Summary
ويرد البروتوكول المنظم لفحص خلية مقرها بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب باستخدام التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS). الفحص لا يمكن أن يؤديها مع خلايا الدم المحيطية الطازجة أو المجمدة (PBMCs) واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام.
Abstract
تفاصيل هذا البروتوكول الإجراء التجريبية والتحليلية لفحص خلية مقرها وضعت في المختبر لدينا بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب عند الأطفال أعراض والمتضررة. يتكون الاختبار من تقييم الحالة الوظيفية للغي وع البروتينات في الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من خلال التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS)، وذلك باستخدام أداة التلقائية وفقا CDS-، وتصنيف الأطفال إلى ثلاث مجموعات وظيفية (FG1 ، FG2، FG3) فيما يتعلق الشخصى التوازن بين درجة استجابة لغي وع البروتينات التحفيز. تأكيد التصنيف مزيد من التأثير المتباين للosteopontin (OPN) على الاستجابة لتحفيز غي بين الجماعات والمشار إليها تطور شديد من المرض عن طريق FG2. تقريبا، لا بد من حجم 10 مل من الدم لاستخراج PBMCs بواسطة Ficoll-الانحدار والخلايا ثم يتم تخزينها في النيتروجين السائل. عدد كاف من Pيتم الحصول على خلايا نخاع العظم لأداء الفحص بعد يومين من زراعة الخلايا. أساسا، يتم تحضين الخلايا الأولى مع phytohemmaglutinin (فا). بعد 24 ساعة الحضانة، يتم استبدال المتوسطة من قبل مستنبت خالية من PHA ل24 ساعة إضافية قبل البذر الخلية والعلاج OPN. ثم يتم فحص الخلايا الطيفي لردودها على السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول، التي تنشط على التوالي غي وع البروتينات من خلال مستقبلاتها وما شابه ذلك. يتم حقن كل من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول في وقت واحد مع نظام FLUIDICS متكاملة وتتم مراقبة ردود الخلايا لمدة 15 دقيقة. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع PBMCs الطازجة أو المجمدة واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام.
Introduction
الجنف مجهول السبب هو تشوه العمود الفقري لسبب غير معروف تعرف عموما بأنها انحناء الجانبي أكبر من 10 درجة مصحوبة التناوب الفقري 1. يؤثر على حالة 4٪ من السكان ويتم تشخيص الأطفال الأكثر شيوعا بين سن 9 إلى 13 عاما 2،3،4. التشخيص هو في المقام الأول من الإقصاء ويتم فقط بعد استبعاد الأسباب الأخرى للتشوه في العمود الفقري مثل تشوه العمود الفقري، أو اضطرابات العصبية والعضلية المتلازمات. تقليديا، تبين عدم التماثل trunkal من قبل آدمز اختبار الانحناء إلى الأمام، ويقاس مع مقياس الجنف خلال الفحص البدني 5. ويمكن بعد ذلك يتم تأكيد التشخيص عن طريق التصوير الشعاعي للمراقبة من منحنى وقياس زاوية باستخدام طريقة كوب 6.
مرة واحدة تم تشخيصها، الشغل الشاغل للأطباء في إدارة الأطفال جنفي هو ما إذا كان منحنى سوف تقدم. في الواقع، وتطور منحنى لا يمكن التنبؤ بها في كثير من الأحيان وهو لوحظ بين الفتيات بشكل متكرر أكثر من الفتيان في 7. إذا لم يعالج، يمكن أن منحنى التقدم بشكل كبير، وخلق تشوهات جسدية كبيرة ومشاكل القلب حتى. هذه المظاهر أصبحت تهدد الحياة عندما يتجاوز منحنى 70 درجة 8،9. وتشمل خيارات العلاج الحالية لمنع أو وقف تطور منحنى تستعد والجراحة. بشكل عام، ينصح تستعد لمنحنيات بين 25-40 درجة مئوية، في حين تم حجز جراحة لمنحنيات أكبر من 45 درجة أو لا تستجيب لتستعد.
