Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Protokoll för Implementera en doi: 10.3791/50762 Published: September 16, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Denna femdagars-protokollet beskriver alla steg, utrustning och extra programvara som krävs för att skapa och driva en effektiv endogen Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem från grunden. Med reagenser, tar det protokoll 8 timmar eller mindre att installera en reaktion, samla in och bearbeta data.

Abstract

Idealiska cellfria expressionssystem kan teoretiskt emulera en in vivo cellmiljö i en kontrollerad in vitro-plattform. 1 Detta är användbart för att uttrycka proteiner och genetiska kretsar på ett kontrollerat sätt samt för att ge en prototypmiljö för syntetisk biologi. 2,3 För att uppnå det senare målet, cellfria expressionssystem som bevarar endogen Escherichia coli mekanismer transkription-översättning kan bättre återspeglar cellulära dynamik in vivo än de som baseras på T7 RNA-polymeras transkription. Vi beskriver förberedelserna och genomförandet av ett effektivt endogen E. coli baserade transkription-translation (TX-TL) cellfria expressionssystem som kan ge likvärdiga mängder protein som T7-baserade system med en 98% kostnadsminskning till liknande kommersiella system. 4,5 Beredningen av buffertar och råcellextrakt är beskrivs, liksom utförandet av entre rör TX-TL reaktion. Hela protokollet tar fem dagar att förbereda och ger tillräckligt med material för upp till 3000 enkla reaktioner i en beredning. Efter beredning, tar varje reaktion under 8 timmar från installation till datainsamling och analys. Mekanismer för reglering och transkriptions exogena till E. coli, såsom lac / Tet-repressorer och T7 RNA-polymeras, kan kompletteras. sex Endogena egenskaper, såsom mRNA och DNA nedbrytningshastigheter kan också justeras. 7 TX-TL cellfritt expressionssystem har visats för stor- skala kretskort, utforska biologiska fenomen och uttryck av proteiner under både T7-och endogena promotorer. 6,8 Kompletterande matematiska modeller finns tillgängliga. 9,10 Det resulterande systemet har unika tillämpningar inom syntetisk biologi som en prototypmiljö, eller "TX- TL biomolekylära bakbord. "

Introduction

Cell-yttrandefrihet tekniken började på 1950-talet som rent translationell, avancera år senare att omfatta kopplade mekanismer transkription-översättning med hjälp av T7 bakteriofag-DNA. 11,12 Sedan dess har många försök gjorts för att optimera skapandet av råcellextrakt (eller E . coli S30-extrakt). 13,14 Dessa optimeringar inkluderar förlänga cellfria proteinsyntes genom ATP-regenerering eller stam modifieringar, och minska protokoll tid och kostnad. existerar 15-17 Alternativa cellfria expressionssystem som använder rekonstituerade komponenter i stället för råolja cellextrakt för uttryck. 5 Både råcellextrakt och beredning metoder har utvecklats för kommersiellt bruk.

Med tillkomsten av syntetisk biologi, finns det ett ökat behov av en väldefinierad plattform för att testa och uttrycka manipulerade biologiska moduler och kretsar. 18,19 Denna plattform ska varamångsidig, väldefinierad, enkla att manipulera, och fokuserat på användar inköpta komponenter. Trots att utvecklas ett halvt sekel tidigare cellfria system baserade på E. coli dela sig är dessa krav, eftersom de är en förenklad in vitro-representation av cellulära processer utan komplexiteten av tillväxt och metabolism. Dessutom har alla de grundläggande kunskaper från in vivo arbete på E. coli gäller lätt till E. coli cellfria system.

Trots att cellfria expressionssystem kan ha tillämpningar inom syntetisk biologi, hittills målet för de flesta cellfria expressionssystem har varit att maximera protein och metabolit avkastning. Detta åstadkommes genom användning av T7-bakteriofag-transkription av sekvenser som drivs av T7-promotorer. 20 Även om uttrycket är effektiv och robust, dessa system tjänar en högspecialiserad syfte. Cellregleringsmetoder är begränsade, måste mål-DNA-mallar varaomarbetade för att inkludera T7-promotorer, och vissa sekvenser såsom ribosomala komplex inte kan transkriberas och monteras. 21,22 Befintliga cellfria expressionssystem inte kan upprätthålla hög avkastning samtidigt som endogena reglerande mekanismer, en mångsidighet som behövs för syntetisk biologi.

Vi har utvecklat en endogen E. coli cellfria expressionssystem som bevarar effektiviteten i proteinuttryck framgår av tidigare system, men lägger till ytterligare mångsidighet genom att tillåta uttryck och reglering baserad på både endogena och exogena (T7 eller andra) mekanismer. Protokollet som beskrivs här är ursprungligen baserad på Kigawa et al. (2004) och Liu et al. (2005), men har betydande förändringar. Den använder Mg-och K-glutamat över Mg-och K-acetat för ökad effektivitet, avlägsnar 2-merkaptoetanol, och lyserar cellerna genom att använda en Bead-Beater. 17,23,24 Bead-stryk väljs framför homogenisering,tryckbaserade metoder eller ultraljudsbehandling på grund av dess lägre kostnad och med jämförbara utbyten till konkurrerande system. 23 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) används som energikälla, eftersom man fann att ge överlägsna proteinutbyten jämfört med kreatinfosfat och fosfoenolpyruvat. 4,25 Vårt system kan producera upp till 0,75 mg / ml reporter protein med hjälp av antingen en sigma70 baserad promotor med lambda-fag operatörer eller en T7-driven promotor, liknande avkastning från andra kommersiella system. 4,6 Fem dagar krävs för att producera alla nödvändiga reagenser (Figur 1). Dessutom ger det en minskning 98% kostnad än andra kommersiella cellfria system - materialkostnader är $ 0,11 per 10 pl reaktion, som stiger till 0,26 $ med arbetskraft ingår (Figur 2).

Protocol

1. Råcellextrakt Framställning

Förberedelse råcell-extraktet över tre dagar krävs två personer för att utföra effektivt. Protokollet består funktionellt av tre delar: kultur tillväxt (steg 1.1 till steg 1,11), cell-lys (steg 1,12 till steg 1,37), och extrahera klargörande (steg 1,38 till steg 1,52). Den presenteras uppdelad i dagar för bekvämlighet. Idealiskt extrakt kan producera 0,75 mg / ml av deGFP från plasmiden pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019) och har en råcellextrakt koncentration mellan 27-30 mg / ml av protein. Fyra emellertid , extrahera egenskaper varierar från parti till parti. Följande recept levererar tillräckligt för cirka 3000 enskilda reaktioner (6 ml råcellextrakt). Om trappa ner, är det rekommenderat att använda inte mindre än 1/6 av värden som anges här. På grund av tidsbrist, uppskalning inte rekommenderas.

Dag 1

  1. Förbered bakterieodlingsmedier, kulturTure tallrik, och medietillägg som beskrivs i Tabell 1. Se Kompletterande material 1 för recept.
  2. . Serie BL21-Rosetta2 stam från -80 ° C på en 2xYT + P + Cm agarplatta och inkubera under åtminstone 15 h vid 37 ° C eller tills kolonier är lätt synliga Anm: kloramfenikol (Cm) används för att selektera med avseende på en plasmid kodning sällsynta tRNA i BL21-Rosetta2 stammen.

