Summary
Een gestructureerd protocol wordt gepresenteerd voor een cel-gebaseerde test als een functionele test om de prognose van idiopathische scoliose te voorspellen met behulp van cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS). De test kan worden uitgevoerd met vers of ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) en de procedure binnen 4 dagen.
Abstract
Dit protocol geeft de experimentele en analyseprocedure voor celgebaseerde assay ontwikkeld in ons laboratorium als een functionele test voor de prognose voor idiopathische scoliose bij asymptomatische en getroffen kinderen voorspellen. De test bestaat uit de evaluatie van de functionele status van Gi en Gs eiwitten in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) door cellulaire diëlektrische spectroscopie (CDS), met een geautomatiseerde CDS gebaseerde instrument, en de indeling van de kinderen in drie functionele groepen (FG1 , FG2, FG3) met betrekking tot het profiel van onbalans tussen de mate van respons op Gi en Gs eiwitten stimulatie. De classificatie wordt verder bevestigd door het differentieel effect van osteopontine (OPN) op reactie op Gi stimulatie tussen de groepen en de ernstige progressie van de ziekte wordt verwezen door FG2. Ongeveer wordt een volume van 10 ml bloed nodig PBMC extraheren door Ficoll-gradiënt en cellen worden vervolgens opgeslagen in vloeibare stikstof. Het voldoende aantal PBMCS verrichten van de bepaling wordt verkregen na twee dagen van celkweek. In wezen worden cellen eerst geïncubeerd met phytohemmaglutinin (PHA). Na 24 uur incubatie wordt het medium vervangen door een PHA kweekmedium gedurende 24 uur voorafgaand aan zaaien van cellen en OPN behandeling. Cellen worden vervolgens spectroscopisch gescreend op hun reacties op somatostatine en isoproterenol, die respectievelijk activeren Gi en Gs proteïnen via hun verwante receptoren. Zowel somatostatine en isoproterenol gelijktijdig geïnjecteerd met een geïntegreerde fluïdica systeem en de reacties van de cellen 'worden gecontroleerd gedurende 15 minuten. De test kan worden uitgevoerd met vers of bevroren PBMCs en de procedure wordt afgerond binnen 4 dagen.
Introduction
Idiopathische scoliose is een ruggengraat misvorming van onbekende oorzaak algemeen gedefinieerd als een laterale kromming groter dan 10 graden vergezeld van een wervel rotatie 1. De aandoening komt 4% van de pediatrische populatie en wordt meestal gediagnosticeerd in de leeftijd van 9 tot 13 jaar 2,3,4. De diagnose is in de eerste plaats van uitsluiting en wordt pas na het uitsluiten van andere oorzaken van vervorming van de wervelkolom, zoals vertebrale misvorming, neuromusculaire of syndromale aandoeningen. Traditioneel wordt de trunkal asymmetrie onthuld door Adams naar voren buigen testen en meten met Scoliometer tijdens lichamelijk onderzoek 5. De diagnose kan dan worden bevestigd door radiografische waarneming van de curve en de hoekmeting met Cobb methode 6.
Zodra de diagnose, de primaire zorg voor artsen in het beheer scoliotische kinderen is de vraag of de curve zal vorderen. Inderdaad, de karakteristieken hebben vaak onvoorspelbaar enis vaker waargenomen bij meisjes dan bij jongens 7. Indien onbehandeld, kan de curve drastisch vooruitgang, het creëren van belangrijke fysieke misvorming en zelfs hart-problemen. Deze manifestaties levensbedreigend worden indien de curve hoger is dan 70 ° 8,9. De huidige behandeling opties te voorkomen of te stoppen curve progressie onder schoren en chirurgie. In het algemeen, schrap wordt aanbevolen voor bochten tussen 25-40 °, terwijl chirurgie is gereserveerd voor bochten van meer dan 45 ° of niet reageren op schoren.