حوالي 10٪ من الأطفال تشخيص الجنف مجهول السبب يكون تطور منحنى تتطلب جراحة تصحيحية 10. حاليا، لا توجد طريقة مؤكدة أو اختبار متاح لتحديد هذه الفئة من المرضى. بالتالي، يتعرض جميع الأطفال لتشخيص الصور الشعاعية متعددة على مدى عدة سنوات، وعادة حتى تصل إلى مرحلة النضج الهيكل العظمي. وتشير التقديرات إلى أن المرضى نموذجية مع جنف سيكون لهاما يقرب من 22 الفحوصات الإشعاعية على مدى فترة 3 سنوات 11. بسبب الخطر المحتمل من الامتحانات التصوير الشعاعي متعددة، والنهج البديلة التي يمكن أن تسمح بأداء تشخيص الجنف مجهول السبب دون تعريض الأطفال للإشعاع المؤين تكون مرغوبة بشدة. بهدف تلبية هذه الحاجة، وقد وضعنا سابقا الفحص فحص خلية مقرها كاختبار النذير لتحديد عاجلا الأطفال المعرضين للخطر أعراض الجنف مجهول السبب من تطوير. ويتوقع اختبار نتائج السريرية في كل من الأطفال أعراض وتتأثر دراسة الوضع الوظيفي للبروتينات غي وتصنيف الأطفال إلى ثلاث مجموعات وظيفية (FG1، FG2 وFG3) وفقا لدرجة الحد الأقصى ردا على البروتين غي التحفيز 12 مقاسا CDS نظام قائم. ويستخدم هذا النظام إلى حد كبير لتقييم نقل الإشارة من خلال البروتينات G في مختلف أنواع الخلايا 13،14،15،16. انه يعطي معلومات عن مجموعه متكاملة من استجابة الخلايا للمؤثرات الخارجية من خلال قياس التغيرات في مقاومة بعد تنشيط مستقبلات سطح الخلية. هي المصنفة الخلايا في microplates التي تحتوي على أقطاب كهربائية في الجزء السفلي من الآبار ويطبق نظام الجهد الصغيرة التي تحفز التيارات خارج الخلية والعابر للخلايا. بعد حقن المركب في البئر، يتم تحفيز مستقبلات سطح الخلية وتحدث الأحداث نقل الإشارة، مما يؤدي إلى التغيرات الخلوية التي تؤثر على تدفق تيارات خارج الخلية والعابر للخلايا، وبالتالي تؤثر على حجم قياسه. مع هذا النهج، والمرضى والأطفال جنفي أكثر عرضة لخطر تطوير جنف هي أقل استجابة لغي تحفيز البروتين مقارنة مع الضابطة صحية، ويستند التصنيف على نسبة الدرجة من انخفاض نسبي للسيطرة على المجموعة. يتم إصلاح النطاقات تصنيف بين 10 و 40٪ لFG3 و 40 و 60٪ لFG2، و 60، و 90٪ للFG1 12.
ق ق = "jove_content"> وفي الآونة الأخيرة، قمنا بتعديل هذا النهج من خلال إظهار أن المجموعات الوظيفية الثلاثة يمكن تمييزها بوضوح وفقا لمحة من عدم التوازن بين الاستجابة لغي والتحفيز ع. في الواقع، وجدنا أن الاستجابة لتحفيز غي سادت في FG3، في حين لم يلاحظ أي خلل واضح في FG2. في المقابل، أظهرت FG1 غلبة للاستجابة لتحفيز ع. بالإضافة إلى ذلك، قدمنا أدلة على أن المرضى الذين ينتمون إلى FG2 هي أكثر عرضة للخطر من يتقدم إلى نقطة تحتاج إلى عملية جراحية 17. وكذلك تم تحسين دقة هذا الاختبار تصنيف من خلال إظهار تأثير الفرق من osteopontin (OPN) على الاستجابة لتحفيز غي بين المجموعات الوظيفية.
نحن هنا توثيق خطوات تفصيلية من الإجراءات التجريبية والتحليلية لهذا الاختبار وظيفية يؤديها حاليا في مختبرنا.
Protocol
يتم تنفيذ الإجراء بأكمله من تحت غطاء محرك السيارة البيولوجية العقيمة وجميع الحلول والمعدات ملامسة الخلايا يجب أن تكون معقمة.