Dag 2

  1. Förbered buffertar och tillägg som anges i tabell 2. Se Kompletterande material 1 för recept.
  2. Förbered och sterilisera material som krävs för dag 3, inklusive: 6 x 4 L Erlenmeyerkolvar med aluminiumfolielocket (autoklaverat), 4 x 1 L sterila centrifugflaskor, tratten (autoklaverat), 100 g av 0,1 mm glaspärlor (autoklaverat), 2 rör-barer (autoklaveras), 1 L och 500 ml mätglas (autoklav), 2 x 1 L bägare (autoklaveras), 3 ml spruta med 18 G-nålar (sterila), 2-3 flhavre bojar, 2-3 10k MWCO dialyskassetter (steril), kyvetter.
  3. Förbered mini-kultur 1. Tillsätt 4 ml av 2xYT + P media och 4 | il av Cm till ett 12 ml sterilt odlingsrör och pre-värm till 37 ° C under 30 min.
  4. Inokulera mini-kultur 1 med en koloni från 2xYT + P + Cm agarplatta. Inkubera vid 220 rpm, 37 ° C under 8 timmar.
  5. 7 timmar och 30 minuter senare, förbereder mini-kultur 2. Tillsätt 50 ml 2 x YT + P media och 50 pl av Cm till en steril 250 ml Erlenmeyer-kolv och pre-värm till 37 ° C under 30 min.
  6. Inokulera mini kultur 2 med 100 | il av mini kultur 1 och inkubera vid 220 rpm, 37 ° C under 8 timmar.