Ongeveer 10% van de kinderen met de diagnose idiopathische scoliose hebben karakteristieken hebben die voor corrigerende chirurgie 10. Momenteel is er geen bewezen methode of proef waarover deze categorie patiënten identificeren. Bijgevolg worden alle gediagnosticeerde kinderen onderworpen aan meerdere röntgenfoto's over meerdere jaren, meestal tot ze volwassen skelet bereiken. Geschat wordt dat de typische patiënten met scoliose zalongeveer 22 radiologische onderzoeken over een periode van 3 jaar 11. Vanwege het potentiële risico van meerdere radiografische onderzoeken, de alternatieve benaderingen waardoor het uitvoeren van de prognose van idiopathische scoliose zonder kinderen bloot te stellen aan ioniserende straling zijn sterk gewenst. Met de bedoeling om aan deze behoefte, hebben we eerder ontwikkelde een cel-gebaseerde screeningstest als een prognostische test om de asymptomatische kinderen sneller identificeren die risico lopen op het ontwikkelen van idiopathische scoliose. De test voorspelt klinische uitkomst zowel asymptomatische en getroffen kinderen door onderzoek van de functionele status van Gi eiwitten en classificeren kinderen in drie functionele groepen (FG1, FG2 en FG3) volgens de mate van de maximale respons op stimulatie Gi eiwitten 12 zoals gemeten door CDS -gebaseerd systeem. Dit systeem wordt voornamelijk gebruikt om signaaltransductie te beoordelen door middel van G-eiwitten in verschillende celtypes 13,14,15,16. Het levert informatie over detotale geïntegreerde respons van de cellen aan de externe stimuli door het meten van veranderingen in impedantie na de activering van celoppervlak receptoren. Cellen worden gezaaid in microtiterplaten die elektroden bevatten onder aan de putjes en het systeem past een kleine spanning die extracellulaire en transcellulaire duceren. Volgende verbinding injectie in de put worden celoppervlak receptoren gestimuleerd en signaaltransductie gebeurtenissen plaatsvinden, die tot cellulaire veranderingen die de stroom van extracellulaire en transcellulaire stromingen beïnvloeden en daardoor de gemeten grootte beïnvloeden. Met deze aanpak, de scoliotische patiënten en kinderen meer risico lopen op het ontwikkelen van scoliose zijn minder ontvankelijk voor Gi proteïne stimulatie in vergelijking met gezonde proefpersonen, en de indeling is gebaseerd op het percentage van de mate van reductie ten opzichte van controlegroep. De classificatie bereiken worden vastgesteld tussen 10 en 40% voor FG3, 40 en 60% voor FG 2, en 60 en 90% voor FG1 12.
17 voorzien. De precisie van deze classificatie-test is verder verbeterd door aan te tonen een differentiële effect van osteopontine (OPN) op reactie op Gi stimulatie tussen functionele groepen.
Hier leggen we de gedetailleerde stappen van experimentele en analytische procedures van deze functionele test zoals thans uitgevoerd in ons laboratorium.
Protocol
De gehele procedure wordt uitgevoerd onder steriele biologische kap uitgevoerd en alle oplossingen en apparatuur die in contact komen met cellen moeten steriel zijn.
1. Voorbereiding van Essential Solutions
- Bereid oplossingen volgens tabel 1.
- Houd gebalanceerde zoutoplossing (BSS) bij kamertemperatuur en alle andere oplossingen bij 4 ° C tot het tijdstip van gebruik.
- Warme koude media tot 37 ° C in het waterbad gedurende enkele minuten voor gebruik.
2. Bereiding en opslag van PBMCs
- Verzamel 10 ml bloed in EDTA-behandelde verzamelbuizen twee aliquots van PBMC bereiden in 5 ml elk aliquot.
- Overdracht 5 ml volledig bloed van de EDTA behandelde verzamelbuis een 50 ml buisje.
- Voeg een gelijk volume van BSS en meng monster door zachte pipetteren op en neer.
- Breng 3 ml Ficoll in twee 15 ml Falcon buizen.
- Layer zorgvuldig 4,5 mlvan verdunde bloed mengsel over de Ficoll in elke buis.
- Laat de buizen rusten tot 5 minuten een duidelijke scheiding van het bloed en Ficoll bevorderen.
- Centrifugeer de buizen bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem.
- Haal de buizen uit de centrifuge zodat de gelaagdheid niet verstoren. De PBMC zichtbaar zijn op de BSS / Ficoll-interface.
- Oogst de troebele laag van PBMC bij het grensvlak van beide buizen met een pipet overgebracht naar een nieuwe buis van 50 ml.
