़र्स या डीएनए समाधान के रूप में अन्य उपयोगकर्ता की आपूर्ति परिवर्धन,, पहले से विषाक्तता के लिए calibrated किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, प्रसंस्करण plasmids के विभिन्न तरीकों की वजह से नमक सामग्री के लिए अलग अभिव्यक्ति में परिणाम. हम भी प्रतिक्रिया दक्षता पर Tris-सीएल क्षालन बफर का प्रभाव (चित्रा 5) का परीक्षण किया.

4.9 को 4.1 कदम की चर्चा करते हुए कच्चे तेल की सेल निकालने अंशांकन, का एक उदाहरण दिखाया गया हैचित्रा -4 ए में. सामान्य में, हमारे प्रयोगों में कच्चे तेल की सेल निकालने कश्मीर ग्लूटामेट स्तरों द्वारा पीछा मिलीग्राम ग्लूटामेट का स्तर, के लिए सबसे ज्यादा संवेदनशील है कि दिखा. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का प्रदर्शन, हम TET दमन के आधार पर एक नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश. 26 (चित्रा 6) का निर्माण और परीक्षण किया गया. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में, के साथ और एटीसी के बिना ही सर्किट रन अभिव्यक्ति के आठ घंटे के बाद deGFP रिपोर्टर की 7 गुना अंत बिंदु अभिव्यक्ति परिवर्तन को दर्शाता है. वे "मास्टर मिक्स तैयार करना." के तहत जोड़ा जा सकता है यदि आवश्यक हो तो इस प्रयोग, वैश्विक inducers या repressors की आवश्यकता नहीं है हालांकि

चित्रा 1
चित्रा 1. कच्चे तेल की सेल निकालने, अमीनो एसिड समाधान, और ऊर्जा समाधान तैयार करने के लिए समय है. एक पांच दिवसीय timelin प्रोटोकॉल का एक विशिष्ट निष्पादन के लिए ई रातोंरात incubations और दिन के समय काम कर रहे कदमों के लिए अनुकूलित किया है, ऊपर दी गई है.

चित्रा 2
चित्रा 2. लागत और कच्चे तेल की सेल के अर्क प्रतिस्पर्धा की अभिव्यक्ति विश्लेषण. एक) TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के श्रम और सामग्री की लागत के टूटने. दिसंबर 2012 के रूप में अभिकर्मकों की लागत, और डॉलर प्रति घंटे 14 वर्ष की श्रम लागत के आधार पर. ख) अन्य वाणिज्यिक प्रणालियों बनाम TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली की लागत की तुलना. प्रतिक्रिया संस्करणों किट प्रति. सी अन्य वाणिज्यिक प्रणालियों बनाम TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली उपज की) तुलना भिन्न हो सकते हैं, हालांकि लागत, μl प्रति टूट रहे हैं. प्रोटीन अभिव्यक्ति उपज निर्माता मानकों के द्वारा निर्धारित की./ 50762fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक मनका पिटाई ट्यूब की लोडिंग और प्रसंस्करण. एक) सेल मनका समाधान का सही चिपचिपाहट का प्रदर्शन. सेल मनका समाधान बर्फ पर खर्च गयी S30A बफर की राशि कहा, मोतियों की राशि, और समय सहित कई कारकों पर निर्भर एक चिपचिपापन होगा. ख) मनका पिटाई ट्यूब का लोड त्वरित टेबलटॉप centrifugation से पहले. Centrifugation के लदान के दौरान एकत्रित बुलबुले को हटा. ग) टेबलटॉप Centrifugation के बाद सरफेसिंग बुलबुले. बुलबुले का आकार अलग अलग होंगे;. वे एक विंदुक टिप डी का उपयोग popped या हटाया जा सकता है) पूरी तरह से भर मनका पिटाई ट्यूब कैपिंग पहले. एक meniscus मनका पिटाई टी में बनाई हैUbe, और टोपी). ई परिपूर्ण करने के लिए ठीक से लोड फिल्टर तंत्र छोटी मात्रा में कवर और के लिए पर्याप्त कारण है. ये सही ढंग बनाम गलत ढंग से संसाधित मनका पिटाई ट्यूब की. च) तुलना पुनः उपयोग किया जा सकता है. बाईं तरफ ट्यूब एक अच्छी तरह से हरा ट्यूब है - यह एक छोटी और अच्छी तरह चित्रित ऊपर परत, और बहुत स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला सुविधाएँ. सही पर ट्यूब बड़ा, धुंधला दूसरी परत और धुंधला सतह पर तैरनेवाला पर आधारित, suboptimal है. Suboptimal हैं कि ट्यूब अतिरिक्त संसाधन नहीं गुजरना चाहिए.