Dag 3

  1. Väg fyra tomma sterila 50 ml Falcon rör och spela in massa i tabell 3. Chill Falcon-rör på is, och dessa kommer att därefter användas i steg 1,18.
  2. 7 timmar och 30 minuter efter steg 1,8, förbereda sista bakterieodlingsmedier. Med hjälp av en steril 1 L mätglas, överföra 660 ml 2xYT + P medier into vardera av sex fyra L Erlenmeyerkolvar och förut värm till 37 ° C under 30 min. Notera: 4 L eller större Erlenmeyerkolvar rekommenderas för ordentlig luftning.
  3. Lägg till 6,6 ml mini-kultur 2 i varje 4 L Erlenmeyerkolv. Inkubera vid 220 rpm, 37 ° C tills kulturen når ett OD av 1,5 till 2,0 vid 600 nm (motsvarande mitten av log-tillväxtfasen). Kontrollera OD regelbundet med en 1:10 kultur utspädning för noggrannhet Detta steg bör inte ta mer än 3 timmar - 3 tim 45 min,. Snabb tillväxt och insamling under mitten av log-fasen är avgörande för extrakt kvalitet.
  4. Omedelbart efter tillväxt, överföra alla kulturer jämnt i fyra 1 L centrifugflaskor och centrifugera vid 5000 xg under 12 minuter vid 4 ° C för att pellebakterieceller.
  5. Medan centrifugering, komplett S30A buffert beredning genom att tillsätta 4 ml av 1 M DTT till 2 L av tidigare framställd S30A. Blanda och upprätthålla buffert på is.
  6. Vid centrifugering är klar, helt ta bort supernatanten från steg 1,12 med decanting och läskcentrifugflaskor på en steril pappershandduk.
  7. Tillsätt 200 ml S30A-buffert vid 4 ° C för var och en av de fyra centrifugflaskor och skaka flaskorna kraftigt tills pelleten är helt solubiliserades med inga kvarvarande klumpar. Centrifugera fyra flaskor vid 5000 g under 12 min vid 4 ° C.
  8. Avlägsna supernatanten från föregående steg genom dekantering och läskcentrifugflaskor på en steril pappershandduk.
  9. Upprepa steg 1,15 och 1,16.
  10. Tillsätt 40 ml S30A-buffert vid 4 ° C till varje centrifugflaska. . Överför varje pellet och S30A kombination i ett kylt Falcon rör från 1,9) Anmärkning: Detta steg är att överföra pellets i en mindre behållare.
  11. Centrifugera Falcon-rör vid 2000 g under 8 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten genom dekantering.
  12. Re-centrifug de Falcon-rör vid 2000 g under 2 minuter vid 4 ° C. Helt ta bort kvarvarande supernatanten med pipett. Håll på is.
  13. Väg den fvåra Falcon rör med pellets och spela massa i tabell 3. Beräkna pelletsmassa, S30A buffertvolym som krävs, och massa pärlor som behövs utifrån de specifika formlerna i tabell 3.
  14. Korrekt lastning och pärla misshandeln av pelleten är avgörande för att göra kvalitetsextrakt, och är den mest utmanande steget. Det rekommenderas att granska videon innan. Underlåtenhet att undvika luftbubblor och fördela pärlor jämnt kommer att resultera i ineffektiv extrakt.
  15. Lägg mängden S30A buffert beräknas i tabell 3 till varje Falcon rör, virvel tills homogen, och återvända till isen.
  16. Under det att de andra Falcon-rör på is, tillsätt pärlor intermittent till en enda Falcon-rör i tre portioner, vardera med användning av 1/3 av det totala antalet kulor. Efter tillsats av varje portion av pärlorna, vortexa i 30 sek. Placera Falcon rör på is mellan virvelsteg och efter slut virvel. Efter förra alikvot tillsätts, sePärlorna är likformigt fördelad. En tjock pasta bör bildas.
  17. Bered en 5 ml (volym) pipettspets genom att klippa av änden med användning av ett sterilt rakblad för att skapa en 3-4 mm öppning. Slå pipett till 2 ml OBS: Olika pipett-apparater och tips ger olika mycket sug som kanske inte är tillräckligt för att dra och släppa tjock pärla-cell-lösning, en 1 ml pipett spets med slutet bort kan användas i stället..
  18. Placera 20 pärla ledande rören på is.
  19. Verifiera hög viskositet för cell-pärla lösning med hjälp av modifierade pipett. Det bör vara viskös till punkten för knappt lämnar pipettspetsen under utmatning. Om för trögflytande kan du justera pipettspetsen enligt steg 1,25. Om inte tillräckligt trögflytande, kan pärlor läggas i steg om (pelletsmassa * 0,05), med en totalvikt av (pelletsmassa * 5.1). Efter varje tillsats av pärlor, vortexa i 30 sekunder och återgå till is. Se Figur 3a för en demonstration av viskositet.
  20. Avlägsna vulst-cellösningen från Falcon-rör med användning av modifierad pipett och överföra till en steril vulst ledande rör, fylla den tre fjärdedelar fulla med vulst-cell-lösning. Spin extremt kort (1s) på en räknare mini-centrifug för att avlägsna luftbubblor, utan omfördela pärlor. Se figur 3b-d för stillbilder av pärla misshandel rör lastning.
  21. Avsluta lägga pärla-cell-lösning för att bilda en konkav menisk.
  22. Lägg till en mycket liten droppe pärla-cellslösning på insidan av en pärla ledande rör mössa, är noga med att inte hindra utanför läppen av locket, annars pärlan ledande rör går inte att stänga sufficientl y. Tryck locket på en plan yta och kontrollera att det inte finns några luftbubblor i botten av locket.
  23. Förslut vulsten ledande rör med vulsten ledande locket från det föregående steget. Hand till assistent för pärla stryk. Om det görs på rätt sätt, bör locket vara tätt förslutna, inga luftbubblor should vara synlig, och lite (om någon) pärla-cellslösning ska rinna över. Gör om laddningen om luftbubblor är synliga eller locket inte helt nära.
  24. Vortex Falcon rör från steg 1,24 med den återstående pärla-cell-lösning för att säkerställa en jämn fördelning av pärlor. Upprepa steg från 1,28 till 1,31 till Falcon röret är tomt, upprepa sedan steg från 1,24 till 1,31 för varje extra Falcon rör.
  25. Conduct steg från 1,33 till 1,38 samtidigt. Har assiste take fylld pärla ledande rören från 1,31 och placera på is. När två fyllda pärla ledande rören har samlats in och har varit på is i minst en minut, börjar pärla stryk.
  26. Vispa ett rör under 30 sekunder vid 46 varv per minut. Sätt upp och ned på is under 30 sek samtidigt slår det andra röret.
  27. Upprepa föregående steg så att varje fylld pärla ledande röret har takten i 1 min totalt.
  28. Upprepa steg från 1,33 till 1,35 till 8 fyllda pärla ledande rör (eller det högsta belopp centrifugen kan hålla) have bearbetats. Sedan konstruera filterapparat från 15 ml Falcon (Figur 3e). Lägg till en ny kula ledande lock, en platt-del med framsidan upp, till botten av en 15 ml Falcon. Ta sedan bort locket från bearbetad pärla ledande rör och press kolonn mikro-kromatografi ordentligt på slutet av bearbetat pärla ledande röret tills helt tät. Snap off eluering slutet av mikro-kromatografi kolonn, och placera mikro-kromatografi kolonn, eluering slut ner, in i tomma pärla-beading röret. Placera detta komplex i 15 ml Falcon. Upprepa för alla 8 fyllda pärla ledande rör, hålla på is när det är klart.
  29. Centrifugera 8 filteranordningar, Falcon rör icke-begränsade, vid 6000 g under 5 min vid 4 ° C för att separera extraktet och pelleten från pärlorna.
  30. Kontrollera varje pärla misshandel röret har producerat livskraftig extrakt. Ordentligt slå extraktet blir inte grumlig och pelleten kommer att ha två distinkta skikt. Släng alla grumliga rör, och överför supernatanten från icke-grumliga rör into individuella 1,75 ml mikro-centrifugrör, med så lite pellets som möjligt. Håll på is tills alla pärla ledande rören har behandlats. Se figur 3f jämföra en korrekt vs felaktigt bearbetat pärla misshandel röret.
  31. Centrifugera mikro-centrifugrör från föregående steg vid 12000 g under 10 min vid 4 ° C.
  32. Överför pellets fria supernatanten i tomma pärla ledande rör med hjälp av en pipett, konsolidera 500 l till en ny pärla ledande rör.
  33. Inkubera föregående steg, med bead ledande lock avlägsnats, vid 220 rpm, 37 ° C under 80 min. Detta steg digererar återstående nukleinsyror med användning av endogena exonukleaser frigörs under vulsten-beading process, och kan göras genom att stå vulsten ledande röret upp i en vävnadskultur-rör.
  34. Förbered dialysmaterial. Komplett S30B buffert beredning genom att tillsätta 2 ml av 1 M DTT till 2 L av tidigare framställd S30B. Blanda och tillsätt 900 ml i vardera av två sterile 1 L bägare. Lägg steril magnetomrörare i varje bägare, hålla vid 4 ° C.
  35. Efter steg 1,41, bör extrakt ser grumligt. Konsolidera extraktet i 1,5 ml alikvoter i 1,75 ml mikro-centrifugrör och centrifugera vid 12000 g under 10 min vid 4 ° C.
  36. Med hjälp av en pipett, konsolidera pelletsfria supernatanten i 15 ml Falcon rör på is, och blanda väl genom att beräknings röret och inverterande. Spara 10 l av supernatanten på is för steg 1,47.
  37. Bestäm totala mängden extrakt som produceras, och återfukta det nödvändiga antalet 10k MWCO dialyskassetter genom nedsänkning i S30B i 2 min, förutsatt 2,5 ml extrakt per kassett.
  38. Ladda kassetter med 2,5 ml extrakt. Varje bägare kan ta upp till två kassetter, dialysera under omrörning vid 4 ° C under 3 h Anmärkning: partiell laddning av kassetter är acceptabel.. Dialys ökar proteinproduktion avkastning.
  39. Under föregående steg, karaktärisera extrakt proteinkoncentration med en Bradford-analys, med hjälp av extrakt sparade i steg 1.44. Se Kompletterande material 2 för detaljer.
  40. Efter dialys är klar alikvot extrakt med 1,5 ml i 1,75 ml mikro-centrifugrör. Centrifugera vid 12000 g under 10 min vid 4 ° C. En pellet bildas på botten av röret.
  41. Konsolidera klar supernatant från föregående steg genom att pipettera i en 15 ml Falcon rör på is. Homogenisera genom att vända 5-10x.
  42. Baserat på koncentrationen bestämdes genom Bradford i steg 1,47, fastställa mängden av extrakt till alikvot i individuella 1,75 ml rör. Varje enskild röret bör ha en volym med 810 till 900 mg totalt protein. Extract bör ha en total proteinkoncentration större än 27 mg / ml. Detta steg kräver stöd för att genomföra ändamåls Obs:. Alikvotera extrakt under 30 mg / ml till 30 l alikvoter och omfattning om koncentrationen är högre, till exempel alikvot extrakt vid 28 mg / ml med 30 pl, och delprov extrakt vid 32mg / ml av 28,1 | il.
  43. Alikvotera extrakt efter steg 1,50, var noga med att undvika bubblor. Flash-freeze extrakt i flytande kväve Anm. Alikvoter med bubblorna kan avlägsnas genom centrifugering vid 10000 x g under 30 sek vid 4 ° C.
  44. Ta bort rören från flytande kväve med hjälp av en sil och omedelbart förvaras vid -80 ° C. Säkerhet: Använd skyddsglasögon, locken av extrakt rören kan lossna på grund av temperaturskillnaden mellan flytande kväve och rumstemperatur.

2. Aminosyralösning Framställning

Amino Acid Lösningen ska beredas i bulk. Följande recept använder en hel sats av RTS Amino Acid Sampler, levererar tillräckligt för cirka 11.000 enskilda reaktioner. Om trappa ner, är det rekommenderat att använda något mindre än en halv sats. Varje aminosyra i lager tillförs med 1,5 ml, 168 mM, med undantag av leucin i 140 mM. Den slutliga sammansättningen av aminosyralösningen är:leucin, 5 mM, alla andra aminosyror, 6 mM. Detta är 4x arbetskoncentration.