- Voeg 20 ml van complete media.
- Centrifugeer het buisje bij 288 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant door aspiratie.
- Resuspendeer de celpellet in 500 ui aanvullende media.
- Voeg een gelijk volume ijskoud medium.
- Breng de celsuspensie om een cryovial.
- Plaats de cryovial in een cryofreezing container met isopropanol.
- Bewaar de bevriezing container bij -80 ° C gedurende de nacht.
- Transfer de bevroren PBMC aliquot om vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
3. Functionele Assay
1. Dag 1
- Plaats hoeveelheid van vloeibare stikstof in een waterbad bij 37 ° C gedurende een minuut of tot ontdooid.
- Breng de celsuspensie in een 50 ml buis met een steriele pipet.
- Voeg 15 ml compleet medium en spin de cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder het supernatant door aspiratie.
- Voorzichtig schorsen celpellet in 1 ml PHA media.
- Vul het volume op 20 ml met dezelfde media.
- Doe het buisje dicht losjes om de lucht te laten voeren.
- Laat de buis gedurende de nacht bij 37 ° C in een CO2 incubator zodat zwakke lymfocyten om te zetten in snel prolifererende lymfoblasten.
2. Dag 2
- Neem de buis uit de incubator, schroef de doppen volledig en draai de cellen neer op 200 xg gedurende 5 minutenbij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant door aspiratie.
- Voorzichtig schorsen celpellet in 1 ml compleet medium.
- Vul het volume op 20 ml met dezelfde media.
- Doe het buisje dicht losjes om de lucht te laten voeren.
- Laat de buis gedurende de nacht bij 37 ° C in een CO2 incubator celaantallen breiden.
3. Dag 3
- Haal de buis uit de incubator, schroef de doppen volledig en draai de cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant door aspiratie.
- Was de cellen tweemaal met 10 ml RPMI-1640 door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Voorzichtig resuspendeer de celpellet in 600 ul RPMI-1640.
- Meet de cel concentratie en de levensvatbaarheid, met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter en levensvatbaarheid analyzer.
- Voeg geschikt volume RPMI-1640 aanpassen aan een celconcentratie van 1,5 x 10 5 cells/20 ul. Behandel cellen met recombinant OPN (rOPN) of drager (PBS) in 1,5 ml Eppendorf buisjes.
- Breng 100 pi celsuspensie twee steriele 1,5 ml Eppendorf buisjes.
- Voeg rOPN in een buis tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml.
- Voeg een gelijk volume PBS in de tweede buis.
- Meng elke conditie door en neer te pipetteren twee keer met een steriele pipet vastgesteld op 100 pl.
- Bereid de kleine steekproef 96-putsmicroplaat.
- Voeg 5 ul van RPMI-1640 in elk putje.
- Centrifugeer de plaat bij 200 xg gedurende 3 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Zaad de onbehandelde cellen als cellen behandeld met rOPN of PBS.
- Voor de overdracht van cellen uit buis microplaat, voorzichtig pipet op en neer eenmaal om een uniforme suspensie van cellen te verzekeren.
- Voeg 40 ul celsuspensie per putje in viervoud voor onbehandelde cellen in tweevoud rOPN of PBS behandelde cellen. Refer naar figuur 1 voor het ontwerp. Dit ontwerp staat 12 patiënten worden getest op dezelfde microplaat.
- Laat de cel plaat onder de steriele kap gedurende 5 minuten om cellen te rusten en op te lossen gelijkmatig aan de bodem van de put voordat u het in de incubator.
- Incubeer de plaat gedurende 18 uur bij 37 ° C in een CO2 incubator om het effect van OPN optimaliseren.
4. Dag 4
- Voer de plaat met verbindingen.
- Neem de plaat uit de incubator en laat het bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten.
- Bereid 1 ml 100 uM isoproterenol somatostatine en in RPMI-1640 door toevoeging van 10 pl voorraadoplossing (10 mM) in 990 pl RPMI-1640.
- Vul het samengestelde plaat door af 20 ul in geschikte putjes zoals aangegeven in figuur 2.
- Bedek de verbinding plaat met een voorgesneden doorboorbare afdichting om verandering in de concentratie van de verbinding te voorkomen door verdamping vóórof tijdens incubatie in de CDS-systeem.