1. إعداد حلول الأساسية
- إعداد الحلول وفقا للجدول 1.
- الحفاظ على محلول ملحي متوازن (BSS) في درجة حرارة الغرفة وجميع الحلول الأخرى في 4 درجات مئوية حتى وقت الاستخدام.
- وسائل الاعلام الباردة الحارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لبضع دقائق قبل استخدام.
2. إعداد وتخزين PBMCs
- جمع 10 مل من الدم الكامل في أنابيب جمع المعالجة EDTA لإعداد اثنين مأخوذة من PBMCs باستخدام 5 مل لكل قسامة.
- نقل 5 مل من الدم الكامل من أنبوب جمع المعالجة EDTA إلى أنبوب 50 مل.
- إضافة حجم مساو من BSS وخلط عينة من قبل pipetting طيف صعودا وهبوطا.
- وضع 3 مل من Ficoll في اثنين من 15 مل أنابيب فالكون.
- طبقة بعناية 4.5 ملمن المخفف خليط الدم خلال Ficoll في كل أنبوب.
- السماح للأنابيب راحة لمدة تصل إلى 5 دقائق لصالح فصل واضح من الدم وFicoll.
- أنابيب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود الفرامل.
- إزالة بعناية الأنابيب من جهاز الطرد المركزي وذلك لعدم تعكير صفو طبقات. وPBMCs مرئية في واجهة BSS / Ficoll.
- حصاد طبقة غائم من PBMCs في واجهة كل من أنابيب مع ماصة ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل.
- إضافة 20 مل من وسائل الإعلام كاملة.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 288 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف بواسطة الطموح.
- resuspend الكرية خلية في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التكميلية.
- إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام التجميد.
- نقل تعليق خلية إلى cryovial.
- وضع cryovial في وعاء cryofreezing مع الأيزوبروبانول.
- تخزين الحاوية تجميد في -80 درجة مئوية خلال الليل.
- آرansfer في PBMCs المجمدة قسامة إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
3. الفحص وظيفية
1. يوم 1
- وضع قسامة من النيتروجين السائل في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة أو حتى مطلق.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل مع ماصة معقمة.
- إضافة 15 مل من وسائل الإعلام كاملة وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف بواسطة الطموح.
- تعليق بلطف بيليه خلية في 1 مل من PHA سائل الإعلام.
- استكمال وحدة التخزين إلى 20 مل مع وسائل الإعلام نفسها.
- غطاء الأنبوب فضفاضة للسماح للهواء بالدخول.
- ترك الأنبوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 للسماح الخلايا الليمفاوية هادئة للتحول إلى الابيضاض اللمفاوي تنتشر بسرعة.
2. يوم 2
- اتخاذ أنبوب للخروج من الحاضنة، المسمار قبعات تماما وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائقفي درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف بواسطة الطموح.
- تعليق بلطف بيليه خلية في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة.
- استكمال وحدة التخزين إلى 20 مل مع وسائل الإعلام نفسها.
- غطاء الأنبوب فضفاضة للسماح للهواء بالدخول.
- ترك الأنبوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لتوسيع أعداد الخلايا.
3. يوم 3
- الحصول على أنبوب للخروج من الحاضنة، المسمار قبعات تماما وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف بواسطة الطموح.
- غسل الخلايا مرتين مع 10 مل من RPMI-1640 بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- resuspend بلطف بيليه خلية في 600 ميكرولتر من RPMI-1640.
- قياس تركيز الخلية وقدرتها على البقاء، وذلك باستخدام عداد الخلايا الآلي وقابلية محلل.
- إضافة حجم مناسب من RPMI-1640 للتكيف مع تركيز خلية من 1.5 × 10 5 cells/20 ميكرولتر. علاج الخلايا مع المؤتلف OPN (rOPN) أو مركبة (PBS) في 1.5 مل من أنابيب إيبندورف.
- نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى اثنين العقيمة 1.5 مل أنابيب إيبندورف.
- إضافة rOPN في أنبوب واحد لتركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل.
- إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني في أنبوب الثانية.