  1. Ta bort alla 20 aminosyror från -20 ° C och tinas vid rumstemperatur. När väl tinat virvel tills aminosyror upplösas, inkubering vid 37 ° C om så behövs. Efter aminosyror löses, lägga alla aminosyror på is utom Asn, Phe, och Cys, som förvaras i rumstemperatur. Cys kan inte fullständigt lösas upp.
  2. På is, tillsätt 12 ml sterilt vatten till en steril 50 ml Falcon-rör.
  3. Tillsätt 1,5 ml av varje aminosyra i följande ordning, var noga med att vortexblanda Falcon röret efter varje tillsats och att hålla lösningen på is: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, lie, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys kan tillsättas som en suspension. Efter tillsats, tills lösningen är virvel relativt klar, inkubering vid 37 ° C om så behövs. Cys kan inte fullständigt lösas upp.
  4. Fördela aminosyralösning i 50 rören vid26 pl vardera på is. Alikvotera resten på 500 l per rör på is. De 26 l alikvoter kommer att användas för att kalibrera extrakt, medan de 500 l alikvoter kommer att användas för att förbereda buffert. Medan alikvotering, virvel huvud lager ofta för att undvika ojämna fördelningen av fjädring.
  5. Flash frysa alikvoter i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. Säkerhet: Använd skyddsglasögon, locken av extrakt rören kan lossna på grund av temperaturskillnaden mellan flytande kväve och rumstemperatur.
  6. Tillval: Genomför en aktivitetsanalys av nyligen gjorda aminosyralösning mot tidigare gjorda aminosyralösningar.

3. Energy Solution Förberedelse

Energy Solution används både för att kalibrera råcellextrakt och för att skapa buffert, och bör förberedas i bulk. Följande recept levererar tillräckligt för cirka 10000 enskilda reaktioner. Om trappa ner, är det rekommendernded att använda inte mindre än 1/24 av värden som ges här. Som Energy Solution är en betydande monetär kostnad, kan första gången användare vill förbereda i 1/24 skala. Den slutliga sammansättningen av energilösning är: HEPES pH 8 700 mM, ATP 21 mM, GTP 21 mM, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, tRNA 2,8 mg / ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, cAMP 10,5 mM, folinsyra 0,95 mM, Spermidin 14 mM, 3-PGA 420 mM. Detta är 14x arbetskoncentration. Om så önskas kan varje enskild post i tabell 4 lagras vid -80 ° C för senare användning.

  1. Ta bort alla kemikalier i tabell 4 från -80 ° C, -20 ° C eller 4 ° C till rumstemperatur under 30 min.
  2. Framställ stamlösningar som beskrivs i tabell 4. Se Kompletterande material 1 för recept. Placera alla lösningar på is efter beredning.
  3. I en 15 ml Falcon rör, tillsätt i följande ordning, var noga med att virvel Falcon röret efter varje tillsats och för att hålla de lösningar on ice: 3,6 ml 2 M HEPES, 144 l vatten, 1,39 ml nukleotid mix, 576 l 50 mg / ml tRNA, 576 pl 65 mM CoA, 276 pl 175 mM NAD, 170 pl 650 mM cAMP, 288 l 33,9 mM Folinsyra , 144 pl 1 M spermidin, och 3,09 ml 1,4 M 3-PGA.
  4. Fördela energilösning i 50 rören vid 7 pl vardera på is. Alikvotera resten på 150 l per rör på is. De 7 il alikvoter kommer att användas för kalibrering av extrakt, medan 150 | il alikvoter kommer att användas för framställning av bufferten. Medan alikvotering, virvel huvudlagret ofta.
  5. Flash frysa alikvoter i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. Säkerhet: Använd skyddsglasögon, locken av extrakt rören kan lossna på grund av temperaturskillnaden mellan flytande kväve och rumstemperatur.
  6. Tillval: Genomför en aktivitet analys av nyligen gjorda Energy Solution mot tidigare gjorda Energy Solutions.

4. Buffert Framställning

Buffer Förberedelse kräver slutförandet av råcellextrakt Förberedelser, Amino Acid Solution Förberedelse, och Energy Solution Förberedelse. Varje buffert är unik för ett parti av råcellextrakt. Mg-glutamat, K-glutamat, och DTT (i den ordningen) är optimerade i detta avsnitt för att producera reaktioner gränsvärdena uttryck. Följande protokoll använder en redan skrivna mall, TXTL_e (mall) _calibration_JoVE.xlsx (Supplemental Material 3), för att kalibrera förberedda råcellextrakt och förbereda buffert. Men man kan också kalibrera råcellextrakt och förbereda buffert utan mallen genom att optimera Mg-glutamat, K-glutamat, och DTT manuellt och inrätta buffert så att tillsammans med utdrag, är det 75% av en total reaktionsvolym. Om kalibrering manuellt kan slutliga reaktionsbetingelser finns i steg 5.

  1. Fyll i "Allmänna data" formulär.
  2. Thaw på is 100 mM Mg-glutamat (4 ° C), 3 M K-glutamat (4 ° C), 6mM aminosyralösning (26 | il, -80 ° C), Energi Solution (7 pl, -80 ° C), 100 mM DTT (-20 ° C), positiv kontroll-DNA (-20 ° C), 40% PEG- . 8000 (4 ° C), råcellextrakt (-80 ° C), och vatten (4 ° C) OBS: Använd 1 nM arbetskoncentration pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plasmiden 40019) för den positiva kontrollen (excitation 485 nm, emission 525 nm), eller någon annan referens som producerar hög signalintensitet. fyra
  3. Förbered sju 10,5 il reaktioner, testa en rad 4-10 mM ytterligare Mg-glutamat, genom alikvotering fastställda mängder lager Mg-glutamat i enskilda mikro-centrifugrör. OBS: Även om 10.5 il reaktioner initialt beredd, är det slutliga reaktions 10 pl.
  4. Bered Master Mix som anges i mallen under "Mg-glutamat kalibrering," lägga till en extra 80 mM K-glutamat. Håll på is och skaka efter tillsats av varje objekt Anm. Värdena här och i mallen ärförutom att mängderna av Mg-glutamat, K-glutamat och DTT närvarande i S30B buffert användas för att göra råcellextrakt.
  5. Lägg Master Mix till prover som innehåller Mg-glutamat och förbereda reaktioner. Se steg från 5,10 till 5,13 för detaljerade instruktioner.
  6. Kör reaktionen vid 29 ° C, antingen i en inkubator eller en plattläsare.
  7. . Bestäm optimal Mg-glutamatkoncentrationen i slutet av uttrycksnivå och maximal hastighet av proteinuttryck (Figur 4a) Anm: Runtimes variera beroende på experimentet, men oftast sist i 8 tim.
  8. Upprepa steg från 4,2 till 4,7 till K-glutamat under "K-glutamat kalibrering,"-inställningen Mg-glutamatnivåer till de som hittades i steg 4,7.
  9. Upprepa steg 4,2-4,7 för DTT under "DTT kalibrering," inställningen Mg-glutamatnivåer till de som finns i steg 4,7 och K-glutamat jämnar till de som finns i steg 4,8. Notera: Vi har funnit att lagt DTT påverkar inte signifikant slut expressionsnivåer.
  10. Användvärden som finns i kalibrering under "Buffert sammansättning" för att bestämma sammansättningen av bufferten för att vara förberedd. Baserat på mängden råcellextrakt som produceras, är en huvudblandning recept produceras för en viss summa buffertar.
  11. Tina alikvoter som anges i Master Mix recept på is. När tinats, förbereda Master Mix, hålla på is och virvelbildning efter tillsats av varje objekt.
  12. Delmängd av belopp som anges under "Buffert sammansättning." Flash-frysa buffert rör i flytande kväve. Medan alikvotering, virvel huvud lager ofta.
  13. Ta bort rören från flytande kväve med hjälp av en sil och omedelbart förvaras vid -80 ° C. Säkerhet: Använd skyddsglasögon, locken av extrakt rören kan lossna på grund av temperaturskillnaden mellan flytande kväve och rumstemperatur.