- Load cell plaat, pipet tips, en samengestelde plaat in de CDS-gebaseerd systeem.
- Noem de plaat in de CDS-gebaseerde instrument software.
- Selecteer het juiste protocol. Het protocol bewerkt voor de indeling met PBMC's heet 'Agonist Niet-hechtende cellen kleine steekproef Plate RT 15 min'. Ga naar het vak protocol en selecteer dit protocol in de lijst van protocollen
- Start het protocol door te klikken op 'Start'.
- De geïntegreerde fluidica systeem voegt tegelijkertijd de verbindingen alle putjes door het injecteren 5 ul per putje tot een eindconcentratie van 10 uM in een totaal volume van 50 pl.
- De CDS-systeem verzamelt de gegevens automatisch gedurende 15 minuten na verbinding toevoeging.
- Data-analyse
- Selecteer lage en hoge reeksen van frequenties te gebruiken bij het berekenen onttrokken waarden voor de niethechtende cellen.
- Selecteer drift correctie op de lineaire verandering in basislijn impedantie metingen in de tijd te corrigeren.
- Selecteer gegevens filteren om variaties in de kinetische reactie omdat soms elektronische ruis en samengestelde toevoeging verminderen.
- Selecteer het Max-Min-methode voor de volledige analyse tijd.
- Gegevens exporteren naar Excel onder de optie plaat formaat.
- Bereken delta G (ΔG) door de gemiddelde omvang van de respons op stimulatie Gi (RmGi) van de gemiddelde grootte van de respons op stimulatie Gs (RMGS) met de volgende formule:
ΔG = RmGi - RMGS - Bereken het percentage van de vouw effect (Fe) van OPN op Gi-gemedieerde respons door de gemiddelde respons omvang delende aan Gi stimulatie in aanwezigheid van OPN (RmGiOPN) met de gemiddelde respons op stimulatie omvang gi in aanwezigheid van PBS ( RmGiPBS) met de volgende formule:
Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) - Zie Tstaat 2 aan patiënten te classificeren.
Representative Results
Levensvatbaarheid van de cellen was vergelijkbaar tussen alle monsters met constante waarden in het bereik van 86 en 96%. Daarentegen werden grote verschillen opgemerkt in het aantal cellen tussen monsters (Tabel 3). Van de 32 monsters gebruikt, twee hadden onvoldoende aantal cellen en die niet zijn ingedeeld. Een voorbeeld van de resultaten van de functionele indeling overeenkomstig de mate van onbalans tussen Gi en Gs signalering wordt getoond in figuur 3. De verticale as van deze figuur is verdeeld in drie secties de afbakening van de functionele groepen met dynamische bereiken opgericht als> 10 voor FG3, tussen +10 en -10 voor FG2, en tenslotte <-10 voor FG1. Bij 30 patiënten hier getest, 14, 6 en 5 patiënten duidelijk ingedeeld in FG3, FG2 en FG1, respectievelijk, terwijl vijf patiënten, met name 345, 353, 370, 371 en 382, waren borderline van bereiken. De evaluatie van de OPN effect op de respons op Gi stimulatie bleek dat OPN verhoogde de respons in patients 353 en 371. Daarentegen werd respons met meer dan 50% bij patiënten 345 en 382 en minder dan 50% bij 370 patiënten na rOPN behandeling. Dus, volgens onze indelingscriteria (tabel 2), waren we in staat om patiënten 353 en 371 categoriseren in FG1, patiënten 345 en 382 in FG2 en patiënt 370 in FG3. Tegelijkertijd werden alle patiënten gescreend op hun reactie op Gi proteïne stimulatie en vergeleken met controle personen. Zoals verwacht, waren alle patiënten minder responsief dan controlepersonen en patiënten in dezelfde functionele groep ondergebracht onze nieuwe procedure vertoonden vergelijkbare niveau van de maximale respons (Figuur 5). Bovendien, ongelijkheid tussen patiënten van elke functionele groep was in overeenstemming met onze klassieke aanbod van classificatie 12, onze nieuwe procedure te valideren. De indeling van een grote cohort van scoliotische patiënten regelmatig gevolgd in onze speciale kliniek in Sainte-Justine Ziekenhuis is gebleken dat de driefunctionele groepen waren gelijk verdeeld matige gevallen, terwijl de FG2 overheerste bij ernstige gevallen (figuur 6), het identificeren van patiënten ingedeeld in deze functionele groep meer risico op ernstige progressie van de ziekte en geeft aan dat dit classificatietestresultaten nuttig het kan prognose van idiopathische scoliose.
