Summary
Denne fem-dages-protokollen skitserer alle trin, udstyr og supplerende software er nødvendig for at skabe og drive en effektiv endogent Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit udtryk system fra bunden. Med reagenser, protokollen tager 8 timer eller mindre til opsætning af en reaktions, indsamle og behandle data.
Abstract
Ideelle cellefrie ekspressionssystemer kan teoretisk efterligne en in vivo cellulære miljø i et kontrolleret in vitro platform. 1. Dette er nyttigt til ekspression af proteiner og genetiske kredsløb på en kontrolleret måde, samt til at tilvejebringe en prototyping miljø for syntetisk biologi. 2,3 For at nå sidstnævnte mål, celle-fri ekspressionssystemer der bevarer endogene Escherichia coli transskription-oversættelse mekanismer er i stand til mere præcist afspejler in vivo cellulære dynamik end dem baseret på T7 RNA-polymerase transkription. Vi beskriver forberedelsen og gennemførelsen af en effektiv endogent E. coli baseret transkription-translation (TX-TL) celle-frie udtryk, der kan producere tilsvarende mængder af protein som T7-baserede systemer til en omkostningsreduktion 98% til tilsvarende kommercielle systemer. 4,5 Udarbejdelsen af buffere og rå celle-ekstrakt er beskrevet, samt udførelsen af entre rør TX-TL-reaktion. Hele protokol tager fem dage til at forberede og giver nok materiale til op til 3000 enkelt reaktioner i et præparat. Når forberedt, hver reaktion tager under 8 timer fra setup til indsamling og analyse af data. Reguleringsmekanismer og transskription eksogene til E. coli, såsom lac / tet repressorer og T7-RNA-polymerase, kan suppleres. 6 Endogene egenskaber, såsom mRNA og DNA nedbrydningshastigheder kan også justeres. 7 TX-TL cellefrit ekspressionssystem er blevet demonstreret i stor skala kredsløb samling, udforske biologiske fænomener, og ekspression af proteiner under både T7-og endogene promotorer. 6,8 Ledsageforanstaltninger matematiske modeller er til rådighed. 9,10 Den resulterende system har unikke applikationer i syntetisk biologi som en prototyping miljø eller "TX- TL biomolekylære breadboard. "
Introduction
Celle-ytringsfriheden teknologi begyndte i 1950'erne som rent translationel, fremrykkende år senere til at omfatte koblet transkription-translationsmekanismer hjælp T7 bakteriofag DNA. 11,12 Siden da er der blevet gjort mange bestræbelser på at optimere skabelsen af rå celle ekstrakt (eller E coli. S30-ekstrakt). 13,14 Disse optimeringer omfatter forlænge celle-fri proteinsyntese ATP regenerering eller stamme ændringer igennem, og reducere protokol tid og omkostninger. findes 15-17 Alternative celle-frie udtryk, som bruger rekonstitueret komponenter i stedet for rå celle ekstrakt til udtryk. 5. Begge rå celle ekstrakt og rekonstituering metoder er blevet udviklet til kommerciel brug.
Med fremkomsten af syntetisk biologi, er der et øget behov for en velkarakteriseret platform til at teste og udtrykke manipuleret biologiske moduler og kredsløb. 18,19 Denne platform skal værealsidig, godt karakteriseret, enkel at manipulere, og fokuserede på bruger-leverede komponenter. Trods at blive udviklet et halvt århundrede tidligere, cellefrie systemer baseret på E. coli uløseligt deler disse krav, da de er en forenklet in vitro fremstilling af cellulære processer uden kompleksiteten af vækst og metabolisme. Derudover alle de grundlæggende viden fra in vivo arbejde på E. coli gælder umiddelbart til E. coli cellefrie systemer.
Selvom celle-fri ekspressionssystemer kan have applikationer i syntetisk biologi til dato målet for de fleste celle-fri ekspressionssystemer har været maksimering af protein og metabolit udbytte. Dette opnås ved anvendelse af T7-bakteriofag transskription af sekvenser drevet af T7 promotorer. 20. Selv om udtrykket er effektiv og robust disse systemer tjener et højt specialiseret formål. Cell reguleringsmetoder er begrænsede, skal mål-DNA skabeloner værereengineered at omfatte T7 initiativtagere, og visse sekvenser, såsom ribosomale komplekser kan ikke transkriberet og samles. 21,22 Eksisterende celle-fri ekspressionssystemer er i stand til at opretholde høje udbytter, mens endogene reguleringsmekanismer, en alsidighed er nødvendig for syntetisk biologi bevare.
Vi har udviklet en endogen E. coli celle-frie udtryk, der bevarer effektiviteten af protein udtryk demonstreret ved tidligere systemer, men tilføjer yderligere alsidighed ved at tillade ekspression og regulering baseret på både endogene og eksogene (T7 eller andre) mekanismer. Den her beskrevne protokol er oprindeligt baseret på Kigawa et al. (2004) og Liu et al. (2005), men har væsentlige ændringer. Det udnytter Mg-og K-glutamat i Mg-og K-acetat for øget effektivitet, fjerner 2-mercaptoethanol, og lyserer celler under anvendelse af en perle-piskeris. 17,23,24 Perle-bankende er valgt frem homogeniseringtrykbaserede metoder eller lydbehandling på grund af sin lavere omkostninger og sammenlignelige udbytter til konkurrerende systemer. 23. 3-phosphoglyceric-(3-PGA) anvendes som energikilde da det blev fundet at give overlegen proteinudbytter forhold til creatinphosphat og phosphoenolpyruvat. 4,25 Vores system kan producere op til 0,75 mg / ml reporter protein under anvendelse af enten en sigma70 baseret promotor med lambda-fag-operatører eller en T7-drevet promotor, svarende til udbyttet fra andre kommercielle systemer. 4,6 Fem dage er forpligtet til at producere alle nødvendige reagenser (Figur 1). Desuden giver en reduktion 98% af omkostningerne i forhold til sammenlignelige kommercielle celle-fri systemer - materialeomkostninger er $ 0,11 per 10 ul reaktion, der stiger til $ 0,26 med arbejdskraft inkluderet (figur 2).
Protocol
1.. Rå celleekstrakt Fremstilling
Forberedelse rå celle ekstrakt over tre dage kræver to personer til at udføre effektivt. Protokollen består funktionelt af tre dele: vækst kultur (trin 1.1 til trin 1.11), cellelyse (trin 1.12 til trin 1.37), og pak afklaring (trin 1.38 til trin 1,52). Den præsenteres opdelt i dage for bekvemmelighed. Ideel ekstrakt kan producere 0,75 mg / ml deGFP fra plasmid pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), og har en rå celleekstrakt koncentration mellem 27-30 mg / ml protein. 4. Dog varierer ekstrakt egenskaber fra parti til parti. Følgende opskrift leverer nok til cirka 3.000 enlige reaktioner (6 ml rå celle ekstrakt). Hvis skalering ned, anbefales det at bruge ikke mindre end 1/6 af værdier her. På grund af tidspres, er skalering op ikke anbefales.
Dag 1
- Forbered bakteriekultur medier, kulturtur plade, og medier kosttilskud som beskrevet i tabel 1.. Se supplerende materiale 1 for opskrifter.