- مزيج بلطف كل شرط من قبل pipetting صعودا وهبوطا مرتين باستخدام مجموعة ماصة معقمة في 100 ميكرولتر.
- تحضير عينة صغيرة 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا.
- إضافة 5 ميكرولتر من RPMI-1640 إلى كل بئر.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 3 دقائق لإزالة أي فقاعات الهواء.
- البذور الخلايا غير المعالجة وكذلك الخلايا تعامل مع rOPN أو برنامج تلفزيوني.
- قبل نقل الخلايا من أنبوب إلى صفيحة ميكروسكوبية، ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة لضمان تعليق موحدة من الخلايا.
- إضافة 40 ميكرولتر من تعليق خلية لكل بئر في quadruplicate عن الخلايا غير المعالجة، في نسختين لrOPN أو برنامج تلفزيوني تعامل الخلايا. إعادةفر إلى الشكل 1 لتصميم. هذا التصميم يسمح 12 مريضا لفحصها على نفس صفيحة ميكروسكوبية.
- ترك لوحة الخلايا تحت غطاء محرك السيارة عقيمة لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا للراحة وتسوية بالتساوي على قاع البئر قبل وضع في الحاضنة.
- احتضان لوحة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لتحسين تأثير OPN.
4. اليوم 4
- تشغيل لوحة مع المركبات.
- تأخذ لوحة من الحاضنة ونترك الامر عند RT لحوالي 30 دقيقة.
- إعداد 1 مل من 100 ميكرومتر من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول في RPMI-1640 بإضافة 10 ميكرولتر من محلول المخزون (10 ملم) في 990 ميكرولتر من RPMI-1640.
- ملء لوحة مركب من قبل الاستغناء عن 20 ميكرولتر في الآبار المناسب كما هو مبين في الشكل 2.
- تغطية لوحة المركبة بختم قبل القطع pierceable لتجنب التغير في تركيز مركب بسبب التبخر قبلأو أثناء الحضانة في نظام قائم CDS-.
- لوحة تحميل الخلية، نصائح ماصة، والمركب إلى لوحة النظام القائم CDS-.
- اسم لوحة في البرنامج أداة تستند CDS-.
- حدد البروتوكول المناسب. يسمى بروتوكول تحريرها لتصنيف PBMCs مع 'خلايا ناهض غير ملتصقة عينة صغيرة لوحة RT 15 دقيقة. انتقل إلى مربع البروتوكول وحدد هذا البروتوكول في قائمة البروتوكولات
- بدء بروتوكول بالضغط على 'ابدأ'.
- نظام متكامل FLUIDICS يضيف في وقت واحد مركبات لجميع الآبار عن طريق حقن 5 ميكرولتر لكل بئر لتحقيق تركيز النهائي من 10 ميكرومتر في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر.
- نظام يستند CDS-تلقائيا بجمع البيانات لمدة 15 دقيقة بعد إضافة مركب.
- تحليل البيانات
- تحديد نطاقات المنخفضة والعالية من الترددات لاستخدامها عند حساب القيم المستخرجة للغيرالخلايا الملتصقة.
- حدد تصحيح الانحراف لتصحيح التغيير في القياسات الخطية مقاومة خط الأساس مع مرور الوقت.
- حدد تصفية البيانات لتقليل الاختلافات في قياس الاستجابة الحركية بسبب الضوضاء الإلكترونية وبالإضافة إلى ذلك المجمع.
- حدد أسلوب ماكس مين للمرة تحليل كامل.
- تصدير البيانات إلى Excel تحت خيار شكل لوحة.
- حساب دلتا G (ΔG) وذلك بطرح متوسط حجم استجابة لغي التحفيز (RmGi) من متوسط حجم استجابة لع التحفيز (RmGs) باستخدام الصيغة التالية:
ΔG = RmGi - RmGs - حساب النسبة المئوية لتأثير أضعاف (الحديد) من OPN على استجابة غي بوساطة بقسمة متوسط حجم الاستجابة لتحفيز غي بحضور OPN (RmGiOPN) مع متوسط حجم استجابة لGI التحفيز في وجود برنامج تلفزيوني ( RmGiPBS) باستخدام الصيغة التالية:
الحديد = 100 × (RmGiOPN / RmGiPBS) - الرجوع إلى T2 قادرة على تصنيف المرضى.