| Oplossing A | Watervrij D-glucose | 0.1% |
| CaCl2 2H 2 O | 0,05 mM | |
| MgCl2 | 0,98 mM | |
| KCl | 5,4 mM | |
| Tris | 145 mM | |
| Oplossing B | NaCl | 140 mM |
| Gebalanceerde zoutoplossing (BSS) | Oplossing A | 1 volume |
| Oplossing B | 9 volume | |
| RPMI-1640 | 500 ml | |
| Antibioticum-antimycoticum | 1% | |
| FBS | 10% | |
| Aanvullende media | RPMI-1640 | 50 ml |
| Antibioticum-antimycoticum | 1% | |
| FBS | 40% | |
| Invriezen media | RPMI-1640 | 50 ml |
| Antibioticum-antimycoticum | 1% | |
| FBS | 40% | |
| DMSO | 20% | |
| PHA media | RPMI-1640 | 500 ml |
| Antibioticum-antimycoticum | 1% | |
| FBS | 10% | |
| Phytohemaglutinin | 1% |
Tabel 1. Essentialoplossingen.
| Dynamische bereiken met ΔG | Functionele Groepen | Dynamische bereiken met Fe |
| ΔG <-10 | FG1 | Fe> 100% |
| -10 <ΔG <10 | FG2 | Fe <50% |
| ΔG> 10 | FG3 | 50% <Fe <95% |
Tabel 2. Categorisering van functionele groepen volgens dynamische bereiken gelegd met ΔG en Fe.
| Patiënten | Levensvatbaarheid (%) | Celconcentratie (x 10 6 / ml) | Reacties |
| 343 | 88.7 | 11.64 | |
| 344 | 90.5 | 13.6 | |
| 345 | 94.4 | 8.54 | |
| 346 | 94.3 | 25.79 | |
| 347 | 94.2 | 27.36 | |
| 348 | 94.6 | 8.52 | |
| 349 | 91.2 | 0,82 | Onvoldoende aantal cellen |
| 350 | 90.3 | 8,92 | |
| 352 | 92.6 | 8.28 | |
| 353 | 91.3 | 12.75 | |
| 354 | 86.9 | 7.62 | |
| 355 | 91.2 | 7.51 | |
| 356 | 90.3 | 9.36 | |
| 358 | 95.1 | 16.94 | |
| 359 | 92.3 | 13.89 | |
| 360 | 89.4 | 7.67 | |
| 361 | 93.5 | 7.84 | |
| 365 | 86.5 | 2.2 | Onvoldoende aantal cellen |
| 368 | 92.6 | 15.69 | |
| 369 | 93.4 | 10.9 | |
| 370 | 92.5 | 19.93 | |
| 371 | 88.8 | 10,68 | |
| 374 | 93.9 | 16.86 | |
| 376 | 92.9 | 15,67 | |
| 377 | 93.1 | 9.99 | |
| 378 | 93.6 | 13.57 | |
| 379 </ Td> | 92.6 | 19.86 | |
| 380 | 91.1 | 8.46 | |
| 381 | 93.9 | 14.82 | |
| 382 | 92.1 | 23.06 | |
| 383 | 92.9 | 11.82 | |
| 384 | 89.1 | 7.73 |
Tabel 3. Levensvatbaarheid procent en cel-concentratie zoals bepaald met behulp van een geautomatiseerde celgetalmeter en levensvatbaarheid analyzer.
Figuur 1. Ontwerp voor cel zaaien.
Figuur 2.Ontwerpen voor het afgeven van verbindingen.
Figuur 3. Dynamisch bereik van de functionele indeling in de CDS-gebaseerd systeem. Grafiek toont waarden van de mate van onbalans tussen reacties op Gi en Gs stimulatie verkregen PBMC van patiënten met idiopathische scoliose. De waarden werden gemeten door de CDS-systeem in reactie op 10 uM somatostatine en isoproterenol. Elk punt staat voor de ΔG van beide reacties in tweevoud.