चित्रा 4
चित्रा 4. कच्चे तेल निकालने की तैयारी के गुण. एक) कच्चे तेल की सेल निकालने के लिए विशिष्ट अंशांकन भूखंडों. कच्चे तेल निकालने इसी क्रम में, अतिरिक्त मिलीग्राम ग्लूटामेट, कश्मीर ग्लूटामेट, और डीटीटी स्तरों के लिए calibrated है. समापन बिंदु fluorescenc दिखाया गयाई 8 घंटा, साथ ही एक 12 मिनट चल औसत के आधार पर प्रोटीन के उत्पादन की अधिकतम दर के बाद. इन भूखंडों के आधार पर, अतिरिक्त मिलीग्राम ग्लूटामेट का एक स्वीकार्य सीमा कश्मीर ग्लूटामेट 60-80 मिमी, 4 मिमी है, और डीटीटी 0-3 मिमी है. हर कच्चे तेल निकालने इन तीन चर के लिए स्वतंत्र रूप से calibrated होने की जरूरत है कि ध्यान दें. ख) निकालने की तैयारी से रूपांतर. अलग तारीखों पर तैयार दो कच्चे तेल के अर्क के समापन बिंदु प्रतिदीप्ति दिखाया गया है, त्रुटि सलाखों के अलग अलग दिनों पर तीन स्वतंत्र रन से 1 मानक विचलन कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. अभिव्यक्ति दक्षता पर डीएनए समाधान के प्रभाव. दो अलग शुद्धि के एक) की तुलनाplasmids के प्रसंस्करण के लिए तरीके. PBEST-OR2-or1-पीआर-UTR1-deGFP-T500 के 1 एनएम केवल एक QiaPrep स्पिन Miniprep किट (शोधन विधि 1) या एक Qiaquick पीसीआर शुद्धि किट के साथ बाद संसाधित का उपयोग कर तैयार किया जाता है (शोधन विधि 2). 8 घंटा, साथ ही एक 12 मिनट चल औसत के आधार पर प्रोटीन के उत्पादन की अधिकतम दर के बाद समापन बिंदु प्रतिदीप्ति दिखाया गया है. त्रुटि सलाखों के अलग अलग दिनों पर चार स्वतंत्र रन से 1 मानक विचलन कर रहे हैं. क्षालन बफर के ख) प्रभाव (Tris-सीएल). Tris-सीएल के विभिन्न सांद्रता pBEST-OR2-or1-पीआर-UTR1-deGFP-T500 के 1 एनएम की अभिव्यक्ति पर आधारित एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया में तुलना कर रहे हैं. दी सांद्रता प्रतिक्रिया में Tris-सीएल के अंतिम सांद्रता हैं; इस्तेमाल किया क्षालन बफर 10 मिमी Tris-सीएल है. त्रुटि सलाखों के अलग अलग दिनों पर तीन स्वतंत्र रन से 1 मानक विचलन कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 6. एक नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश का नमूना TX-टीएल रन. एक) नमूना एक सेल मुक्त निष्पादन प्रतिक्रिया के सेटअप. बनाम नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश की "बंद" राज्य, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ. ख) नकारात्मक प्रतिक्रिया पाश की प्लाज्मिड नक्शा. ग) प्रतिनिधि परिणाम "पर" टेस्ट. डेटा एक में प्रयोग दर्शाता है) और ख), नकारात्मक नियंत्रण के साथ संकेत से घटाया. जेनेटिक सर्किट डालने में दिखाया गया. त्रुटि सलाखों के अलग अलग दिनों पर तीन स्वतंत्र रन से 1 मानक विचलन कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

नाम एकाग्रता राशि नसबंदी नोट्स
Chloramphenicol (मुख्यमंत्री) इथेनॉल में 34 मिलीग्राम / मिलीलीटर 1 मिलीलीटर बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन) बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बड़ी मात्रा में बनाया जा सकता है.
2xYT + पी + सेमी अगर प्लेट 31 जी / एल 2xYT, 40 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 22 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार, 34 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol 1 प्लेट आटोक्लेव
2xYT + पी मीडिया 31 जी / एल 2xYT, 40 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 22 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार 4 एल आटोक्लेव

तालिका 1. क्रूड सेल निकालने प्रोटोकॉल के 1 दिन के लिए अभिकर्मकों.