5. Experimentell Utförande av en TX-TL Reaktion

Slutliga reaktionsbetingelser är: 8,9 till 9,9 mg / ml protein (från råextrakt), 4,5 mM-10,5 mM Mg-glutamat, 40 till 160 mM K-glutamat, 0,33 till 3,33 mM DTT, 1,5 mM av varje aminosyra utom leucin, 1,25 mM leucin, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP och GTP, 0,9 mM CTP och UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0,068 mM folinsyra, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000. En grundläggande TX -TL reaktion har 3 delar (rör): råcellextrakt, buffert, och DNA. Förhållandet är: 75% buffert och extrakt, 25% DNA Reaktionerna kan variera i volym, och vi använder 10 pl av konvention för att minimera reaktionsvolym och möjliggöra att köra i en 384-brunnar.. Större volymer kräver omrörning för korrekt syresättning. Följande protokoll utnyttjar en redan skrivna mall, TXTL_JoVE.xlsx (Supple Material 4), att genomföra en 10 pl reaktion. Poster i lila indikerar användaringångsvärden och poster i blått indikerar ytterligare reagens för att lägga till reaktionen. Men man kan också göra en reaktion kvickhetHout mallen genom att följa reaktionsbetingelser som beskrivs ovan.

  1. Fyll i "Allmänna data" formulär.
  2. Under "Master Mix Förberedelse," sätta extraktet procentvärde från steg 4.1 i den lila rutan.
  3. Utforma experimentet in silico hjälp av "Master Mix Förberedelser" (v 10-17) och "DNA-preparation" (raderna 19-50) sektioner. Generellt kan konstanterna sättas i avsnittet "Master Mix Förberedelse", medan variabler kan sättas in i avsnittet "DNA-preparation". Minimera prover per försök att undvika prov avdunstning och experimentell starttid partiskhet. Se Figur 6 för en prov inställning.
  4. Under "Master Mix Förberedelse," lägga reagenser såsom inducerare eller proteiner, som kommer att gå i alla prover med konstant koncentration. Från och med rad 14, fyll i det blå skuggade områden, hålla en reagens till varje rad. Enheter är relativa förhållanden.
  5. Under "DNA-preparation," lägga till DNA som kommer att prov specifikaIC. Prov-ID # 1 och # 2 motsvarar positiva och negativa kontroller, respektive. Prov-ID # 3 och ovan är användar modifierbara för DNA, lager koncentrationen i ng / l, längd i baspar, önskade slutliga koncentrationen i nM, och upprepningar (av 10 pl reaktioner). Mängden av lager-DNA för att nå önskade slutkoncentrationen beräknas automatiskt. . Total över rad-summor till 10,5 * n, där n är antalet upprepningar Notera: Även om den slutliga reaktionsvolymen är 10 l, beräkningarna antar en total volym på 10,5 l per reaktion, att ta hänsyn till volym förlorade under pipettering.
  6. Under "DNA-preparation," lägga reagenser eller ytterligare DNA som kommer att prov specifik för blå kolonner. Stock DNA-koncentrationer i nM kan beräknas under "DNA-preparation", medan prov specifika reagenser kräver manuell beräkning baserad på en total reaktionsvolym av 10,5 * n. De angivna volymerna subtraheras ur vattnet volym av samma rad.
  7. Avlägsna behövs number av rör med buffert, råa cellextrakt, och en positiv kontroll under "Rör tina" från -20 ° C eller -80 ° C och tinas på is.
  8. Förbered DNA-prover. För varje prov-ID, alikvot ut den indikerade DNA, vatten och användar levererade artiklar per avsnittet "DNA-preparation" i en mikro-centrifugrör, vid rumstemperatur. Obs: för att undvika provförlust, nyligen kalibrerade pipetter och låg-stick pipettspetsar och mikro-centrifugrör rekommenderas.
  9. När rör från steg 5,7 tinas, förbereda huvudblandning bestående av buffert, extrakt, och eventuella globala användar levererade artiklar baserade på de orange-skuggade rutor, hålla på is och virvelbildning efter tillsats av varje objekt Anm. Extract är extremt viskös. Alikvoter med bubblorna kan avlägsnas genom centrifugering vid 10000 x g under 30 sek vid 4 ° C.
  10. Lägg mängden huvudblandning som anges i de orange celler under "DNA-preparation" (kolumn O) till varje DNA-prov, och hålla i rumstemperaturTure. Behandla detta som reaktions starttid.
  11. Vortexa varje prov och centrifugera vid 10.000 x g under 30 sek vid rumstemperatur för att få ned eventuellt kvarvarande prov och för att reducera bubblor.
  12. Om bedriva reaktion i mikro-centrifugrör, inkubera direkt vid 29 ° C. . Annars pipett 10 ìl av provet i en 384-brunnar OBS: Reaktioner i större volymer än 10 l kan kräva agitation för syresättning.
  13. Centrifugera plattan vid 4000 x g under 30 sek vid rumstemperatur för att få ned eventuellt kvarvarande prov och för att reducera bubblor. Förslut plattan efteråt för att förhindra avdunstning.
  14. Kör reaktion vid 29 ° C. OBS: Runtimes varierar beroende på experiment men vanligtvis varar i 8 timmar.

Representative Results

Vi har presenterat en fem dagars protokoll för beredning av en endogen Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem. Ett prov tidslinje för att skapa de reagens - råcellextrakt och buffert - kan hittas i figur 1. En gång skapats kan dessa förvaras vid -80 ° C i upp till ett år. Efter reagenser skapas, kan experimentuppställning och utförande göras på mindre än 8 timmar.

Dessutom har vi optimerat expressionsförhållanden TX-TL cellfria expressionssystem. Andra användarmatade tillsatser, såsom buffertar eller DNA-lösningar, bör kalibreras med avseende på toxicitet i förväg. Till exempel, olika metoder för bearbetning plasmider resulterar i olika uttryck beroende på salthalt. Vi testade även effekten av Tris-Cl elueringsbuffert på reaktionseffektiviteten (Figur 5).

Ett exempel på råcellextrakt kalibrering, hänvisa steg från 4,1 till 4,9, visasi figur 4a. I allmänhet våra experiment visar att det råa cellextraktet är mest känsligt för Mg-glutamatnivåer, följt av K-glutamatnivåer. För att demonstrera den cellfria expressionssystem, vi konstruerat och testat en negativ återkopplingsloop baserad på tet-repression. 26 (figur 6). I det cellfria expressionssystem, samma krets körning med och utan ATC visar en 7-faldig ändpunktsexpressionsändring deGFP reporter efter åtta timmar av uttryck. Trots att detta experiment inte kräver globala inducerare eller repressorer, om nödvändigt kan de läggas till under "Master Mix Förberedelse."

Figur 1
Figur 1. Tidslinje för råcellextrakt, aminosyralösning, och förberedelse energilösning. En femdagars timelin e för ett typiskt utförande av protokollet ges ovan, optimerad för övernattning inkubationer och dagtid arbetssteg.