Figuur 4. Effect van rOPN op respons op Gi stimulatie in PBMCs. Cellen werden serum-verhongerd gedurende 18 uur in aanwezigheid of afwezigheid van 0,5 ug / ml rOPN en vervolgens gestimuleerd met 10 56, M van somatostatine aan Gi-gemedieerde cellulaire respons initiëren. Gegevens in de grafiek werd gegenereerd uit maximum-en minimum impedantie overeen met het gemiddelde van de respons in tweevoud.
Figuur 5. Functionele status van Gi eiwitten in PBMC van controle en scoliostic onderwerpen. PBMC van controlepersonen en scoliotische patiënten werden blootgesteld aan toenemende concentraties van somatostatine aan Gi eiwitten via endogene somatostatine receptor te stimuleren. De cellulaire respons werd gemeten door CDS-systeem zoals beschreven onder procedure. Curves werden gegenereerd uit maximum-minimum impedantie. Elke kromme geeft de lineaire regressie. De gegevens werden genormaliseerd naar maximale respons in cellen van controlepersonen en elk punt komt overeen met het gemiddelde van de respons in tweevoud./ 50768/50768fig5large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Verdeling van de functionele groepen tussen verschillende fasen van scoliose. Een grote cohort van scoliotische patiënten met een matige 794 (krommingen tussen 10-44 °) en 162 ernstige (kromming groter dan 45 °) gevallen regelmatig gevolgd bij Sainte-Justine Ziekenhuis, werden ingedeeld naar de mate van onbalans tussen de respons op Gi en Gs stimulatie. De respons werd gemeten door de CDS-systeem in reactie op 10 uM somatostatine en isoproterenol.
Discussion
We hebben een gedetailleerde procedure van cel-gebaseerde prognostische test voor idiopathische scoliose die voor perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) vers geïsoleerde of geconserveerd maximaal een jaar in vloeibare stikstof ingevroren beschreven. Aangezien met vers geïsoleerde PBMC omslachtig bij het testen groot aantal individuen, werd de procedure gepresenteerd bevroren PBMC die een praktischer alternatief klinische omgeving te bieden. Echter, problemen met de cel klonteren bij het ontdooien werden ondervonden bij ingevroren PBMCs werden aanvankelijk gebruikt, leidt soms tot inter-assay variabiliteit. Om assay reproduceerbaarheid te maximaliseren, raden we vermijden vries-dooi cyclus en slechts een keer met de bevroren monster. De procedure is zeer eenvoudig, waardoor een nauwkeurige detectie van defecte Gi eiwitfunctie in een korte tijd. Met deze procedure kan asymptomatisch en scoliotische kinderen gemakkelijk worden ingedeeld naar hun klinische resultaten beter te voorspellen zonder gevaar voor hun gezondheid. However, bij het uitvoeren indeling overeenkomstig de mate van de maximale respons op stimulatie Gi vergelijking met de gezonde proefpersonen 12 verschillende vereisten voor de controlegroep worden voldaan. Inderdaad, om een goede vergelijking cohort hebben, de controlegroep moet leeftijd en geslacht gematched zijn, niet op enige vorm van medicatie, en geven prive-informatie, zoals in het verleden individuele / familiale medische geschiedenis. Deze eisen kunnen een belangrijk obstakel voor de werving van proefpersonen vormen. Daarom is het uitvoeren van de indeling door het onderzoeken van de mate van onbalans tussen de respons op Gi en Gs eiwit stimulatie in dezelfde persoon is ideaal om de noodzaak van het gebruik controlepersonen elimineren.