नाम एकाग्रता राशि नसबंदी नोट्स
Tris आधार 2 एम 250 मिलीलीटर बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन) या आटोक्लेव कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
डीटीटी 1 एम 6 मिलीलीटर बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन) बड़ी मात्रा में की गई और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता.
S30A बफर 14 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट, 60 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, 50 मिमी Tris, पीएच 7.7 2 एल आटोक्लेव पीएच 7.7 तक पहुँचने के लिए, एसिटिक एसिड के साथ टाइट्रेट. बस का उपयोग करने से पहले 2 मिमी अंतिम एकाग्रता डीटीटी जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
S30B बफर 14 मिमी मिलीग्राम ग्लूटामेट, 60 मिमी कश्मीर ग्लूटामेट, ~ 5 मिमी Tris, पीएच 8.2 2 एल आटोक्लेव पीएच 8.2 तक पहुंचने के लिए 2M साथ टाइट्रेटTris. बस का उपयोग करने से पहले 1 मिमी अंतिम एकाग्रता डीटीटी जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

तालिका 2. क्रूड सेल निकालने प्रोटोकॉल के 2 दिन के लिए अभिकर्मकों.

बाज़
1 2 3 4
खाली 50 मिलीलीटर फाल्कन (G)
गोली के साथ 50 मिलीलीटर फाल्कन (G)
गोली द्रव्यमान (50 मिलीलीटर गोली के साथ फाल्कन - खाली 50 मिलीलीटर फाल्कन) (जी)
जोड़ने के लिए S30A बफर मात्रा (गोली जन * 0.9) (माले)
जोड़ने के लिए मोती के कुल द्रव्यमान (गोली जन * 5.0) (जी)

तालिका 3. क्रूड सेल निकालने प्रोटोकॉल के 3 दिन के लिए S30A बफर और मनका जन कैलकुलेटर,.

नाम एकाग्रता राशि नसबंदी नोट्स
HEPES 2 एम, पीएच 8 4 मिलीलीटर कोई नहीं पीएच 8 तक पहुँचने के लिए, KOH के साथ टाइट्रेट.
Nucleotide मिक्स 156 मिमी एटीपी और जीटीपी, 94 मिमी CTP और UTP, 7.5 पीएच 1.5 मिलीलीटर कोई नहीं 7.5 पीएच तक पहुँचने के लिए, KOH के साथ टाइट्रेट.
tRNA 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर 600 μl कोई नहीं
कोए 65 मिमी 600 μl कोई नहीं
NAD 175 मिमी, पीएच 7.5-8 300 μl कोई नहीं पीएच 7.5-8 तक पहुँचने के लिए, 2 एम पर Tris साथ टाइट्रेट
शिविर 650 मिमी, पीएच 8 200 μl कोई नहीं पीएच 8 तक पहुँचने के लिए, 2 एम पर Tris साथ टाइट्रेट
Folinic एसिड 33.9 मिमी 300 μl कोई नहीं केवल 300 μl की जरूरत है, पूरक में नुस्खा 1.15 मिलीलीटर के लिए है.
Spermidine 1 एम 150 μl कोई नहीं 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, गर्मी 37 डिग्री सेल्सियस को पिघला करने के लिए.
3 पीजीए 1.4 मीटर, 7.5 पीएच 3.2 मिलीलीटर कोई नहीं 7.5 पीएच तक पहुँचने के लिए, 2 एम पर Tris साथ टाइट्रेट

तालिका 4. ऊर्जा समाधान प्रोटोकॉल के लिए तैयार करने के लिए अभिकर्मकों.

पूरक सामग्री 1. आइटम के लिए व्यंजनों.

Chloramphenicol, 34 मिलीग्राम / एमएल: 0.51 ग्राम chloramphenicol को तैयार है और 15 मिलीग्राम के लिए इथेनॉल जोड़ें. बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन), 1 मिलीलीटर ट्यूबों, बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए विभाज्य.