Figur 2
Figur 2. Kostnad och uttrycksanalys av konkurrerande extrakt rå cell. a) Fördelning av kostnaderna för arbetskraft och material för TX-TL cellfria expressionssystem. Baserat på kostnader för reagens och med december 2012 och arbetskostnader för $ 14 per timme. B) Jämförelse av TX-TL kostnader cellfria expressionssystem jämfört med andra kommersiella system. Kostnaderna fördelar sig per il, även om reaktionsvolymen kan variera per sats. C) Jämförelse av TX-TL cellfria expressionssystem avkastning kontra andra kommersiella system. Proteinuttryck avkastning bestäms av tillverkarens standarder./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Lastning och bearbetning av en pärla-stryk röret. a) Demonstration av rätt viskositet för cell-pärla lösning. Cell-pärla lösning kommer att ha en viskositet beroende av många faktorer, bland annat mängden S30A buffert till, mängden pärlor tillsatta, och tid på isen. B) Påfyllning av pärla-slå röret innan snabb bordscentrifugering. Den centrifuge bort bubblor ackumulerats under lastning. C) Bubbles beläggningsarbeten efter bordscentrifugering. Storleken av bubblorna kommer att variera, och de kan dök eller avlägsnas med användning av en pipettspets d) helt fylld vulst ledande röret före begränsning.. En menisk bildas i pärlan-stryk tUbe, och locket har tillräckligt för att täcka och orsakar små mängder för att överfylla. e) Rätt laddade filterapparat. Dessa kan återanvändas. F) Jämförelse av rätt kontra fel bearbetat pärla ledande rör. Röret till vänster är en väl-beat tube - det finns en liten och väl avgränsad översta lagret, och mycket klar supernatant. Röret till höger är suboptimal, baserat på den större, disigt andra skiktet och den dimmiga supernatanten. Rör som är suboptimal bör inte genomgå ytterligare bearbetning.

Figur 4
Figur 4. Egenskaperna hos preparat råextrakt. a) Typiska kalibrerings tomter för råcellextrakt. Råextrakt är kalibrerat för ytterligare Mg-glutamat, K-glutamat, och DTT-nivåer, i den ordningen. Visas är endpoint fluorescence efter 8 timmar, samt maximal hastighet av proteinproduktion baserad på en 12-minuters glidande medelvärde. Baserat på dessa ytor, är ett godtagbart intervall av ytterligare Mg-glutamat 4 mM, K-glutamat är 60-80 mM och DTT är 0-3 mM. Observera att varje råextrakt måste kalibreras individuellt för dessa tre variabler. B) Variation från förberedelser extrakt. Endpoint fluorescens av två råextrakt som framställts på olika datum visas, felstaplar är 1 standardavvikelse från tre oberoende körningar på olika dagar. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5
Figur 5. Effekter av DNA-lösningen på expressionseffektivitet. a) Jämförelse av två olika reningsmetoder för behandling av plasmider. 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 är beredd att använda endast en QIAprep Spin Miniprep Kit (Rening metod 1) och efterbehandlade med en QIAquick PCR-reningssats (Rening metod 2). Visas är endpoint fluorescens efter 8 timmar, samt maximal hastighet av proteinproduktion baserad på en 12 minuters glidande medelvärde. Felstaplar är en standardavvikelse från fyra oberoende körningar på olika dagar. B) Effekt av elueringsbuffert (Tris-Cl). Olika koncentrationer av Tris-Cl jämförs i ett cellfritt uttryck reaktion baserad på uttrycket av 1 nM av pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Koncentrationer anges är slutliga koncentrationer av Tris-Cl i reaktionen; elueringsbufferten som används är 10 mM Tris-Cl. Felstaplar är 1 standardavvikelse från tre oberoende körningar på olika dagar. Klicka här för att visa en större bild .


Figur 6. Prov TX-TL körning av en negativ återkopplingsslinga. a) Provformatet i ett cellfritt utförande reaktionen. Tester "på" kontra "off" läget i negativ återkoppling, med positiva och negativa kontroller. B) Plasmid karta över negativ återkoppling. C) Representativa resultat. Data visar experiment i a) och b), med negativ kontroll subtraheras från signalen. Genetisk krets som visas i insatsen. Felstaplar är 1 standardavvikelse från tre oberoende körningar på olika dagar. Klicka här för att visa en större bild .

Namn Koncentration Mängd Sterilisering Anmärkningar
Kloramfenikol (Cm) 34 mg / ml i etanol 1 ml Filtrera sterilisera (0,22 | iM) Kan tillverkas i större volymer lagras vid -20 ° C för senare användning.
2xYT + P + Cm agarplatta 31 g / L 2xYT, 40 mM kaliumfosfat, dibasiskt, 22 mM kaliumfosfat, monobasiskt, 34 pg / ml kloramfenikol En platta Autoklav
2xYT + P media 31 g / L 2xYT, 40 mM kaliumfosfat dibasiskt, 22 mM kaliumfosfat monobasiskt 4 L Autoklav

Tabell 1. Reagens för dag 1 av råcellextrakt protokoll.

Namn Koncentration Mängd Sterilisering Anmärkningar
Tris-bas 2 M 250 ml Filter sterilisera (0,22 M) eller autoklav Kan förvaras vid rumstemperatur.
DTT En M 6 ml Filtrera sterilisera (0,22 | iM) Kan tillverkas i större volymer och lagrades vid -20 ° C för senare användning.
S30A buffert 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7,7 2 L Autoklav För att nå pH 7,7, titrera med ättiksyra. Lägg DTT till 2 mM slutlig koncentration just före användning. Förvaras vid 4 ° C.
S30B buffert 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 2 L Autoklav För att nå pH 8,2, titrera med 2MTris. Lägg DTT till 1 mM slutlig koncentration just före användning. Förvaras vid 4 ° C.

Tabell 2. Reagens för dag 2 av råcellextrakt protokoll.

Falcon
1 2 3 4
Tomma 50 ml Falcon (g)
50 ml Falcon med pellet (g)
Pellets massa (50 ml Falcon med pellets - tom 50 ml Falcon) (g)
S30A buffertvolym för att lägga till (pelletsmassa * 0,9) (ml)
Totala massan av pärlor att lägga till (pelletsmassa * 5,0) (g)

Tabell 3. S30A buffert och pärla mass kalkylator, för dag 3 av råcellextrakt protokoll.

Namn Koncentration Mängd Sterilisering Anmärkningar
HEPES 2 M, pH 8 4 ml Inget För att nå pH 8, titrera med KOH.
Nucleotide Mix 156 mM ATP och GTP, 94 mM CTP och UTP, pH 7,5 1,5 ml Inget För att nå pH 7,5, titrera med KOH.
tRNA 50 mg / ml 600 | il Inget
CoA 65 mM 600 | il Inget
NAD 175 mM, pH 7.5-8 300 | il Inget För att nå pH 7.5-8, titrera med Tris vid 2 M.
cAMP 650 mM, pH 8 200 | il Inget För att nå pH 8, titrera med Tris vid 2 M.
Folinsyra 33,9 mM 300 | il Inget Även om det krävs bara 300 l, är recept på extra för 1,15 ml.
Spermidin En M 150 | il Inget Lagra vid 4 ° C, upphetta till 37 ° C för att smälta.
3-PGA 1,4 M, pH 7,5 3,2 ml Inget För att nå pH 7,5, titrera med Tris vid 2 M.

Tabell 4. Reagenser för att förbereda sig för Energy Solution-protokollet.

Supple Material 1. Recept för objekt.