- Bemærk streak BL21-Rosetta2 stamme fra -80 ° C på en 2xYT + P + Cm agarplade og inkuberes i mindst 15 timer ved 37 ° C eller indtil kolonier er synlige:. Chloramphenicol (Cm) anvendes til at selektere for et plasmid koder sjældne tRNA'er i BL21-Rosetta2 stamme.
Dag 2
- Forbered buffere og kosttilskud som beskrevet i tabel 2. Se supplerende materiale 1 for opskrifter.
- Og steriliseres nødvendige materialer til dag 3, herunder: 6 x 4 L Erlenmeyer-kolber med aluminiumsfolie dæksel (autoklaveret), 4 x 1 L sterile centrifugerør, tragten (autoklaveret), 100 g 0,1 mm glasperler (autoklaveret), 2 røre-stænger (autoklaveret), 1 L og 500 ml måleglas (autoklaveret), 2 x 1 L bægre (autoklaveres), 3 ml sprøjte med 18 g nåle (steril), 2-3 flhavre bøjer, 2-3 10k MWCO dialyse kassetter (steril), kuvetter.
- Forbered mini-kultur 1. Tilsæt 4 ml 2xYT + P medier og 4 pi Cm til en 12 ml steril kultur rør og præ-opvarmes til 37 ° C i 30 minutter.
- Podes mini-kultur 1 med en koloni fra 2xYT + P + Cm agarplade. Inkuber ved 220 rpm, 37 ° C i 8 timer.
- 7 timer og 30 min senere, forberede mini-kultur 2. Der tilsættes 50 ml 2 x YT + P medier og 50 pi Cm til en steril 250 ml Erlenmeyer-kolbe og præ-opvarmes til 37 ° C i 30 minutter.
- Podes mini-kultur 2 med 100 pi af mini-kultur 1 og inkuberes ved 220 opm, 37 ° C i 8 timer.
Dag 3
- Fire tomme sterile 50 ml Falcon rør og rekord masse afvejes i tabel 3. Chill Falcon-rør på is, og disse vil efterfølgende anvendes i trin 1.18.
- 7 timer og 30 minutter efter trin 1.8, forberede den endelige bakteriekultur medier. Ved hjælp af en steril 1 L måleglas, overførsel 660 ml 2xYT + P medier into hver af seks 4 L Erlenmeyerkolber og præ-varm til 37 ° C i 30 min Bemærk:. 4 L eller større Erlenmeyerkolber anbefales for korrekt beluftning.
- Tilføj 6,6 ml mini-kultur 2 i hver 4 L Erlenmeyer kolbe. Inkuber ved 220 rpm, 37 ° C, indtil kulturen når en OD på 1,5-2,0 ved 600 nm (svarende til midten af log-vækstfase). Check OD jævnligt med en 1:10 kultur fortynding for nøjagtighed Dette trin bør ikke tage mere end 3 timer - 3 timer 45 min. Hurtig vækst og samling i midten af log-fasen er kritisk for ekstrakt kvalitet.
- Umiddelbart efter vækst, overføre alle kulturer ligeligt i fire 1 L centrifugeflasker og centrifugeres ved 5000 xg i 12 min ved 4 ° C for at pelletere bakterieceller.
- Mens centrifugering komplet S30A til ITU buffer forberedelse ved at tilsætte 4 ml 1 M DTT til 2 L af tidligere fremstillede S30A til ITU. Mix og vedligeholde buffer på is.
- Når centrifugering er færdig, helt at fjerne supernatanten fra trin 1.12 af decanting og duppe centrifugeflasker på en steril køkkenrulle.
- 200 ml S30A til ITU-buffer ved 4 ° C for hver af de fire centrifugerør og ryste flaskerne kraftigt, indtil pellet fuldstændigt solubiliseret med nogen resterende klumper. Centrifuger de fire flasker ved 5.000 g i 12 min ved 4 ° C.
- Helt fjerne supernatant fra forrige trin ved dekantering og duppe centrifugeflasker på en steril køkkenrulle.
- Gentag trin 1.15 og 1.16.
- Tilsæt 40 ml S30A til ITU-buffer ved 4 ° C for hver centrifuge-flaske. . Overfør hver pellet og S30A til ITU kombination i et afkølet Falcon rør fra 1,9) Bemærk: Dette trin er at overføre pillerne i en mindre beholder.
- Centrifuger Falcon-rør ved 2000 g i 8 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved dekantering.
- Re-centrifuge Falcon-rør ved 2.000 g i 2 minutter ved 4 ° C. Helt fjerne tilbageværende supernatant med pipette. Hold på is.
- F afvejesvores Falcon rør med pellet og optage masse i tabel 3. Beregn pellet masse, S30A til ITU buffervolumen nødvendigt, og masse af perler, der er nødvendige på grundlag af de specifikke formler i tabel 3.
- Korrekt lastning og perle bankende af pelleten er afgørende for at gøre kvaliteten ekstrakt, og er den mest udfordrende trin. Det anbefales at gennemgå videoen, før du forsøger. Manglende undgå luftbobler og distribuere perler jævnt vil resultere i ineffektiv ekstrakt.
- Føj mængden af S30A til ITU buffer beregnet i tabel 3 til hvert Falcon rør, vortex indtil homogen, og vende tilbage til isen.
- Mens de øvrige Falcon-rør på is, tilsættes perlerne intermitterende til en enkelt Falcon-rør i tre portioner, hver under anvendelse af 1/3 af den samlede perlerne. Efter tilsætning af hver alikvot af perler, vortex for 30 sec. Placer Falcon rør på is mellem vortex trin og efter den endelige vortex. Når der tilsættes sidste portion, sikreperler er ensartet fordelt. En tyk pasta skal formes.
- Der fremstilles en 5 ml (volumen) pipettespids ved at afskære enden ved hjælp af et sterilt barberblad til at skabe en 3-4 mm åbning. Dial pipette til 2 ml Bemærk: Forskellige pipette sæt og tips giver forskellige mængder af sug, som måske ikke være tilstrækkeligt til at trække og slippe tyk perle-celle løsning; en 1 ml pipette spids med enden fjernet kan bruges i stedet..
- Placer 20 perle-beating rør på is.
- Kontroller høje viskositet af celle-kugle-løsning ved hjælp af modificeret pipette. Det bør være tyktflydende til det punkt på knap afslutter pipettespidsen under udkastning. Hvis der er for tyktflydende, re-justere pipettespids ifølge trin 1.25. Hvis det ikke er tyktflydende nok, kan perler tilsættes i trin på (pellet masse * 0,05), til en maksimal masse på (pellet masse * 5.1). Efter hver tilsætning af perler, vortex for 30 sec og vende tilbage til is. Se figur 3a for en demonstration af viskositet.
- Fjern perle-celle løsning fra Falcon rør ved hjælp af modificeret pipette, og overføres til en steril perle-slå rør, udfylde det tre fjerdedele fulde med perle-celle løsning. Spin ekstremt kortvarig (1s) en kontra mini-centrifuge for at fjerne luftbobler uden omfordeling af perlerne. Se figur 3b-d til stillbilleder af perle-bankende rør belastning.
- Færdig med at tilføje perle-celle til dannelse af en konkav menisken.