2xYT + पी + सेमी अगर प्लेट: 1.24 ग्राम 2xYT, 1 एम @ 1.6 मिलीग्राम पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय समाधान, 40 एमएल के लिए 1 एम @ 0.88 मिलीग्राम पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार समाधान, 0.6 ग्राम अगर, और पानी तैयार करें. आटोक्लेव. 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करते हैं और 40 μl सेमी जोड़ें. विभाज्य 25 एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में मिलीलीटर, और एक घंटे के लिए शांत करते हैं.

2xYT + पी मीडिया: 124 ग्राम 2xYT, 1 एम @ 160 मिलीग्राम पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय समाधान, 4 एल Aliqu को 1 एम, और पानी @ 88 मिलीग्राम पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार समाधान तैयार2 एक्स 1.88 एल और 0.24 एल आटोक्लेव में बाहर ओ.टी..

Tris आधार, 2 एम: 250 मिलीलीटर के लिए 60.57 ग्राम Tris आधार और पानी तैयार करें. बाद में उपयोग के लिए आरटी पर, दुकान जीवाणुरहित.

डीटीटी, 1 एम: 15 मिलीलीटर के लिए 2.31 ​​जी डीटीटी और पानी तैयार करें. बाँझ फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन), 1 मिलीलीटर ट्यूबों, बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए विभाज्य.

S30A बफर: 10.88 ग्राम मिलीग्राम ग्लूटामेट और 24.39 ग्राम कश्मीर ग्लूटामेट, 2M (पीएच 7.7) एसिटिक एसिड के 50 एमएल Tris तैयार करें, और पानी 2 एल आटोक्लेव के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान, 4 एमएल 1 एम डीटीटी जोड़ उपयोग करने से पहले.

S30B बफर: 10.88 ग्राम मिलीग्राम ग्लूटामेट और 24.39 ग्राम कश्मीर ग्लूटामेट, 2 एम Tris (पीएच 8.2) तैयार करें, और पानी 2 एल आटोक्लेव के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान, उपयोग करने से पहले 2 मिलीलीटर 1 एम डीटीटी जोड़ें.

HEPES: 1.91 ग्राम HEPES (मेगावाट 238.21), KOH (पीएच 8 तक) तैयार करें, और पानी 4 मिलीलीटर.

tRNA: 600 μl 30 tRNA के मिलीग्राम और पानी तैयार करें.

सीओए: 600 μl 30 सीओए (मेगावाट 767.53) की मिलीग्राम और पानी तैयार करें.

NAD: 300 μl के लिए (पीएच 7.5-8 लिए) Nad के 34.83 मिलीग्राम (मेगावाट 663.43), 2 एम Tris जोड़ें, और पानी. (पीएच 7.5-8 का हल लाने के लिए 2 एम Tris के 27 μl जोड़ें).

शिविर: 200 μl को 42.80 शिविर का मिलीग्राम (मेगावाट 329.22), 2 एम (पीएच 8 तक) में Tris, और पानी जोड़ें. (पीएच 8 का हल लाने के लिए 2 एम Tris 73 μl जोड़ें).

Folinic एसिड (33.9 मिमी): ठोस folinic एसिड कैल्शियम नमक (मेगावाट 511.5) के 20 मिलीग्राम, 1.15 मिलीलीटर पानी जोड़ें.

Spermidine: 150 μl को 23.55 spermidine के μl (मेगावाट 145.25) और पानी तैयार करें. 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्षेप में पिघलने के बाद कमरे के तापमान पर तैयार करें
3 पीजीए: 3.2 मिलीलीटर 1.03 3 पीजीए (मेगावाट 230.02) के जी, (पीएच 7.5) 2 एम Tris, और पानी जोड़ें. (पीएच 7.5 का हल लाने के लिए 2 एम Tris के 1.73 मिलीलीटर जोड़ें).

Nucleotआईडीई मिक्स: एटीपी Dipotassium नमक dihydrate के 145 मिलीग्राम (मेगावाट 619.4), जीटीपी disodium नमक के 133 मिलीग्राम (मेगावाट 567.14), CTP disodium नमक dihydrate के 79.4 मिलीग्राम (मेगावाट 563.16), UTP trisodium नमक dihydrate के 82.6 मिलीग्राम (मेगावाट 586.12) जोड़ें , 1.5 मिलीग्राम के लिए 15% कमजोर पड़ने (पीएच 7.5), और पानी में KOH. (पीएच 7.5 का हल लाने के लिए 15% कमजोर पड़ने पर KOH के 353 μl जोड़ें).