Kloramfenikol, 34 mg / ml: Förbered 0,51 g kloramfenikol och lägga etanol till 15 ml. Filtrera sterilisera (0,22 M), alikvot till 1 ml rör, förvara vid -20 ° C för senare användning.

2xYT + P + Cm agarplatta: Förbered 1,24 g 2xYT, 1,6 ml kaliumfosfat dibasisk lösning @ 1 M, 0,88 ml kaliumfosfat monobasiskt lösning @ 1 M, 0,6 g agar, och vatten till 40 ml. Autoklav. Låt svalna till 50 ° C och tillsätt 40 l Cm. Fördela 25 ml i en 100 x 15 mm petriskål, och låt svalna i en timme.

2xYT + P medier: Förbered 124 g 2xYT, 160 ml kaliumfosfat dibasisk lösning @ 1 M, 88 ml kaliumfosfat monobasiskt lösning @ 1 M, och vatten till 4 L. Aliquot ut i 2 x 1,88 L och 0,24 L autoklav.

Tris-bas, 2 M: Förbered 60.57 g Tris bas och vatten till 250 ml. Sterilisera, lagra vid RT för senare användning.

DTT, 1 M: Förbered 2,31 g DTT och vatten till 15 ml. Filtrera sterilisera (0,22 M), alikvot till 1 ml rör, förvara vid -20 ° C för senare användning.

S30A buffert: Förbered 10,88 g Mg-glutamat och 24.39 g K-glutamat, 50 ml Tris vid 2M, ättiksyra (till pH 7,7), och vatten till 2 L. Autoklav, förvara vid 4 ° C, tillsätt 4 ml 1 M DTT före användning.

S30B buffert: Förbered 10,88 g Mg-glutamat och 24.39 g K-glutamat, Tris vid 2 Mkr (till pH 8,2), och vatten till 2 L. Autoklav, förvara vid 4 ° C, tillsätt 2 ml 1 M DTT före användning.

HEPES: Förbered 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (till pH 8) och vatten till 4 ml.

tRNA: Förbered 30 mg tRNA och vatten till 600 pl.

CoA: Bered 30 mg av CoA (molvikt 767,53) och vatten till 600 | il.

NAD: Lägg 34.83 mg NAD (MW 663,43), Tris vid 2 Mkr (till pH 7.5-8), och vatten till 300 ^. (Lägg till 27 l av Tris vid 2 miljoner för att ge lösningen till pH 7.5-8).

cAMP: Lägg 42,80 mg av cAMP (MW 329,22), Tris vid 2 Mkr (till pH 8), och vatten till 200 ^. (Lägg till 73 l av Tris vid 2 miljoner för att ge lösningen till pH 8).

Folinsyra (33,9 mM): Till 20 mg fast folinsyra kalciumsalt (MW 511,5), tillsätt 1,15 ml vatten.

Spermidin: Förbered 23.55 pl spermidin (MW 145,25) och vatten till 150 pl. Bered vid rumstemperatur efter smältning kort vid 37 ° C.
3-PGA: Lägg till 1,03 g av 3-PGA (MW 230,02), Tris vid 2 M (till pH 7,5) och vatten till 3,2 ml. (Lägg till 1,73 ml Tris vid 2 miljoner för att ge lösningen till pH 7,5).

Nucleotide Mix: Lägg till 145 mg ATP dikaliumsalt dihydrat (MW 619,4), 133 mg av GTP dinatriumsalt (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumsaltdihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumsalt dihydrat (MW 586,12) , KOH vid 15% spädning (till pH 7,5) och vatten till 1,5 ml. (Lägg till 353 l av KOH 15% spädning för att lösningen till pH 7,5).

Kompletterande materialet 2. Bradford-analys.

  1. Ta Bradford agent från 4 ° C och ställ i rumstemperatur.
  2. Förbered 50 pl BSA standard vid 1 mg / ml och vid 0,1 mg / ml.
  3. Förbered 40 l 20x utspädning av extrakt från steg 1,47.
  4. Addera 800 pl vatten till 7 kuvetter.
  5. Bered standard kyvetter för 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 | il 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 | il 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ^ il 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 pl 1 mg / ml BSA).
  6. Förbered experimentella kyvetter för 2 l av prov och 4 l av prov.
  7. Addera 200 pl av Bradford agent till varje kuvett och blanda väl by pipettering. Inkubera vid rumstemperatur under åtminstone 10 min.
  8. Producera standardkurva vid OD 595 nm med hjälp av kyvetter från steg 6,5. Avvisa standardkurva om r 2 <0,95.
  9. Bestäm extrakt koncentration vid OD 595 nm med hjälp av kyvetter från steg 6.6.

Kompletterande materialet 3. Buffert kalibrerings kalkylblad.

Se TXTL_e (mall) _calibration_JoVE.xlsx .

Kompletterande materialet 4. Cell-yttrandefrihet köra kalkylblad.

Se TXTL _JoVE.xlsx .

Discussion

Den endogena Escherichia coli baserad TX-TL cellfria expressionssystem som beskrivs här är en enkel att köra tre rör reaktion som kan ta mindre än åtta timmar från inrättats för att datainsamling. Processen att skapa alla reagenser kräver fem dagars tid totalt (med stora behov av arbetskraft på bara en dag), men producerar råextrakt för 3.000 reaktioner och buffert-göra reagenser för 10.000 reaktioner (Figur 1). Dessutom råextrakt och buffert-göra reagenser är stabila i minst 1 år vid -80 ° C, vilket möjliggör flera användningsområden för ett preparat. 4 På $ 0,11 per 10 pl reaktion ($ 0,26 inklusive arbetskraft), kostnaderna är 98% lägre än jämförbara kommersiella system (figur 2).

Det finns några olösta begränsningar emellertid till systemet. Slut effektivitet varje råcellextrakt preparatet kan variera beroende på användarens kompetens och miljöförhållanden, även om typical avkastning variationen är mellan 5-10% (figur 4b). Som ett resultat, batch-till-batch variation i både slutpunkten uttryck och uttrycksdynamik är att vänta. Dessa variationer kommer sannolikt att förbli tills extraktet helt karaktäriseras eller tills extrakt skapelsen är helt automatiserad. Om cellfria expressionssystem används för att utföra känsliga kvantitativa experiment, är det lämpligt att köra alla experiment med samma parti av råcellextrakt. Utbytet från en enda råcellextrakt sats, cirka 3000 reaktioner bör vara tillräckliga för typiska experimentella kurser. Även om vi misstänker att variationen kan tas bort genom att skala upp och automatisera förfarandet, skulle sådana försök innebär en betydande investering resurs.

Dessutom, även om slutpunkten uttrycksnivåer är relativt lätt att avgöra, behöver mer arbete att göra för att förstå dynamiken inneboende till cellfritt system. Det är känt att både resurs KONKURRENSn och resursbegränsning kan påverka uttrycks dynamik. Exempelvis kan begränsad endogen sigma 70 resultera i en mätt regim med ökad DNA-mall som producerar en expressionsprofil analogt med det i nukleotid-eller aminosyra utarmning. 9,27 dock dynamiken har inte till fullo förstås att utnyttja systemet. För rena ökningar av avkastningen, kan optimering göras av maskinlärandestrategier. 28 Frågor om resurskonkurrens och begränsning kan åtgärdas genom matematiska modeller verifieras med hjälp av experimentella data.