Representative Results
كان بقاء الخلية مقارنة بين جميع العينات مع القيم متسقة في حدود 86 و 96٪. في المقابل، لوحظت اختلافات في ارتفاع أعداد الخلايا بين العينات (الجدول 3). من 32 العينات المستخدمة، وكان اثنين من عدد كاف من الخلايا والتي لم يتم تصنيفها. وأظهرت مثال على نتائج التصنيف الوظيفي وفقا لدرجة من التوازن بين غي وع الإشارات في الشكل 3. وينقسم المحور العمودي من هذا الرقم إلى ثلاثة أقسام ترسيم المجموعات الوظيفية مع نطاقات دينامية على النحو المنصوص عليه> +10 لFG3، بين +10 و -10 لFG2، وأخيرا <-10 لFG1. بين 30 مريضا اختبار هنا، ان 14، 6، و 5 مرضى تصنف بشكل واضح في FG3، FG2، وFG1، على التوالي، في حين أن خمسة مرضى، وخاصة 345، 353، 370، 371، و 382، كانت في الشريط الحدودي النطاقات. ان تقييم تأثير OPN على الاستجابة لتحفيز غي كشفت أن OPN زيادة الاستجابة في السلطة الفلسطينيةالمرضى في 353 و 371. في المقابل، تم تخفيض استجابة بأكثر من 50٪ في المرضى 345 و 382 وبنسبة أقل من 50٪ في المرضى بعد العلاج rOPN 370. لذلك، وفقا لمعايير التصنيف لدينا (الجدول 2)، كنا قادرين على تصنيف المرضى 353 و 371 في FG1، والمرضى 345 و 382 في FG2، والمريض 370 في FG3. في موازاة ذلك، تم فحص جميع المرضى لاستجابتها لغي تحفيز البروتين ومقارنة بالمجموعة الضابطة. كما هو متوقع، كان جميع المرضى أقل استجابة من الضابطة، والمرضى تصنف في نفس المجموعة الفنية من خلال الإجراء الجديد لدينا أظهرت مستويات مماثلة من الحد الأقصى للاستجابة (الشكل 5). علاوة على ذلك، كان التفاوت بين المرضى من كل مجموعة وظيفية متسقة مع مجموعة الكلاسيكية لدينا تصنيف 12 والتأكد من صحتها الإجراء الجديد لدينا. وقد كشف تصنيف لفيف كبير من المرضى جنفي اتباعها بانتظام في عيادة خاصة لدينا في مستشفى سانت جوستين ان الثلاثةوزعت المجموعات الوظيفية بالمثل بين الحالات المعتدلة، في حين كان السائد بين FG2 الحالات الشديدة (الشكل 6)، وتحديد المرضى تصنيفها إلى هذه المجموعة وظيفية وأكثر عرضة للتطور شديد للمرض وتشير إلى أن هذا الاختبار تصنيف يمكن أن تكون مفيدة في الجنف مجهول السبب التكهن.
| الحل A | اللامائية مد الجلوكوز | 0.1٪ |
| و CaCl 2 2H 2 O | 0.05 ملي | |
| MgCl 2 | 0.98 ملي | |
| بوكل | 5.4 ملي | |
| تريس | 145 ملي | |
| الحل B | كلوريد الصوديوم | 140 ملي |
| محلول الملح المتوازن (BSS) | الحل A | 1 حجم |
| الحل B | 9 حجم | |
| RPMI-1640 | 500 مل | |
| مضاد فطري للمضادات الحيوية | 1٪ | |
| FBS | 10٪ | |
| وسائل الإعلام التكميلية | RPMI-1640 | 50 مل |
| مضاد فطري للمضادات الحيوية | 1٪ | |
| FBS | 40٪ | |
| وسائل الإعلام تجميد | RPMI-1640 | 50 مل |
| مضاد فطري للمضادات الحيوية | 1٪ | |
| FBS | 40٪ | |
| DMSO | 20٪ | |
| وسائل الإعلام PHA | RPMI-1640 | 500 مل |
| مضاد فطري للمضادات الحيوية | 1٪ | |
| FBS | 10٪ | |
| Phytohemaglutinin | 1٪ |
الجدول 1. الأساسيةحلول.