पूरक सामग्री 2. ब्रैडफोर्ड परख.

  1. 4 डिग्री सेल्सियस से ब्रैडफोर्ड एजेंट निकालें और कमरे के तापमान पर सेट करें.
  2. 1 मिलीग्राम / एमएल और 0.1 मिलीग्राम / एमएल के 50 μl बीएसए मानक तैयार करें.
  3. कदम 1.47 से निकालने के 40 μl 20x कमजोर पड़ने को तैयार है.
  4. 7 cuvettes के लिए 800 μl पानी जोड़ें.
  5. 0 मिलीग्राम / एमएल, 1 मिलीग्राम / एमएल (10 μl 0.1 मिलीग्राम / एमएल BSA), 2 मिलीग्राम / एमएल (20 μl 0.1 मिलीग्राम / एमएल BSA), 4 मिलीग्राम / एमएल (4 μl 1 मिलीग्राम / एमएल BSA) के लिए मानक cuvettes तैयार करें , 6 मिलीग्राम / एमएल (6 μl 1 मिलीग्राम / एमएल BSA).
  6. नमूना के 2 μl और नमूना के 4 μl के लिए प्रयोगात्मक cuvettes तैयार करें.
  7. प्रत्येक क्युवेट को ब्रैडफोर्ड एजेंट के 200 μl जोड़ें और प्रसारण खैर मिश्रणY pipetting. कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  8. कदम 6.5 से cuvettes का उपयोग आयुध डिपो 595 एनएम पर मानक वक्र उत्पादन. मानक वक्र अस्वीकार करते हैं आर 2 <0.95.
  9. कदम 6.6 से cuvettes का उपयोग आयुध डिपो 595 एनएम पर निकालने एकाग्रता का निर्धारण.

पूरक सामग्री 3. अंशांकन स्प्रेडशीट बफर.

TXTL_e (टेम्पलेट) _calibration_JoVE.xlsx देखें .

पूरक सामग्री 4. सेल मुक्त अभिव्यक्ति स्प्रेडशीट चलाते हैं.

TXTL _JoVE.xlsx देखें .

Discussion

यहाँ वर्णित अंतर्जात कोलाई आधारित TX-टीएल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली डेटा संग्रह करने के लिए सेट से कम से कम आठ घंटे लग सकते हैं कि एक आसान से रन तीन ट्यूब प्रतिक्रिया है. सभी अभिकर्मकों बनाने की प्रक्रिया पांच दिन का समय कुल (केवल एक दिन पर महत्वपूर्ण श्रम आवश्यकताओं के साथ) की आवश्यकता है, लेकिन 3,000 प्रतिक्रियाओं के लिए कच्चे तेल निकालने का उत्पादन और बफर बनाने 10,000 प्रतिक्रियाओं के लिए अभिकर्मकों (चित्रा 1). इसके अलावा, कच्चे तेल निकालने और बफर बनाने अभिकर्मकों एक तैयारी के कई उपयोगों के लिए अनुमति देता है, -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 साल के लिए स्थिर रहे हैं. 4 10 μl प्रतिक्रिया $ 0.11 प्रति (श्रम सहित $ 0.26) पर लागत तुलना 98% से कम कर रहे हैं वाणिज्यिक प्रणालियों (चित्रा 2).

कुछ अनसुलझे सीमाओं व्यवस्था करने के लिए, हालांकि, कर रहे हैं. प्रत्येक कच्चे तेल की सेल निकालने की तैयारी के अंत दक्षता, उपयोगकर्ता प्रवीणता पर और पर्यावरण की स्थिति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, हालांकि टीypical उपज भिन्नता 5-10% (चित्रा 4 बी) के बीच है. नतीजतन, दोनों अंत बिंदु अभिव्यक्ति में और अभिव्यक्ति की गतिशीलता में बैच को बैच परिवर्तनशीलता उम्मीद की जानी हैं. निकालने निर्माण पूरी तरह से स्वचालित है जब तक निकालने पूरी तरह से विशेषता या है जब तक इन बदलावों की संभावना बनी रहेगी. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली संवेदनशील मात्रात्मक प्रयोगों का संचालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो यह कच्चे तेल की सेल निकालने का एक ही बैच के साथ सभी प्रयोगों को चलाने के लिए उचित है. एक भी कच्चे तेल की सेल निकालने बैच, के बारे में 3000 प्रतिक्रियाओं से उपज ठेठ प्रयोगात्मक पाठ्यक्रमों के लिए पर्याप्त होना चाहिए. हम विभिन्नता को स्केलिंग और प्रक्रिया स्वचालित द्वारा हटाया जा सकता है पर शक हालांकि, इस तरह के प्रयास पर्याप्त संसाधन निवेश शामिल होगा.