- Tilføj en meget lille dråbe perle-celle løsning på indersiden af en perle-slå rør cap, være omhyggelig med at ikke hindre udenfor læbe af hætten, ellers ikke den perle-slå rør tæt sufficientl y. Tryk hætten på en flad overflade, og kontrollere, at der ikke er luftbobler i bunden af hætten.
- Cap perle-slå røret med den perle-slå hætten fra det foregående trin. Hånd til assistent for perle slå. Hvis det gøres korrekt, bør hætten være tæt forseglet, luftbobler skuldred være synlige og lidt (hvis nogen) perle-celle-opløsning skal flyde. Redo lastningen, hvis luftbobler er synlige eller hætten ikke helt tæt på.
- Vortex Falcon-rør fra trin 1.24 de resterende perle-celle-løsning til at sikre en ensartet fordeling af perlerne. Gentag trin 1,28-1,31 indtil Falcon rør er tom, og gentag derefter trin 1,24-1,31 for hver ekstra Falcon rør.
- Conduct trin 1,33-1,38 samtidigt. Har assistent take fyldt perle-slå rør fra 1.31 og sted på is. Når to fyldte perle-slå rør er blevet indsamlet og har været på is i mindst et minut, begynder perle slå.
- Pisk det ene rør i 30 sek ved 46 rpm. Placer hovedet på is i 30 sek, mens slå det andet rør.
- Gentag forrige trin, sådan at hver fyldt perle-slå rør er beat for 1 min total.
- Gentag trin 1,33-1,35 indtil 8 fyldte perle-beating rør (eller det maksimale beløb centrifugen kan rumme) have blevet behandlet. Derefter konstruere apparater filter fra 15 ml Falcon (figur 3e). Tilføj en ny perle-slå cap, flad del opad, til bunden af et 15 ml Falcon. Fjern derefter hætten fra forarbejdet perle-slå røret og trykke mikro-kromatografisøjlen fast på enden af forarbejdede perle-slå rør indtil den er helt lukket. Bræk eluering ende af mikro-kromatografikolonne, og placere mikro-kromatografisøjle eluering ende ned, ind i tomme perle-beading rør. Placer dette kompleks i 15 ml Falcon. Gentag for alle 8 fyldte perle-slå rør, holde på is, når færdig.
- Centrifuge 8 filtrer apparaturer Falcon-rør ikke-reducerede, ved 6.000 g i 5 minutter ved 4 ° C for at adskille ekstrakt og pellet fra perlerne.
- Kontroller hver perle-bankende rør har produceret levedygtig ekstrakt. Korrekt stolpen ekstrakt bliver ikke uklar, og pelleten har to adskilte lag. Kassér alle uklare rør og overføre supernatanten fra ikke-uklare rør into individuelle 1,75 ml mikro-centrifugeglas, idet så lidt pellet som muligt. Hold på is, indtil alle perle-slå rør er blevet behandlet. Se figur 3f sammenligne en korrekt vs forkert behandlet perle-bankende rør.
- Centrifuge mikrocentrifugerør fra foregående trin ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C.
- Overførsel pille-fri supernatant til tomme perle-beating rør ved hjælp af en pipette, konsolidere 500 pi ind i en ny perle-slå rør.
- Inkubér foregående trin, med perle-slå caps fjernet, ved 220 rpm, 37 ° C i 80 min. Dette trin fordøjer resterende nukleinsyrer ved hjælp af endogene exonucleaser frigives under perle-beading, og det kan gøres ved at stå perlen-slå rør i en vævskultur rør.
- Forbered dialyse materialer. Komplet S30B forberedelse buffer ved tilsætning af 2 ml 1 M DTT til 2 L af tidligere fremstillede S30B. Der blandes og tilsættes 900 ml i hver af to sterile 1 l bægre. Tilføj steril magnetomrører i hvert bæger, holder ved 4 ° C.
- Efter trin 1.41, bør ekstrakt se uklar. Konsolidere ekstrakt i 1,5 ml alikvoter i 1,75 ml mikro-centrifugerør og centrifugeres ved 12000 g i 10 min ved 4 ° C.
- Ved hjælp af en pipette, konsolidere pille-fri supernatant i 15 ml Falcon rør på is, og bland godt ved capping røret og invertere. Spar 10 ul supernatant på is for trin 1.47.
- Bestem samlede ekstrakt fremstillet, og fugter det nødvendige antal 10k MWCO dialyse kassetter ved submersing i S30B i 2 min, under forudsætning af 2,5 ml ekstrakt per kassette.
- Load kassetter med 2,5 ml ekstrakt. Hvert bæger kan tage op til 2 kassetter, dialyse, omrøring, ved 4 ° C i 3 timer Bemærk: delvis indlæsning af kassetter er acceptabel.. Dialyserende øger proteinproduktion udbytte.
- Under det foregående trin, karakterisere ekstrakt-proteinfusion med Bradford assay, ved hjælp af ekstrakt gemte i trin 1.44. Se supplerende materiale 2 for detaljer.
- Efter dialyse er færdig, alikvot ekstrakt med 1,5 ml i 1,75 ml mikro-centrifugerør. Centrifuger ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C. Pellet vil danne bunden af røret.
- Konsolider klar supernatant fra forrige trin afpipetteres en 15 ml Falcon rør på is. Der homogeniseres ved at vende 5-10x.
- Baseret på koncentrationen bestemt ved Bradford i trin 1.47, bestemme mængden af ekstrakt til udportionerer i individuelle 1,75 ml rør. Hver enkelt rør skal have en volumen med 810-900 mg total protein. Ekstrakt bør have en samlet proteinkoncentration på mere end 27 mg / ml. Dette trin kræver assistance til at gennemføre hensigtsmæssigt Bemærk:. Alikvot ekstrakt under 30 mg / ml i 30 pi portioner, og omfang, hvis koncentrationen er højere, for eksempel alikvot ekstrakt ved 28 mg / ml med 30 ul, og alikvot ekstrakt ved 32mg / ml ved 28,1 ul.
- Alikvot ekstrakt efter trin 1.50, idet man for at undgå bobler. Lynfryser ekstrakt i flydende nitrogen Bemærk:. Portioner med bobler kan fjernes ved centrifugering ved 10.000 x g i 30 sekunder ved 4 ° C.
- Fjern rør fra flydende nitrogen ved hjælp af en si og straks opbevares ved -80 ° C. Sikkerhed: Brug beskyttelsesbriller, hætterne af ekstrakt rør kan komme ud på grund af temperaturforskellen mellem flydende nitrogen og stuetemperatur.
2. Amino Acid Solution Preparation
Amino Acid Solution bør udarbejdes i løs vægt. Følgende opskrift udnytter en fuld sæt af RTS Amino Acid Sampler, der leverer nok til cirka 11.000 enlige reaktioner. Hvis skalering ned, anbefales det at bruge ikke mindre end et halvt kit. Hver aminosyre i bestanden leveres på 1,5 ml, 168 mm, bortset fra leucin på 140 mm. Den endelige sammensætning af Amino Acid Solution er:leucin, 5 mM, alle andre aminosyrer, 6 mm. Dette er 4x arbejder koncentration.