| نطاقات ديناميكية مع ΔG | المجموعات الوظيفية | نطاقات ديناميكية مع الحديد |
| ΔG <-10 | FG1 | الحديد> 100٪ |
| -10 <ΔG <+10 | FG2 | الحديد <50٪ |
| ΔG> +10 | FG3 | 50٪ <الحديد <95٪ |
الجدول 2. تصنيف المجموعات الوظيفية وفقا لنطاقات الديناميكية التي أقيمت مع ΔG والحديد.
| المرضى | الجدوى (٪) | تركيز خلية (10 × 6 / مل) | تعليقات |
| 343 | 88.7 | 11.64 | |
| 344 | 90.5 | 13.6 | |
| 345 | 94.4 | 8.54 | |
| 346 | 94.3 | 25.79 | |
| 347 | 94.2 | 27.36 | |
| 348 | 94.6 | 8.52 | |
| 349 | 91.2 | 0.82 | عدد كاف من الخلايا |
| 350 | 90.3 | 8.92 | |
| 352 | 92.6 | 8.28 | |
| 353 | 91.3 | 12.75 | |
| 354 | 86.9 | 7.62 | |
| 355 | 91.2 | 7.51 | |
| 356 | 90.3 | 9.36 | |
| 358 | 95.1 | 16.94 | |
| 359 | 92.3 | 13.89 | |
| 360 | 89.4 | 7.67 | |
| 361 | 93.5 | 7.84 | |
| 365 | 86.5 | 2.2 | عدد كاف من الخلايا |
| 368 | 92.6 | 15.69 | |
| 369 | 93.4 | 10.9 | |
| 370 | 92.5 | 19.93 | |
| 371 | 88.8 | 10.68 | |
| 374 | 93.9 | 16.86 | |
| 376 | 92.9 | 15.67 | |
| 377 | 93.1 | 9.99 | |
| 378 | 93.6 | 13.57 | |
| 379 </ الدفتيريا> | 92.6 | 19.86 | |
| 380 | 91.1 | 8.46 | |
| 381 | 93.9 | 14.82 | |
| 382 | 92.1 | 23.06 | |
| 383 | 92.9 | 11.82 | |
| 384 | 89.1 | 7.73 |
الجدول 3. الجدوى في المئة وتركيز خلية كما هو محدد باستخدام عداد الخلايا الآلي وقابلية محلل.
الشكل 1. تصميم لبذر الخلية.
الشكل 2.تصميم للاستغناء عن المركبات.
الرقم 3. مجموعة ديناميكية من التصنيف الوظيفي باستخدام نظام قائم CDS-. ويوضح الرسم البياني القيم لدرجة عدم التوازن بين الردود على غي والتحفيز ع الحصول عليها في PBMCs من المرضى الذين يعانون من الجنف مجهول السبب. تم قياس القيم من قبل النظام القائم CDS-ردا على 10 ميكرومتر من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول. كل نقطة تمثل ΔG كل الردود في مكررة.
الشكل 4. تأثير rOPN على الاستجابة لتحفيز غي في PBMCs. تم تجويع الخلايا المصل لمدة 18 ساعة في وجود أو عدم وجود 0.5 ميكروغرام / مل rOPN ثم حفز مع 10 56؛ M من السوماتوستاتين لبدء الاستجابة الخلوية غي بوساطة. وقد تم توليد البيانات في الرسم البياني من أقصى الحد الأدنى من مقاومة وتتوافق مع متوسط الاستجابة في مكررة.