अंत बिंदु अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए काफी आसान कर रहे हैं, हालांकि इसके साथ ही, और अधिक काम सेल मुक्त प्रणाली के लिए आंतरिक समझ गतिशीलता में किया जाना चाहिए. यह ज्ञात है कि संसाधन competitio दोनोंn और संसाधन सीमा अभिव्यक्ति की गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, सीमित अंतर्जात सिग्मा 70. 9,27 हालांकि, गतिशीलता पूरी तरह से प्रणाली का उपयोग करने के लिए समझा जा नहीं करना पड़ेगा वृद्धि की डीएनए टेम्पलेट न्यूक्लियोटाइड या अमीनो एसिड की कमी के उस के अनुरूप एक अभिव्यक्ति प्रोफाइल के उत्पादन के साथ एक saturating शासन में परिणाम कर सकते हैं. उपज की शुद्ध वृद्धि के लिए, अनुकूलन मशीन सीखने के दृष्टिकोण से किया जा सकता है. संसाधन प्रतियोगिता और सीमा के 28 प्रश्न प्रयोगात्मक डेटा का उपयोग कर सत्यापित गणितीय मॉडल से संबोधित किया जा सकता है.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक BL21-Rosetta2 तनाव के लिए अनुकूलित किया है, लेकिन अन्य ई. को generalizable है कोलाई उपभेदों. ऐसे जीन एन्कोडिंग लंदन प्रोटीज और दुर्लभ tRNAs जीन एन्कोडिंग के अलावा को हटाने के रूप में BL21-Rosetta2 में संशोधन, अधिक से अधिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं. हम दो अन्य निकालने उपभेदों के साथ प्रोटोकॉल का प्रयास किया है - केवल BL21 और एक BL21 trxA पीटकर-एकडी में 50% कम प्रोटीन उपज पाया. हम अन्य उपभेदों का उपयोग करते समय पैदावार इसी कमी परिकल्पना है कि. ऐसे लेग और अन्य अमीर बतख के लिए 2xYT मध्यम विकास स्विचन के रूप में मानकों, में अन्य परिवर्तन कमी आई है, प्रोटीन उपज में हुई है.

अंतर्जात और exogenous प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी और विनियमन तंत्र दोनों का उपयोग सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों प्रोटीन और metabolite अभिव्यक्ति दोनों में और सिंथेटिक जीव विज्ञान में व्यापक आवेदन किया है. इसके बजाय T7 विनियमित सर्किट को सीमित किया जा रहा है, एक जटिल biomolecules उत्पादन की कल्पना कर सकते हैं 3,29 देशी ई. का एक मिश्रण का उपयोग कर एक उपयोगकर्ता चलाया सेटिंग में कोली प्रमोटरों और exogenously आपूर्ति प्रतिलेखन और विनियमन तंत्र. कोशिका विभाजन और चयापचय की सीमाओं के बिना, इस तरह के repressilator या ऐसे उन उत्पादन आर्टीमिसिनिन के रूप में चयापचय इंजीनियर रास्ते में ही सिंथेटिक सर्किट में परिवर्तनशीलता कम या बेहतर समझा जा सकता है. 30,31 हम हवलदारई आनुवंशिक स्विच को लागू करने के लिए, साथ ही सिग्मा कारक ज़ब्ती समझने के लिए इन फायदों का इस्तेमाल किया 9,32 इस तरह की तकनीक भी "कम से कम" या "कृत्रिम" कोशिकाओं की रीढ़ फार्म कर सकते हैं. - छोटे, अच्छी तरह से विशेषता और आत्मनिर्भर सन्निहित इकाइयों निकालने. 33,34