- Fjern alle 20 aminosyrer fra -20 ° C og optøning ved stuetemperatur. Optøede, vortexes, indtil aminosyrer opløse, inkubering ved 37 ° C, hvis det er nødvendigt. Efter aminosyrer er opløst, sættes alle aminosyrer på is bortset Asn, Phe og Cys, som holdes ved stuetemperatur. Cys kan ikke opløses fuldstændigt.
- På is, tilsættes 12 ml sterilt vand til et sterilt 50 ml Falcon-rør.
- Tilføj 1,5 ml af hver aminosyre i følgende rækkefølge, idet man vortexes Falcon-rør efter hver tilsætning, og for at holde opløsningen på is: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys kan tilsættes som en suspension. Efter tilsætning vortexes, indtil opløsningen er relativt klart, inkubering ved 37 ° C, hvis det er nødvendigt. Cys kan ikke opløses fuldstændigt.
- Alikvot Amino Acid Solution i 50 rør på26 pi hver på is. Alikvot resten på 500 pi pr rør på is. Ul portioner De 26 vil blive anvendt til at kalibrere ekstrakt, mens gl portioner de 500 vil blive anvendt til at forberede buffer. Mens alikvoteringsprocessen, vortex den vigtigste bestand hyppigt for at undgå ulige fordeling af suspension.
- Flash fryse portioner i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Sikkerhed: Brug beskyttelsesbriller, hætterne af ekstrakt rør kan komme ud på grund af temperaturforskellen mellem flydende nitrogen og stuetemperatur.
- Valgfrit: Gennemføre en aktivitet analyse af nyligt lavet aminosyreopløsningen mod tidligere gjort aminosyreopløsninger.
3. Energy Solution Forberedelse
Energy Solution anvendes både til kalibrering af rå celle ekstrakt og til at skabe buffer, og bør være forberedt på bulk. Følgende opskrift leverer nok til ca 10000 enkelte reaktioner. Hvis skalering ned, er det recommended at bruge ikke mindre end 1/24 af værdier her. Som Energy Solution er en betydelig monetær omkostning, kan første gang brugere ønsker at forberede på 1/24 skala. Den endelige sammensætning af Energy Solution er: HEPES pH 8 700 mM ATP 21 mM, GTP 21 mM, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, tRNA 2,8 mg / ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, cAMP 10,5 mM, folsyre 0,95 mM, Spermidine 14 mm, 3-PGA 420 mm. Dette er 14x arbejder koncentration. Hvis det ønskes, kan hver enkelt post i tabel 4 blev opbevaret ved -80 ° C til senere brug.
- Fjern alle kemikalier i tabel 4 fra -80 ° C, -20 ° C eller 4 ° C til stuetemperatur i 30 minutter.
- Forbered stamopløsninger, som beskrevet i tabel 4.. Se supplerende materiale 1 for opskrifter. Læg alle løsninger på is efter tilberedning.
- I et 15 ml Falcon rør, tilsættes i følgende rækkefølge, idet man vortexes Falcon rør efter hver tilsætning og for at holde de løsninger on is: 3,6 ml 2 M HEPES, 144 pi vand, 1,39 ml nukleotid mix, 576 pi 50 mg / ml tRNA, 576 pi 65 mM CoA, 276 pi 175 mM NAD, 170 pi 650 mM cAMP, 288 pi 33.9 mM Folinsyre , 144 pi 1 M spermidin, og 3,09 ml 1,4 M 3-PGA.
- Alikvot Energy Solution i 50 rør ved 7 pi hver på is. Alikvot resten på 150 ul pr rør på is. Ul portioner De 7 vil blive anvendt til at kalibrere ekstrakt, mens gl portioner de 150 vil blive anvendt til at forberede buffer. Mens alikvoteringsprocessen, vortex den vigtigste bestand ofte.
- Flash fryse portioner i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. Sikkerhed: Brug beskyttelsesbriller, hætterne af ekstrakt rør kan komme ud på grund af temperaturforskellen mellem flydende nitrogen og stuetemperatur.
- Valgfrit: Gennemføre en aktivitet assay nylavede Energy Solution mod tidligere lavet Energy Solutions.
4.. Buffer Forberedelse
BufFer Forberedelse forudsætter gennemførelse af Rå Cell Extract Forberedelse, aminosyreopløsningen Forberedelse, og Energi Solution Forberedelse. Hver buffer er unik for en batch af rå celle ekstrakt. Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT (i nævnte rækkefølge) er optimeret i denne sektion til at producere reaktioner med grænseværdier udtryksformer. Følgende protokol benytter en præ-skrevet skabelon, TXTL_e (skabelon) _calibration_JoVE.xlsx (supplerende materiale 3), at kalibrere allerede forberedt rå celle ekstrakt og forberede buffer. Men man kan også kalibrere rå celleekstrakt og forberede puffer uden skabelon ved at optimere Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT manuelt, og oprettelse af buffer, der sammen med ekstrakt, er 75% af de samlede reaktionsvolumen. Hvis kalibrering manuelt, kan findes endelige reaktionsbetingelser i trin 5..
- Gennemfør "Generelle data" form.
- Thaw på is 100 mM Mg-glutamat (4 ° C), 3 M K-glutamat (4 ° C), 6mM Amino Acid Solution (26 ul, -80 ° C), Energi Solution (7 pi, -80 ° C), 100 mM DTT (-20 ° C), positiv kontrol-DNA (-20 ° C), 40% PEG- . 8000 (4 ° C), rå celle ekstrakt (-80 ° C) og vand (4 ° C) Bemærk: Brug 1 nM arbejder koncentration pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plasmid 40019) for den positive kontrol (excitation 485 nm, emission 525 nm) eller en anden reference, der producerer høj signal intensitet. 4.
- Forbered syv 10,5 gl reaktioner teste en række 4-10 mM yderligere Mg-glutamat ved afmåles sæt mængder lager Mg-glutamat i individuelle mikro-centrifugerør. Bemærk: Selvom 10,5 pi reaktioner omgang udarbejdes den endelige reaktion er 10 ul.
- Forbered masterblanding som angivet i skabelonen under "Mg-glutamat kalibrering" tilføje en ekstra 80 mM K-glutamat. Hold på is og vortex efter tilsætning af hvert element Bemærk:. De givne her og i skabelonen værdier erud over de mængder af Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT til stede i S30B puffer bruges til at lave rå celleekstrakt.
- Tilføj masterblanding til prøver indeholdende Mg-glutamat og forberede reaktioner. Se trin 5,10-5,13 for detaljerede instruktioner.
- Kør reaktion ved 29 ° C, enten i en inkubator eller en pladelæser.
- . Bestem optimal Mg-glutamat koncentration ved udgangen udtryk niveau og maksimal hastighed af protein udtryk (Figur 4a) Bemærk: Runtimes varierer afhængigt af eksperimentet men typisk sidst under 8 timer.
- Gentag trin 4,2-4,7 for K-glutamat under "K-glutamat kalibrering" indstilling Mg-glutamatniveauer til dem, der findes i trin 4.7.
- Gentag trin 4,2-4,7 for DTT under "DTT kalibrering" indstilling Mg-glutamatniveauer til dem, der findes i trin 4.7 og K-glutamat niveauer til dem, der findes i trin 4.8 Bemærk:. Vi har fundet, at tilsat DTT ikke påvirker udgangen væsentligt ekspressionsniveauer.
- Brugværdier fundet i kalibrering under "Buffer sammensætning" at bestemme sammensætningen af buffer til at være forberedt. Baseret på mængden af rå celle ekstrakt fremstillet, er en master mix opskrift produceret til et fast beløb af buffere.
- Tø portioner som anført i master mix opskrift på is. Optøede, forberede mester mix, holde på is og vortex efter tilsætning af hvert element.
- Alikvot efter beløb anført under "Buffer komposition." Lynfryser bufferrørene i flydende kvælstof. Mens alikvoteringsprocessen, vortex den vigtigste bestand ofte.
- Fjern rør fra flydende nitrogen ved hjælp af en si og straks opbevares ved -80 ° C. Sikkerhed: Brug beskyttelsesbriller, hætterne af ekstrakt rør kan komme ud på grund af temperaturforskellen mellem flydende nitrogen og stuetemperatur.
5.. Eksperimentel Udførelse af en TX-TL Reaktion
Afsluttende reaktionsbetingelser er: 8,9-9,9 mg / ml protei (fra rå ekstrakt), 4,5 mM-10.5 mM Mg-glutamat, 40 til 160 mM K-glutamat, 0,33-3,33 mM DTT, 1,5 mM af hver aminosyre, bortset fra leucin, 1,25 mM leucin, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP og GTP, 0,9 mM CTP og UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0,068 mM folinsyre, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000. En grundlæggende TX -TL reaktion har 3 dele (rør): rå celle ekstrakt, buffer, og DNA. Forholdet er 75% buffer og ekstrakt, 25% DNA Reaktioner kan variere i volumen, og vi bruger 10 pi efter sædvane minimere reaktionsvolumen og muliggøre kører i en plade med 384 brønde.. Større mængder kræver omrøring for korrekt iltning. Følgende protokol benytter en præ-skrevet skabelon, TXTL_JoVE.xlsx (supplerende materiale 4), til at foretage en 10 ul reaktion. Elementer i lilla angive bruger-input værdier, og emner i blå indikerer yderligere reagenser for at tilføje til reaktionen. Dog kan man også foretage en reaktion witTurnhout skabelonen ved følgende reaktionsbetingelser skitseret ovenfor.
- Gennemfør "Generelle data" form.
- Under "Master Mix Forberedelse", indsætte uddrag procentværdi fra trin 4.1 i det violette felt.
- Design dit eksperiment i silico ved hjælp af "Master Mix Preparation" (rækker 10-17) og "DNA-forberedelse" (rækker 19-50) sektioner. Generelt kan konstanter sættes i "Master Mix Forberedelse" sektionen, mens variabler kan sættes ind i "DNA-forberedelse" sektionen. Minimer prøver pr eksperiment for at undgå prøve fordampning og eksperimenterende starttidspunkt bias. Se figur 6 for en prøve opsætning.
- Under "Master Mix Forberedelse," tilføj reagenser, såsom inducere eller proteiner, som vil gå i alle prøver ved en konstant koncentration. Startende med række 14, skal du udfylde de blå skraverede områder, holder en reagens til hver linje. Enheder er relative forhold.
- Under "DNA-forberedelse," tilføj DNA, som vil være prøve SPECIFic. Prøve-id'er # 1 og # 2, svarer til positive og negative kontroller, hhv. Prøve-id'er # 3 og derover er brugervenlige modificerbare for DNA, bestand koncentrationen i ng / ul, længde i basepar, ønskede slutkoncentration i nM, og gentagelser (af reaktionerne 10 ul). Mængden af lager-DNA for at nå den ønskede slutkoncentration beregnes automatisk. Den samlede tværs rækkesummerne til 10,5 * n, hvor n er antallet af gentagelser Bemærk:. Selv om det endelige reaktionsvolumen er 10 ul, beregningerne antages et samlet volumen på 10,5 ul pr reaktion, til at redegøre for tabt under pipettering volumen.
- Under "DNA-forberedelse," tilføj reagenser eller yderligere DNA, som vil være prøve specifikke for blå søjler. Stock DNA-koncentrationer i Nm kan beregnes under "DNA-forberedelse", mens prøve specifikke reagenser kræver manuel beregning baseret på en samlet reaktion volumen på 10,5 * n. De indtastede mængder trækkes ud af vandvolumen samme række.
- Fjern nødvendige number rør af puffer, rå celleekstrakt, og den positive kontrol under "Rør til optøning" fra -20 ° C eller -80 ° C og optøning på is.
- Fremstilling af DNA prøver. For hver prøve-ID, alikvot det viste DNA, vand og bruger-leverede emner pr den "DNA-forberedelse" sektionen i en mikro-centrifugeglas, ved stuetemperatur Bemærk:. At undgå tab af prøve, for nylig kalibrerede pipetter og lav-stick pipettespidser og mikro-centrifugerør anbefales.
- Når rør fra trin 5.7 er optøet, forberede master mix bestående af buffer, udpakke og eventuelle globale bruger-leverede elementer baseret på de orange-skraverede kasser, holder på is og vortex efter tilsætning af hvert element Bemærk:. Extract er ekstremt tyktflydende. Portioner med bobler kan fjernes ved centrifugering ved 10.000 x g i 30 sekunder ved 4 ° C.
- Føj mængden af mester mix er angivet i de orange celler under "DNA-forberedelse" (kolonne O) til hver DNA-prøve, og holde ved stuetemperaturtur. Behandl dette som reaktion starttidspunkt.
- Vortex hver prøve, og der centrifugeres ved 10.000 xg i 30 sekunder ved stuetemperatur til at nedbringe enhver resterende prøve, og til at reducere bobler.
- Hvis gennemføre reaktionen i mikrocentrifugerør, inkuberes direkte ved 29 ° C. . Ellers pipette 10 ul prøve i en 384-brønds plade Bemærk: Reaktioner i mængder på over 10 pi kan kræve agitation for iltning.
- Centrifuge plade ved 4.000 x g i 30 sekunder ved stuetemperatur til at nedbringe enhver resterende prøve og reducere bobler. Seal plade bagefter for at forhindre fordampning.
- Kør reaktion ved 29 ° C. Bemærk: Runtimes varierer afhængigt af eksperimentet, men typisk vare under 8 timer.
Representative Results
Vi har præsenteret en fem dages protokol for udarbejdelsen af et endogent Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit ekspressionssystem. En prøve tidslinje for at skabe de reagenser - rå celle ekstrakt og buffer - kan findes i figur 1. Når den er oprettet, kan disse opbevares ved -80 ° C i op til et år. Efter reagenser er oprettet, kan forsøgsopstilling og udførelse ske på mindre end 8 timer.
Derudover har vi optimeret betingelserne for TX-TL cellefrit ekspressionssystem udtryk. Andre bruger-leverede tilføjelser, såsom buffere eller DNA-løsninger, bør kalibreres for toksicitet forhånd. For eksempel skal forskellige metoder til behandling af plasmider resulterer i andet udtryk grund saltindhold. Vi har også testet effekten af Tris-CI elueringspuffer på reaktionen effektivitet (figur 5).
Et eksempel på rå celleekstrakt kalibrering henvisning trin 4,1-4,9, er visti figur 4a. Generelt vores forsøg viser, at det rå celleekstrakt er mest følsomt over for Mg-glutamatniveauer, efterfulgt af K-glutamat niveauer. For at demonstrere den celle-fri ekspressionssystem, vi konstrueret og afprøvet en negativ feedback loop baseret på tet undertrykkelse. 26 (figur 6). I cellen-ytringsfriheden system, samme kreds løb med og uden ATC viser en 7-fold endepunkt udtryk ændring af deGFP reporter efter otte timers udtryk. Selvom dette eksperiment ikke kræver globale inducere eller repressorer, hvis det er nødvendigt de kan tilføjes under "Master Mix Forberedelse."
Figur 1. Tidslinje for rå celle-ekstrakt, aminosyre løsning, og energiløsning forberedelse. En fem-dages timelin e for en typisk udførelse af protokollen er givet ovenfor, er optimeret til overnattende inkubationer og dagtimerne arbejdstrin.
Figur 2. Omkostninger og udtryk analyse af konkurrerende rå celleekstrakter. a) Fordeling af omkostningerne til arbejdskraft og materialer af TX-TL cellefrit ekspressionssystem. Baseret på omkostninger af reagenser fra december 2012, og lønomkostninger på $ 14 per time. B) Sammenligning af TX-TL celle-fri udtryk system omkostninger vs andre kommercielle systemer. Omkostningerne er opdelt pr ul, selvom reaktionsvolumener kan variere per sæt. C) Sammenligning af TX-TL cellefrit ekspressionssystem udbytte vs andre kommercielle systemer. Proteinekspression udbytte bestemt ved producentens standarder./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 3. Lastning og forarbejdning af en perle-bankende rør. a) Påvisning af korrekt viskositet på celle-kugle-løsning. Cell-perle løsning vil have en viskositet afhænger af mange faktorer, herunder mængden af S30A til ITU buffer tilsættes, mængden af perler tilføjet, og tid brugt på is. B) Loading af perle-slå rør før hurtig bordplade centrifugering. Den centrifugering fjerner bobler akkumuleret under lastning. C), bobler belægning efter bordplade centrifugering. Størrelsen af boblerne vil variere, de kan poppet eller fjernes ved hjælp af en pipettespids d) Helt fyldte perle-slå rør uden reduktion.. En menisk dannes i perle-slå tUbe, og hætten har nok til at dække og forårsage små mængder at overfylde. e) Korrekt indlæst filter apparater. Disse kan genbruges. F) Sammenligning af korrekt vs forkert forarbejdet perle-slå rør. Røret til venstre er et godt slag rør - det er udstyret med en lille og godt afgrænset øverste lag, og meget klar supernatant. Røret til højre er suboptimale baseret på de større, tåget andet lag og uklar supernatant. Rør, der suboptimal bør ikke undergår yderligere behandling.
Figur 4.. Egenskaber af rå ekstrakt præparater. a) Typiske kalibrering grunde til rå celle ekstrakt. Råekstrakt er kalibreret til yderligere Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT-niveauer, i den rækkefølge. Vist er endpoint fluorescence efter 8 timer, samt maksimal hastighed af protein produktion baseret på en 12 minutters glidende gennemsnit. Baseret på disse grunde, et acceptabelt område af yderligere Mg-glutamat er 4 mM K-glutamat er 60-80 mM og DTT er 0-3 mM. Bemærk, at hver råekstrakt skal kalibreres uafhængigt for disse tre variabler. B) Ændring fra ekstrakt præparater. Endpoint fluorescens af to råekstrakter udarbejdet på forskellige datoer vises, fejlsøjler er 1 standardafvigelse fra tre uafhængige kørsler på forskellige dage. Klik her for at se større figur .
Figur 5. Virkninger af DNA-opløsning på ekspression effektivitet. a) Sammenligning af to forskellige rensningmetoder til behandling af plasmider. 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 er udarbejdet ved hjælp af kun en QIAprep Spin Miniprep Kit (Oprensning metode 1) eller efterbehandlet med en QiaQuick PCR oprensning kit (Oprensning metode 2). Vist er endpoint fluorescens efter 8 timer, samt maksimal hastighed af protein produktion baseret på en 12 minutters glidende gennemsnit. Fejllinjer er 1 standardafvigelse fra fire uafhængige kørsler på forskellige dage. B) Effekt af elueringsbuffer (Tris-Cl). Forskellige koncentrationer af Tris-CI sammenlignes i en cellefri ekspression reaktion baseret på ekspressionen af 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Fusioner er endelige koncentrationer af Tris-CI i reaktionens elueringsbuffer anvendes er 10 mM Tris-CI. Fejllinjer er 1 standardafvigelse fra tre uafhængige kørsler på forskellige dage. Klik her for at se større figur .
Figur 6. Sample TX-TL kørsel af en negativ feedback-sløjfe. a) Prøve opsætning af et cellefrit udførelse reaktion. Tests "på" versus "off" tilstand af den negative feedback loop, med positive og negative kontroller. B) Plasmid kort af negativ feedback-sløjfe. C) Repræsentative resultater. Data afspejler eksperiment i a) og b), med negativ kontrol subtraheret fra signalet. Genetisk kredsløb vist i indsatsen. Fejllinjer er 1 standardafvigelse fra tre uafhængige kørsler på forskellige dage. Klik her for at se større figur .
| Navn | Koncentration | Beløb | Sterilisation | Noter |
| Chloramphenicol (CM) | 34 mg / ml i ethanol | 1 ml | Filtersteriliser (0,22 uM) | Kan fremstilles i større mængder, der er lagret ved -20 ° C til senere brug. |
| 2xYT + P + Cm agarplade | 31 g / L 2 x YT, 40 mM dibasisk kaliumphosphat, 22 mM monobasisk kaliumphosphat, 34 ug / ml chloramphenicol | 1 plade | Autoklave | |
| 2xYT + P medier | 31 g / L 2 x YT, 40 mM dibasisk kaliumphosphat, 22 mM monobasisk kaliumphosphat | 4 L | Autoklave |
Tabel 1. Reagenser til dag 1 i Rå Cell Extract-protokollen.
| Navn | Koncentration | Beløb | Sterilisation | Noter |
| Tris-base | 2 M | 250 ml | Filtersteriliser (0,22 uM) eller autoklav | Kan opbevares ved stuetemperatur. |
| DTT | 1 M | 6 ml | Filtersteriliser (0,22 uM) | Kan fremstilles i større mængder og opbevaret ved -20 ° C til senere brug. |
| S30A til ITU buffer | 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7,7 | 2 L | Autoklave | For at nå pH 7,7, titreres med eddikesyre. Læg DTT til 2 mM slutkoncentration lige før brug. Opbevares ved 4 ° C. |
| S30B buffer | 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 | 2 L | Autoklave | For at nå pH 8,2, titreres med 2MTris. Læg DTT til 1 mM slutkoncentration lige før brug. Opbevares ved 4 ° C. |
Tabel 2. Reagenser til dag 2 i Rå Cell Extract-protokollen.
| Falcon | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4. | |
| Tomme 50 ml Falcon (g) | ||||
| 50 ml Falcon med pellet (g) | ||||
| Pellet masse (50 ml Falcon med pellet - tom 50 ml Falcon) (g) | ||||
| S30A til ITU buffervolumen tilføje (pellet masse * 0,9) (ml) | ||||
| Samlet masse af perler til at tilføje (pellet masse * 5,0) (g) | ||||
Tabel 3. S30A til ITU buffer og perlemassen regnemaskine til dag 3 i Rå Cell Extract protokol.
| Navn | Koncentration | Beløb | Sterilisation | Noter |
| HEPES | 2 M, pH 8 | 4 ml | Ingen | For at nå pH 8, titreres med KOH. |
| Nucleotide Mix | 156 mM ATP og GTP, 94 mM CTP og UTP, pH 7,5 | 1,5 ml | Ingen | For at nå pH 7,5, titreres med KOH. |
| tRNA | 50 mg / ml | 600 pi | Ingen | |
| CoA | 65 mm | 600 pi | Ingen | |
| NAD | 175 mM, pH 7,5-8 | 300 pi | Ingen | For at nå pH 7,5-8, titreres med Tris ved 2 M. |
| cAMP | 650 mM, pH 8 | 200 pi | Ingen | For at nå pH 8, titreres med Tris ved 2 M. |
| Folsyre | 33.9 mM | 300 pi | Ingen | Selvom der er behov for kun 300 ul, opskrift i supplerende er 1,15 ml. |
| Spermidin | 1 M | 150 pi | Ingen | Opbevares ved 4 ° C, opvarmes til 37 ° C for at smelte. |
| 3-PGA | 1,4 M, pH 7,5 | 3,2 ml | Ingen | For at nå pH 7,5, titreres med Tris ved 2 M. |
Tabel 4. Reagenser at forberede Energy Solution protokollen.
Supplerende Materiale 1. Opskrifter til poster.
Chloramphenicol, 34 mg / ml: Forbered 0,51 g chloramphenicol og tilføje ethanol til 15 ml. Filtersteriliser (0,22 uM), alikvot til 1 ml rør, opbevares ved -20 ° C til senere brug.
2xYT + P + Cm agarplade: Forbered 1,24 g 2xYT, 1,6 ml dibasisk kaliumphosphat opløsning @ 1 M, 0,88 ml monobasisk kaliumphosphat opløsning @ 1 M, 0,6 g agar og vand til 40 ml. Autoklav. Lad afkøle til 50 ° C og tilsættes 40 ul Cm. Alikvot 25 ml i en 100 x 15 mm petriskål, og lad afkøle i en time.
2xYT + P medier: Forbered 124 g 2xYT, 160 ml kalium dibasisk løsning @ 1 M, 88 ml kalium monobasisk løsning @ 1 M, og vand til 4 L. Aliquot ud i 2 x 1,88 L og 0,24 L. Autoklave.
Tris-base, 2 M: Forbered 60,57 g Tris-base og vand til 250 ml. Sterilisere, opbevares ved stuetemperatur til senere brug.
DTT, 1 M: Forbered 2,31 g DTT og vand til 15 ml. Filtersteriliser (0,22 uM), alikvot til 1 ml rør, opbevares ved -20 ° C til senere brug.
S30A til ITU buffer: Forbered 10.88 g Mg-glutamat og 24.39 g K-glutamat, 50 ml Tris på 2M, eddikesyre (til pH 7,7) og vand til 2 L. Autoklave, opbevares ved 4 ° C, tilsættes 4 ml 1 M DTT før brug.
S30B buffer: Forbered 10.88 g Mg-glutamat og 24.39 g K-glutamat, Tris ved 2 M (til pH 8,2) og vand til 2 L. Autoklave, opbevares ved 4 ° C, tilsættes 2 ml 1 M DTT før brug.
HEPES: Forbered 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (til pH 8) og vand til 4 ml.
tRNA: Forbered 30 mg tRNA og vand til 600 ul.
CoA: Forbered 30 mg CoA (MW 767,53) og vand til 600 ul.
NAD: Læg 34,83 mg NAD (MW 663,43), Tris ved 2 M (pH 7,5-8) og vand til 300 pi. (Tilføj 27 pi Tris ved 2 M for at bringe opløsningen til pH 7,5-8).
cAMP Læg 42,80 mg af cAMP (MW 329,22), Tris ved 2 M (til pH 8) og vand til 200 pi. (Tilføj 73 pi Tris ved 2 M for at bringe opløsningen til pH 8).
Folinsyre (33,9 mm): 20 mg fast folininsyre calcium salt (MW 511,5), der tilsættes 1,15 ml vand.
Spermidin: Forbered 23,55 pi spermidin (MW 145.25) og vand til 150 ul. Forbered ved stuetemperatur efter smeltning kortvarigt ved 37 ° C.
3-PGA: Tilføj 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris ved 2 M (til pH 7,5) og vand til 3,2 ml. (Tilføj 1,73 ml Tris ved 2 M for at bringe opløsningen til pH 7,5).
Nucleotide Mix: Tilføj 145 mg ATP dikaliumsalt dihydrat (MW 619,4), 133 mg GTP dinatriumsalt (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumsaltdihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumsalt dihydrat (MW 586,12) , KOH ved 15% fortynding (til pH 7,5) og vand til 1,5 ml. (Tilføj 353 pi KOH ved 15% fortynding for at bringe opløsningen til pH 7,5).
Supplerende materiale 2. Bradford-analysen.
- Fjern Bradford middel fra 4 ° C og opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 50 pi BSA standard ved 1 mg / ml og 0,1 mg / ml.
- Forbered 40 pi 20x fortynding af ekstrakt fra trin 1.47.
- Tilføj 800 pi vand til 7 kuvetter.
- Forbered faste kuvetter til 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 pi 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 pi 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 pi 1 mg / ml BSA) 6 mg / ml (6 pi 1 mg / ml BSA).
- Forbered eksperimentelle kuvetter til 2 pi prøve og 4 pi af prøven.
- Tilsæt 200 ul Bradford agent til hver kuvette og bland godt by pipettering. Der inkuberes ved stuetemperatur i mindst 10 min.
- Fremstil standardkurve ved OD 595 nm ved anvendelse af kuvetter fra trin 6.5. Afvis standardkurve hvis r 2 <0,95.
- Bestem ekstrakt koncentration ved OD 595 nm ved brug af kuvetter fra trin 6.6.
Supplerende materiale 3. Buffer kalibrering regneark.
Se TXTL_e (skabelon) _calibration_JoVE.xlsx .
Supplerende materiale 4. Celle-ytringsfriheden køre regneark.
Discussion
Den endogene Escherichia coli baserede TX-TL cellefrit udtryk her beskrevne system er en nem-at-run tre rør reaktion, som kan tage mindre end otte timer fra sat op til dataindsamling. Processen med at skabe alle reagenser kræver fem dages tid i alt (med betydelige behov for arbejdskraft på kun én dag), men producerer rå ekstrakt 3.000 reaktioner og buffer-making reagenser til 10.000 reaktioner (Figur 1). Desuden rå ekstrakt og buffer-making reagenser er stabile i mindst 1 år ved -80 ° C, der giver mulighed for flere anvendelser af et præparat. 4. På $ 0,11 per 10 ul reaktion ($ 0,26 herunder arbejdskraft), omkostningerne er 98% lavere end sammenlignelige kommercielle systemer (figur 2).
Der er nogle uløste begrænsninger, men til systemet. Enden Effektiviteten af de enkelte rå celle ekstrakt forberedelse kan variere baseret på brugerens færdighed og miljøforhold, selvom typiske udbytte variation er mellem 5-10% (figur 4b). Som et resultat, batch-til-batch variation i både endepunkt udtryk og i udtryk dynamik der må forventes. Disse variationer vil sandsynligvis forblive, indtil ekstrakt fuldt karakteriseret, eller indtil ekstrakt skabelse er fuldt automatiseret. Hvis det cellefrie ekspressionssystem anvendes til at udføre følsomme kvantitative forsøg, er det tilrådeligt at køre alle forsøg med den samme batch af rå celleekstrakt. Udbyttet fra en enkelt rå celle ekstrakt parti, omkring 3000 reaktioner, bør være tilstrækkelig til typiske eksperimentelle kurser. Selvom vi har mistanke om variation kan fjernes ved at skalere op og automatisere proceduren ville sådanne forsøg indebære en betydelig investering ressource.
Derudover, selvom endepunkt ekspressionsniveauer rimeligt let at afgøre, der skal gøres i forståelse dynamik iboende til celle-fri system, mere arbejde. Det er kendt, at både ressource COMPETITIOn og ressource begrænsning kan påvirke udtryk dynamik. For eksempel kan begrænsede endogent sigma 70 resultere i en mættende regime med øget DNA-template producerer et udtryk nu analog med den i nukleotid-eller aminosyre udtynding. 9,27 imidlertid dynamik ikke behøver at være fuldt forstået at udnytte systemet. For rene stigninger i udbyttet, kan optimering ske ved maskine-learning tilgange. 28 spørgsmål om konkurrence og begrænsning ressource kan løses ved matematiske modeller kontrolleres ved hjælp af eksperimentelle data.
Protokollen præsenteres her er optimeret til en BL21-Rosetta2 stamme, men er generaliseres til andre E. coli-stammer. Ændringer i BL21-Rosetta2, såsom fjernelse af det gen, der koder for lon protease og tilsætning af gener, der koder sjældne tRNA'er, give mulighed for maksimal proteinproduktion. Vi har forsøgt protokollen med to andre ekstrakt stammer - kun BL21 og en BL21 trxA knockout-end fundet 50% mindre protein udbytte. Vi hypotesen, at udbyttet på samme måde falde, når du bruger andre stammer. Andre ændringer i parametre, såsom skift 2xYT vækstmediet for LB og andre rige bouillon, har resulteret i nedsat proteinudbytte.
Cellefrie ekspressionssystemer udnytte både endogene og eksogene transkription-translation maskiner og reguleringsmekanismer har brede anvendelser i både protein og metabolit udtryk og i syntetisk biologi. 3,29 i stedet for at være begrænset til T7-regulerede kredsløb, kan man forestille sig at producere komplekse biomolekyler i et brugervenligt kontrollerbar indstilling ved hjælp af en blanding af indfødt E. coli promotorer og exogent tilførte transskription og reguleringsmekanismer. Uden begrænsninger af celledeling og stofskifte, kan variation i syntetiske kredsløb såsom repressilator eller metaboliske manipuleret veje såsom dem, der producerer artemisinin reduceres eller bedre forstået. 30,31 Vi have brugt disse fordele at implementere genetiske switche, samt at forstå sigma faktor binding 9,32 Sådan teknologi kan også danne rygraden i "minimal" eller "kunstige" celler -. lille, godt karakteriseres og selvforsynende indkapslinger enheder ekstrakt. 33,34
I sidste ende, vi forventer umiddelbare anvendelser af denne endogene celle-fri ekspressionssystem som prototyping miljø for syntetisk biologi. Tilnavnet "TX-TL biomolekylære breadboard," celle-frie udtryk system giver en kontrollerbar miljø, hvor syntetiske kredsløb i sidste ende er bestemt til in vivo-ekspression kan undergå runder af prototyper - cykler test på grundlæggende plasmid, lineær eller kemisk syntetiseret DNA, efterfulgt ved analyse og hurtig modifikation. Prototyping runder kan blive hjulpet af prognosemodeller matematiske modeller ved at blive udviklet. Ved at fjerne kloning og in vivo manipulation for ikke-endelige kredsløb, forventer vi ingegeniørfirma cyklustider reduceres til 1-3 dage i stedet for de nuværende ugers standard.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere og Enoch Yeung for assistance strømline protokollen, og Clare Chen og Barclay Lee om bistand i de tidlige faser af projektet. Dette materiale er baseret på arbejde støttes delvist af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Støberier program, kontrakt nummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS understøttes også af en UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program fællesskab og med en DoD, Air Force Kontoret for Videnskabelig Forskning, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De synspunkter og konklusioner, der er indeholdt i dette dokument, er forfatternes og bør ikke fortolkes som repræsenterende officielt politikker, hverken udtrykkeligt eller stiltiende, af Defense Advanced Research Projects Agency eller den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Bacto-agar | BD Diagnostics | 214010 | |
| Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | BioSpec | 522S | |
| Beads, 0.1mm dia. | BioSpec | 11079101 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| Cuvettes, 1.5ml | Fisher | 14-955-127 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo-Scientific | 142761 | |
| Nunc sealing tape | Thermo-Scientific | 232701 | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 | |
| 1L Centrifuge Bottle | Beckman-Coulter | A98813 | This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use. |
| 4L Erlenmeyer Flask | Kimble Chase | 26500-4000 | |
| Avanti J-26XP Centrifuge | Beckman-Coulter | 393127 | Or 1L-capable centrifuge equivalent. |
| Forma 480 Orbital Shaker | Thermo Scientific | 480 | Or chest-size 6x4L shaker equivalent. |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman-Coulter | 363688 | Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge. |
| Mini-Beadbeater-1 | BioSpec | 3110BX | |
| Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay.
See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx. |
|||
References
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
- He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochem. 46, 615-620 (2011).
- Forster, A. C., Church, G. M. Synthetic biology projects in vitro. Genome Res. 17, 1-6 (1101).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system. Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).
- Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits. Pao, L., Abramovitch, D. American Control Conference, Jun 17-19, Washington, DC, , AACC. 1531-1536 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Physical review letters. 106, 048104 (2011).
- Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis. J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).
- Wood, W. B., Berg, P. Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).
- Zubay, G. In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
- Pratt, J. M. Transcription and Translation: A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. 179-209 (1984).
- Kim, H. C., Kim, D. M. Methods for energizing cell-free protein synthesis. Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).
- Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome. Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).
- Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).
- Kwok, R. Five hard truths for synthetic biology. Nature. 463, 288-290 (2010).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).
- Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase. Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).
- Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins. Nucleic acids research. 34, e135 (2006).
- Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).
- Matsuda, T., et al. Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling. Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).
- Becskei, A., Serrano, L. Engineering stability in gene networks by autoregulation. Nature. 405, 590-593 (2000).
- Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase. Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).
- Caschera, F., et al. Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis. Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).
- Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
- Tsuruta, H., et al. High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli. Plos One. 4, e4489 (2009).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Jewett, M. C., Forster, A. C. Update on designing and building minimal cells. Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