الرقم 5. حالة وظيفية من البروتين غي في PBMCs من السيطرة والمواضيع scoliostic. تعرضت PBMCs من الضابطة ومرضى جنفي إلى زيادة تركيزات السوماتوستاتين لتحفيز البروتينات غي عبر مستقبلات السوماتوستاتين الذاتية. وقد تم قياس الاستجابة الخلوية من قبل النظام القائم CDS-كما هو موضح في القسم الداخلي. تم إنشاء منحنيات من أقصى الحد الأدنى من مقاومة. يمثل كل منحنى الانحدار غير الخطية. تم تطبيع البيانات إلى الاستجابة القصوى في الخلايا من الضابطة وكل نقطة يتوافق مع متوسط الاستجابة في مكررة./ 50768/50768fig5large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الرقم 6. توزيع المجموعات الوظيفية بين مراحل مختلفة من الجنف. A فوج كبير من المرضى جنفي مع 794 المعتدلة (الانحرافات بين 10-44 درجة) و162 الحالات الشديدة (انحناء أكبر من 45 درجة)، يليه بانتظام في مستشفى سانت جوستين، صنفت وفقا لدرجة من التوازن بين الاستجابة لغي وع التحفيز. تم قياس ردود النظام القائم CDS-ردا على 10 ميكرومتر من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول.
Discussion
وصفناها إجراء مفصل لاختبار خلية مقرها النذير لجنف مجهول السبب أن ينطبق على خلايا الدم المحيطية (PBMCs) معزولة طازجة أو مجمدة حفظها لمدة تصل إلى واحد في النيتروجين السائل. منذ استخدام PBMCs المعزولة حديثا مرهقة عند اختبار عدد كبير من الأفراد، وقدم الإجراء مع PBMCs المجمدة التي توفر بديلا أكثر عملية في إعداد سريرية. ومع ذلك، ووجهت مشاكل مع التثاقل الخلية على الذوبان عندما استخدمت في البداية PBMCs المجمدة، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى تقلب بين الفحص. لتعظيم فحص استنساخ، نوصي بتجنب دورة تجميد ذوبان الجليد وباستخدام عينة مجمدة مرة واحدة فقط. هذا الإجراء هو بسيط جدا، والسماح لكشف دقيق للخلل وظيفة البروتين غي في وقت قصير. باستخدام هذا الإجراء، والأطفال أعراض وجنفي يمكن تصنيفها بسهولة للتنبؤ أفضل النتائج السريرية من دون أي خطر على صحتهم. حويفر، عند تنفيذ التصنيف وفقا لدرجة الحد الأقصى ردا على التحفيز غي نسبة إلى الضابطة الصحية 12، يجب أن تتحقق متطلبات عدة لالضابطة. في الواقع، من أجل أن يكون لفيف مقارنة صحيحة، يجب أن تكون الضابطة العمر والجنس المتطابقة، لا يكون على أي نوع من الدواء، وتوفير المعلومات الخاصة، مثل الفرد / التاريخ الطبي العائلي الماضية. قد تشكل هذه المتطلبات عقبة هامة لتوظيف الضابطة. لذلك، من خلال دراسة أداء تصنيف درجة من عدم التوازن بين الاستجابة لغي وع البروتين التحفيز في نفس الفرد هو المثل الأعلى للقضاء على ضرورة استخدام الضابطة.
استخدام نظام يستند CDS-لأداء هذا الاختبار النذير مهم من حيث توفير وقت واحد غي والاستجابات الخلوية ع بوساطة في نفس الفحص. على الرغم من أن العديد من المرضى يمكن أن تصنف مع عدم وجود صباحاbiguity باستخدام مجموعة ديناميكية ثابتة لهذا الاختبار، وعدد قليل من المرضى سوف يحمل القيم على الشريط الحدودي من النطاقات، كما يتضح من نتائج هذا التقرير. لتميز هؤلاء الأفراد، أدخلنا تقييم تأثير OPN على الاستجابة لتحفيز غي من خلال إظهار أن OPN يؤدي الى التأثير المتفاوت على الاستجابة الخلوية غي بوساطة بين المجموعات الوظيفية الثلاث. في الواقع، وجدنا أن في وجود OPN، استجابة لزيادة التحفيز غي في FG1، في حين أنه يقلل في FG2 وFG3، إلى أعلى حد في FG2. على الرغم من التكلفة العالية لOPN، واستخدام هذا chemokine الضروري أن نميز الحالات الغامضة، وبالتالي تحسين دقة الفحص تصنيف لدينا. ومع ذلك، هذا الاختبار لديه عيب في أن هناك حاجة إلى الحد الأدنى من 1.5 × 10 5 خلايا لكل بئر لمراقبة استجابة الخلوية مع نظام يقوم CDS-تحت ظروف تجريبية لدينا. سوف عينات المرضى معينة ليس لديها عدد كاف منخلايا لفحصها. في هذه الحالة، من الضروري أن نذكر المرضى لجمع الدم إضافية، والتي يمكن أن تكون مثيرة للقلق للأسر ومحبطة لأفراد الطواقم الطبية والمختبرية. ومن المقرر الدراسات المستقبلية في مختبرنا لمعالجة هذه المسألة.