अंत में, हम सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक प्रोटोटाइप वातावरण के रूप में इस अंतर्जात सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का तत्काल उपयोग करता है आशा. बुनियादी प्लाज्मिड, रैखिक, या रासायनिक synthetized डीएनए परीक्षण के चक्र का पालन - उपनाम "TX-टीएल biomolecular breadboard," सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली प्रोटोटाइप के दौर से गुजरना कर सकते सिंथेटिक सर्किट अंततः vivo में अभिव्यक्ति के लिए किस्मत में जहां एक चलाया हुआ वातावरण प्रदान करता है विश्लेषण और तेजी से संशोधन के द्वारा. प्रोटोटाइप दौर वर्तमान में विकसित किया जा रहा है भविष्य कहनेवाला गणितीय मॉडलों के द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है. क्लोनिंग और गैर अंतिम सर्किट के लिए विवो हेरफेर में दूर करके, हम इंजीनियरों की आशाneering समय चक्र के बजाय मौजूदा सप्ताह 'मानक के 1-3 दिनों तक कम किया जा सकता.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम इस परियोजना के प्रारंभिक दौर में सहायता के लिए Jongmin किम, दान Siegal-Gaskins, अनु Thubagere, और प्रोटोकॉल को व्यवस्थित बनाने के सहायता के लिए हनोक Yeung, और क्लेयर चेन और बार्कले ली धन्यवाद. इस सामग्री के रहने ढलाई कार्यक्रम, अनुबंध संख्या HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS भी एक यूसीएलए / कैलटेक चिकित्सा वैज्ञानिक द्वारा समर्थित है रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (DARPA / एमटीओ) द्वारा भाग में समर्थित काम पर आधारित है प्रशिक्षण कार्यक्रम फैलोशिप और से एक DoD, वैज्ञानिक अनुसंधान, राष्ट्रीय सुरक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग में स्नातक (NDSEG) फैलोशिप, 32 सीएफआर 168a की वायु सेना के कार्यालय. इस दस्तावेज़ में निहित विचारों और निष्कर्ष लेखकों के हैं और प्रतिनिधित्व के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए आधिकारिक तौर पर नीतियों, या तो स्पष्ट या निहित, रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी या अमेरिकी सरकार की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT MP biomedicals 3012-032  
3-PGA Sigma-Aldrich P8877  
ATP Sigma-Aldrich A8937  
Bacto-agar BD Diagnostics 214010  
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) BioSpec 522S  
Beads, 0.1mm dia. BioSpec 11079101  
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Novagen 71402  
Bradford BSA Protein Assay Kit Bio-rad 500-0201  
cAMP Sigma-Aldrich A9501  
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919  
CoA Sigma-Aldrich C4282  
CTP USB 14121  
Cuvettes, 1.5ml Fisher 14-955-127  
DTT Sigma-Aldrich D0632  
Folinic acid Sigma-Aldrich F7878  
GTP USB 16800  
HEPES Sigma-Aldrich H6147  
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149  
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605  
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 732-6204  
NAD Sigma-Aldrich N6522  
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo-Scientific 142761  
Nunc sealing tape Thermo-Scientific 232701  
PEG-8000 Promega V3011  
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich P8584  
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich P8709  
RTS Amino Acid Sampler 5 Prime 2401530  
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo-Scientific 66382  
Spermidine Sigma-Aldrich 85558  
Tris base Fischer BP1521  
tRNA (from E. coli) Roche Applied Science MRE600  
UTP USB 23160  
1L Centrifuge Bottle Beckman-Coulter A98813 This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.
4L Erlenmeyer Flask Kimble Chase 26500-4000  
Avanti J-26XP Centrifuge Beckman-Coulter 393127 Or 1L-capable centrifuge equivalent.
Forma 480 Orbital Shaker Thermo Scientific 480 Or chest-size 6x4L shaker equivalent.
JLA-8.1000 Rotor Beckman-Coulter 363688 Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.
Mini-Beadbeater-1 BioSpec 3110BX  
Supplemental Material 1. Recipes for Items.
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use.
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour.
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave.
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use.
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use.
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use.
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use.
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml.
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl.
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl.
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8).
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8).
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water.
Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C.
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5).
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5).
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
  1. Remove Bradford agent from 4 °C and set at room temperature.
  2. Prepare 50 μl BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.
  3. Prepare 40 μl 20x dilution of extract from step 1.47.
  4. Add 800 μl water to 7 cuvettes.
  5. Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA).
  6. Prepare experimental cuvettes for 2 μl of sample and 4 μl of sample.
  7. Add 200 μl of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.
  8. Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 < 0.95.
  9. Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet.
See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx.
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet.
See TXTL _JoVE.xlsx.

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References

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