Het gebruik van de CDS-systeem deze prognostische test is belangrijk in termen van de gelijktijdige toevoer van Gi-en Gs-gemedieerde cellulaire responsen in dezelfde assay. Hoewel veel patiënten kunnen worden ingedeeld zonder ambiguity behulp van het dynamische bereik voor deze test vast, een klein aantal patiënten zal waarden vertonen op de grens van de reeksen, zoals blijkt uit de resultaten van dit verslag. Om deze individuen onderscheiden, hebben we de evaluatie van het effect van OPN geïntroduceerd respons op stimulatie door Gi tonen dat OPN induceert een differentieel effect op Gi-gemedieerde cellulaire respons onder de drie functionele groepen. Inderdaad vonden wij dat in aanwezigheid van OPN, respons op stimulatie Gi toename FG1, terwijl afneemt in FG2 en FG3, een hogere mate FG2. Ondanks de hoge kosten van OPN, het gebruik van deze chemokine essentieel dubbelzinnige gevallen onderscheiden, en derhalve de nauwkeurigheid van onze assay indeling. Echter, deze test is een nadeel dat minimaal 1,5 x 10 5 cellen per putje vereist is om cellulaire respons waarnemen met de CDS-systeem onder onze experimentele omstandigheden. Bepaalde monsters patiënt voldoende niette testen cellen. In dit geval moet de patiënt extra bloedafname, die zorgelijk voor gezinnen en frustrerend voor de medische en laboratoriumpersoneel roepen. Prospectieve studies zijn gepland in ons laboratorium om dit probleem aan te pakken.
Toch is de huidige protocol is gebaseerd op eenvoudige en beproefde methoden om cellen te bereiden terwijl de testen wordt geautomatiseerd met behulp van een gevalideerde label-free-systeem 13, 14 om de reacties van de cellen te controleren. Het testplatform is relatief goedkoop in vergelijking met genetische platform vindt de prognose voor andere ziekten. Ook de kosten van alle beschikbare materialen, zoals de bloedafname buizen, tips, de elektrodekabel microplaten en conisch Eppendorf buizen, is niet erg duur en wordt geschat op minder dan $ 3000 een test ongeveer duizend patiënten voltooien. Hoewel deze schatting niet arbeidskosten voor de voorbereiding van de monsters bevattenen het uitvoeren van de test, deze test blijft aanzienlijk goedkoper dan next-generation sequencing platforms. Opmerkelijk is niet alleen de kosten ten opzichte van genetische platforms, maar meer specifiek op het gebied van AIS, de kosten voor radiologische beeldvorming. Vandaag, meer dan een miljoen kinderen in de VS en ongeveer 100.000 kinderen in Canada zijn gediagnosticeerd met idiopathische scoliose, en de totale kosten van diagnose en monitoring van de scoliotische kinderen door blootstelling X-ray is jaarlijks meer dan 2,5 miljard dollar in Noord-Amerika. Zo zou onze cel-gebaseerde test procedure worden verwacht geschikt voor routinematige screening en monitoring van kinderen met idiopathische scoliose zonder risico voor de gezondheid en tegen lagere kosten te zijn.
Disclosures
Dit werk leidde tot verschillende patenten vast bij Sainte-Justine Universitair Ziekenhuis en vele anderen zijn in behandeling in verschillende landen. Vierde Dimensie Spine LLC is de exclusieve licentiehouder van Sainte-Justine Universitair Ziekenhuis.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Parijs, Frankrijk (Dr Moreau), de Canadese Institutes of Health Research (verlenen PP2-99466 Dr Moreau) en vanaf Vierde Dimensie Spine LLC , New York, USA (Research subsidie aan Dr Moreau).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
| FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
| Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
| Somatostatin | Tocris | 1157 | |
| Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
| PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
| Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
| Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
| 50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
| Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
| Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
| Equipment | |||
| Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
| Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
| Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
| Water bath | VWR International | 89032-204 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
| Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
| Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |
References
- Kane, W. J. Prevalence: a call for a statement of terms. Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).
- Bunnell, W. P. Selective screening for scoliosis. Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).
- Asher, M. A., Burton, D. C. Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects. Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).
- Fong, D. Y., et al. A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening. Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).
- Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer? Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).
- Kim, H., et al. Scoliosis imaging: what radiologists should know. Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).
- Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program. Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).
- Nachemson, A. A long term follow-up study of non-treated scoliosis. Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).
- Enneking, W. F., Harrington, P. Pathological changes in scoliosis. J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).
- Miller, N. H. Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis. Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).
- Nash, C. L. Jr, Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis. J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).
- Akoume, M. Y., et al. Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy. Spine. 35 (13), 601-608 (2010).
- Verdonk, E., et al. Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors. Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).
- Peters, M. F., et al. Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs. J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).
- Peters, M. F., Scott, C. W. Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity. J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).
- Akoume, M. Y., et al. Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis. J. Clin. Invest. , Submitted (2013).