ومع ذلك، يعتمد البروتوكول الحالي على طرق بسيطة ومجربة لإعداد الخلايا بينما يتم اختبار الآلي باستخدام نظام التسمية خالية من التحقق من صحة 13 و 14 لرصد الاستجابات للخلايا. منصة الاختبار غير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع منصة الجينية المتاحة لتشخيص أمراض أخرى. أيضا، فإن تكلفة جميع المواد القابل للتصرف، بما في ذلك أنابيب جمع الدم، نصائح، القطب خاصة microplates، والمخروطية وأنابيب إيبندورف، ليست مكلفة جدا ويقدر بأقل من 3،000 دولار لإكمال اختبار ما يقرب من ألف مريض. على الرغم من هذا التقدير لا يشمل تكاليف اليد العاملة لإعداد العيناتوأداء الاختبار، لا يزال هذا الاختبار إلى حد كبير أكثر يسرا من الجيل المقبل من منصات التسلسل. الجدير بالذكر، ليس فقط مقارنة التكاليف لمنصات الوراثية، ولكن أكثر تتعلق مجال AIS على وجه التحديد، هي التكاليف المرتبطة إلى التصوير الإشعاعي. اليوم، يتم تشخيص أكثر من مليون طفل في الولايات المتحدة وحوالي 100،000 طفل في كندا مع الجنف مجهول السبب، والتكلفة الإجمالية للتشخيص ورصد الأطفال جنفي عن التعرض للأشعة السينية هي أكثر من 2.5 مليار دولار سنويا في أمريكا الشمالية. وبالتالي، من المتوقع أن تكون مناسبة للتفتيش الروتيني ومراقبة الأطفال الذين يعانون من الجنف مجهول السبب دون مخاطر صحية وبتكلفة أقل لدينا إجراء فحص خلية مقرها.
Disclosures
هذا العمل أدى إلى عقد العديد من براءات الاختراع من قبل مستشفى سانت جوستين جامعة وكثير غيرها لا تزال معلقة في عدة بلدان. البعد الرابع هو محور LLC المرخص له الحصري لمستشفى جامعة سانت جوستين.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة إيف لا Cotrel DE L'معهد فرنسا، باريس، فرنسا (للدكتور مورو)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (منح PP2-99466 للدكتور مورو) والرابعة من العمود الفقري البعد LLC ، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية (منحة أبحاث للدكتور مورو).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
| FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
| Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
| Somatostatin | Tocris | 1157 | |
| Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
| PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
| Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
| Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
| 50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
| Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
| Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
| Equipment | |||
| Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
| Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
| Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
| Water bath | VWR International | 89032-204 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
| Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
| Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |
References
- Kane, W. J. Prevalence: a call for a statement of terms. Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).
- Bunnell, W. P. Selective screening for scoliosis. Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).
- Asher, M. A., Burton, D. C. Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects. Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).
- Fong, D. Y., et al. A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening. Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).
- Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer? Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).
- Kim, H., et al. Scoliosis imaging: what radiologists should know. Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).
- Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program. Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).
- Nachemson, A. A long term follow-up study of non-treated scoliosis. Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).
- Enneking, W. F., Harrington, P. Pathological changes in scoliosis. J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).
- Miller, N. H. Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis. Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).
- Nash, C. L. Jr, Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis. J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).
- Akoume, M. Y., et al. Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy. Spine. 35 (13), 601-608 (2010).
- Verdonk, E., et al. Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors. Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).
- Peters, M. F., et al. Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs. J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).
- Peters, M. F., Scott, C. W. Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity. J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).
- Akoume, M. Y., et al. Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis. J. Clin. Invest. , Submitted (2013).