Protokollet presenteras här är optimerad för en BL21-Rosetta2 stam, men är generaliserbara till andra E. coli-stammar. Modifieringar i BL21-Rosetta2, såsom avlägsnande av den gen som kodar lon proteas och tillsättning av gener som kodar sällsynta tRNA, möjliggöra maximal proteinproduktion. Vi har försökt protokollet med två andra stammar extrakt - bara BL21 och BL21 TrxA knockout-end fann 50% lägre proteinavkastning. Vår hypotes är att avkastningen på motsvarande sätt minskar vid användning av andra stammar. Övriga förändringar av parametrar, som till exempel att byta 2xYT tillväxtmedium för LB och andra rika buljonger, har resulterat i minskad proteinavkastning.

Cellfria expressionssystem utnyttjar både endogena och exogena transkription-translation maskiner och regleringsmekanismer har breda tillämpningar inom både protein och metabolit uttryck och i syntetisk biologi. 3,29 Istället för att vara begränsad till T7-reglerade kretsar, kan man föreställa sig att producera komplexa biomolekyler på ett användar kontrollerbar miljö med hjälp av en blandning av infödda E. coli-promotorer och exogent medföljande transkription och reglermekanismer. Utan begränsningar av celldelning och metabolism, kan variationen i syntetiska kretsar såsom repressilator eller metaboliska konstruerad vägar som de som producerar artemisinin minskas eller bättre förstås. 30,31 Vi HAVe använt dessa fördelar för att genomföra genetiska switchar, samt att förstå sigmafaktor kvarstad 9,32 Sådan teknik kan också utgöra ryggraden i "minimal" eller "artificiella" celler -. liten, väl karakteriserad och självförsörjande förkroppsligad enheter extrakt. 33,34

I slutändan, vi räknar med omedelbar användning av denna endogena cellfria expressionssystem som ett prototypmiljö för syntetisk biologi. Och kallas "TX-TL biomolecular breadboard", det cellfria expressionssystem tillhandahåller en styrbar miljö där syntetiska kretsar slutligen avsett för in vivo-uttryck kan genomgå rundor av prototyper - cykler av testning på grundläggande plasmid, linjär, eller kemiskt syntetiserade DNA: t, följt genom analys och snabb förändring. Prototyp rundor kan vara hjälpt av prediktiva matematiska modeller håller på att utvecklas. Genom att ta bort kloning och in vivo manipulation för icke-slutkretsar, räknar vi ingenjörerneering cykeltiderna reduceras till 1-3 dagar i stället för de aktuella veckors standard.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, och Enoch Yeung om hjälp att effektivisera protokollet, och Clare Chen och Barclay Lee för att få hjälp i ett tidigt skede av projektet. Detta material är baserat på arbete stöds delvis av Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Gjuterier program, kontraktsnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS stöds också av en UCLA / Caltech Medical Scientist träningsprogram gemenskap och genom en DoD, flygvapnet Office of Scientific Research, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De åsikter och slutsatser i detta dokument är författarnas egna och ska inte tolkas som officiellt politik, varken uttryckligen eller underförstått, för Defense Advanced Research Projects Agency och den amerikanska regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT MP biomedicals 3012-032  
3-PGA Sigma-Aldrich P8877  
ATP Sigma-Aldrich A8937  
Bacto-agar BD Diagnostics 214010  
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) BioSpec 522S  
Beads, 0.1mm dia. BioSpec 11079101  
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Novagen 71402  
Bradford BSA Protein Assay Kit Bio-rad 500-0201  
cAMP Sigma-Aldrich A9501  
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919  
CoA Sigma-Aldrich C4282  
CTP USB 14121  
Cuvettes, 1.5ml Fisher 14-955-127  
DTT Sigma-Aldrich D0632  
Folinic acid Sigma-Aldrich F7878  
GTP USB 16800  
HEPES Sigma-Aldrich H6147  
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149  
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605  
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 732-6204  
NAD Sigma-Aldrich N6522  
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo-Scientific 142761  
Nunc sealing tape Thermo-Scientific 232701  
PEG-8000 Promega V3011  
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich P8584  
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich P8709  
RTS Amino Acid Sampler 5 Prime 2401530  
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo-Scientific 66382  
Spermidine Sigma-Aldrich 85558  
Tris base Fischer BP1521  
tRNA (from E. coli) Roche Applied Science MRE600  
UTP USB 23160  
1L Centrifuge Bottle Beckman-Coulter A98813 This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.
4L Erlenmeyer Flask Kimble Chase 26500-4000  
Avanti J-26XP Centrifuge Beckman-Coulter 393127 Or 1L-capable centrifuge equivalent.
Forma 480 Orbital Shaker Thermo Scientific 480 Or chest-size 6x4L shaker equivalent.
JLA-8.1000 Rotor Beckman-Coulter 363688 Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.
Mini-Beadbeater-1 BioSpec 3110BX  
Supplemental Material 1. Recipes for Items.
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use.
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour.
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave.
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use.
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use.
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use.
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use.
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml.
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl.
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl.
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8).
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8).
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water.
Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C.
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5).
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5).
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
  1. Remove Bradford agent from 4 °C and set at room temperature.
  2. Prepare 50 μl BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.
  3. Prepare 40 μl 20x dilution of extract from step 1.47.
  4. Add 800 μl water to 7 cuvettes.
  5. Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA).
  6. Prepare experimental cuvettes for 2 μl of sample and 4 μl of sample.
  7. Add 200 μl of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.
  8. Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 < 0.95.
  9. Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet.
See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx.
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet.
See TXTL _JoVE.xlsx.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  2. He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochem. 46, 615-620 (2011).
  3. Forster, A. C., Church, G. M. Synthetic biology projects in vitro. Genome Res. 17, 1-6 (1101).
  4. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).
  5. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).
  6. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).
  7. Shin, J., Noireaux, V. Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system. Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).
  8. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).
  9. Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits. Pao, L., Abramovitch, D. American Control Conference, Jun 17-19, Washington, DC, AACC. 1531-1536 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Physical review letters. 106, 048104 (2011).
  11. Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis. J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).
  12. Wood, W. B., Berg, P. Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).
  13. Zubay, G. In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).
  14. Pratt, J. M. Transcription and Translation: A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. IRL Press. 179-209 (1984).
  15. Kim, H. C., Kim, D. M. Methods for energizing cell-free protein synthesis. Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).
  16. Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome. Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).
  17. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).
  18. Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).
  19. Kwok, R. Five hard truths for synthetic biology. Nature. 463, 288-290 (2010).
  20. Tabor, S., Richardson, C. C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).
  21. Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase. Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).
  22. Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins. Nucleic acids research. 34, e135 (2006).
  23. Kigawa, T., et al. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).
  24. Matsuda, T., et al. Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling. Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).
  25. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).
  26. Becskei, A., Serrano, L. Engineering stability in gene networks by autoregulation. Nature. 405, 590-593 (2000).
  27. Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase. Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).
  28. Caschera, F., et al. Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis. Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).
  29. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).
  30. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  31. Tsuruta, H., et al. High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli. Plos One. 4, e4489 (2009).
  32. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  33. Jewett, M. C., Forster, A. C. Update on designing and building minimal cells. Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).
  34. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
Protokoll för Implementera en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Baserad TX-TL Cell-Free Expression System för syntetisk biologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762, doi:10.3791/50762 (2013).More

Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762, doi:10.3791/50762 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter