Summary
एक संरचित प्रोटोकॉल सेलुलर ढांकता हुआ स्पेक्ट्रोस्कोपी (सीडीएस) का उपयोग इडियोपैथिक स्कोलियोसिस के रोग का निदान भविष्यवाणी करने के लिए एक कार्यात्मक परीक्षण के रूप में एक सेल आधारित परख के लिए प्रस्तुत किया है. परख ताजा या फ्रोजन परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और प्रक्रिया 4 दिनों के भीतर पूरा हो गया है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल स्पर्शोन्मुख और प्रभावित बच्चों में अज्ञातहेतुक स्कोलियोसिस के रोग का निदान भविष्यवाणी करने के लिए एक कार्यात्मक परीक्षण के रूप में हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक सेल आधारित परख के लिए प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक प्रक्रिया का विवरण. परख तीन कार्य समूहों (FG1 में एक स्वचालित सीडीएस आधारित उपकरण है, और बच्चों के वर्गीकरण का उपयोग कर, सेलुलर ढांकता हुआ स्पेक्ट्रोस्कोपी (सीडीएस) द्वारा परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) में सैनिक और जी प्रोटीन के कार्यात्मक स्थिति के मूल्यांकन के होते हैं सैनिक और जी प्रोटीन उत्तेजना के जवाब की डिग्री के बीच असंतुलन की प्रोफाइल के लिए सम्मान के साथ, FG2, FG3). वर्गीकरण आगे समूहों और इस रोग के गंभीर प्रगति FG2 द्वारा संदर्भित है के बीच सैनिक उत्तेजना के जवाब पर osteopontin (OPN) के अंतर प्रभाव की पुष्टि होती है. लगभग, रक्त की 10 मिलीलीटर की एक मात्रा Ficoll ढाल और कोशिकाओं से PBMCs निकालने के लिए आवश्यक है तो तरल नाइट्रोजन में जमा हो जाती है. पी की पर्याप्त संख्याBMCs परख प्रदर्शन करने के लिए सेल संस्कृति के दो दिनों के बाद प्राप्त होता है. मूलतः, कोशिकाओं पहले phytohemmaglutinin (पीएचए) के साथ incubated हैं. 24 घंटा ऊष्मायन के बाद, मध्यम पूर्व सेल बोने और OPN उपचार के लिए एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए एक पीएचए मुक्त संस्कृति के माध्यम से बदला गया है. कोशिकाओं तो spectroscopically क्रमशः उनके आत्मीय रिसेप्टर्स के माध्यम से सैनिक और जी प्रोटीन सक्रिय जो सोमेटोस्टैटिन और isoproterenol को अपनी प्रतिक्रिया, के लिए जांच कर रहे हैं. सोमेटोस्टैटिन और isoproterenol दोनों एक साथ एक एकीकृत fluidics प्रणाली इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं और कोशिकाओं की प्रतिक्रिया 15 मिनट के लिए निगरानी कर रहे हैं. परख ताजा या फ्रोजन PBMCs के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और प्रक्रिया 4 दिनों के भीतर पूरा हो गया है.
Introduction
इडियोपैथिक स्कोलियोसिस आमतौर पर एक कशेरुकी रोटेशन 1 के साथ 10 डिग्री से अधिक एक पार्श्व वक्रता के रूप में परिभाषित अज्ञात कारण से एक रीढ़ की हड्डी में विकृति है. हालत बाल चिकित्सा जनसंख्या का 4% को प्रभावित करता है और सबसे अधिक 9-13 साल 2,3,4 की उम्र के बीच का निदान किया जाता है. निदान मुख्य रूप से बहिष्कार का है और केवल इस तरह के कशेरुकी कुरूपता, neuromuscular या सहलाक्षणिक विकार के रूप में रीढ़ की हड्डी में विकृति के अन्य कारणों से इनकार करने के बाद किया जाता है. परंपरागत रूप से, trunkal विषमता एडम्स आगे झुकने परीक्षण से पता चला है और शारीरिक परीक्षा 5 दौरान स्कोलियोमीटर से मापा जाता है. निदान तो रेडियोग्राफिक वक्र का अवलोकन और कोब विधि 6 का उपयोग कोण माप से इसकी पुष्टि की जा सकती है.
एक बार निदान, scoliotic बच्चों के प्रबंधन में चिकित्सकों के लिए प्राथमिक चिंता वक्र प्रगति करेगा कि क्या है. दरअसल, वक्र प्रगति अक्सर अप्रत्याशित है औरअधिक बार लड़कियों के बीच मनाया लड़कों 7 में से है. अगर इलाज, वक्र महत्वपूर्ण शारीरिक विकृति और यहां तक कि हृदय की समस्याओं का निर्माण, नाटकीय रूप से प्रगति कर सकते हैं. इन अभिव्यक्तियों वक्र 70 ° 8,9 से अधिक होने की धमकी दे जीवन हो गया है. वक्र प्रगति को रोकने या बंद करने के लिए वर्तमान उपचार के विकल्प ताल्लुक़ और सर्जरी शामिल हैं. सर्जरी घटता अधिक से अधिक से अधिक 45 डिग्री या ताल्लुक़ लिए अनुत्तरदायी के लिए आरक्षित है, जबकि सामान्य तौर पर, ताल्लुक़, 25-40 डिग्री के बीच घटता के लिए सिफारिश की है.
लगभग, इडियोपैथिक स्कोलियोसिस के साथ का निदान बच्चों के 10% सुधारात्मक सर्जरी 10 की आवश्यकता वक्र प्रगति है. वर्तमान में, कोई सिद्ध पद्धति या रोगियों के इस वर्ग की पहचान करने के लिए उपलब्ध परीक्षण है. नतीजतन, सभी निदान बच्चों वे कंकाल परिपक्वता तक पहुँचने आमतौर पर जब तक, कई वर्षों में कई रेडियोग्राफ के अधीन हैं. यह स्कोलियोसिस के साथ विशिष्ट रोगियों होगा अनुमान है किएक 3 साल की अवधि 11 से अधिक लगभग 22 रेडियोलॉजिकल परीक्षाओं. क्योंकि कई रेडियोग्राफिक परीक्षाओं के संभावित खतरे की, विकिरण के बच्चों को उजागर बिना इडियोपैथिक स्कोलियोसिस के रोग का निदान प्रदर्शन की अनुमति दे सकता है कि वैकल्पिक तरीकों दृढ़ता से वांछनीय हैं. इस जरूरत को पूरा करने के इरादे के साथ, हम पहले से जल्दी इडियोपैथिक स्कोलियोसिस विकसित होने का खतरा स्पर्शोन्मुख बच्चों की पहचान करने के लिए एक शकुन परीक्षण के रूप में एक सेल आधारित स्क्रीनिंग परख विकसित किया है. परीक्षण सैनिक प्रोटीन के कार्यात्मक स्थिति की जांच और सीडीएस द्वारा मापा के रूप में सैनिक प्रोटीन उत्तेजना से 12 अधिकतम प्रतिक्रिया की डिग्री के अनुसार तीन कार्य समूहों (FG1, FG2 और FG3) में बच्चों को वर्गीकृत द्वारा दोनों स्पर्शोन्मुख और प्रभावित बच्चों में नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी आधारित प्रणाली. इस प्रणाली के बड़े पैमाने पर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 13,14,15,16 में जी प्रोटीन के माध्यम से संकेत पारगमन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके बारे में जानकारी पैदावारकोशिका की सतह रिसेप्टर्स की सक्रियण निम्न प्रतिबाधा में बदलाव को मापने के द्वारा बाहरी उत्तेजनाओं को कोशिकाओं की कुल एकीकृत प्रतिक्रिया. कोशिकाओं कुओं के तल पर इलेक्ट्रोड होते हैं और प्रणाली बाह्य और transcellular धाराओं प्रेरित है कि एक छोटे से वोल्टेज लागू होता है microplates में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. कुएं में मिश्रित इंजेक्शन के बाद, कोशिका की सतह रिसेप्टर्स प्रेरित कर रहे हैं और संकेत पारगमन घटनाओं बाह्य और transcellular धाराओं के प्रवाह को प्रभावित है कि सेलुलर परिवर्तन के लिए अग्रणी होते हैं, और इस तरह मापा परिमाण प्रभावित करते हैं. इस दृष्टिकोण के साथ, स्कोलियोसिस विकसित होने का खतरा scoliotic मरीजों और बच्चों को अधिक स्वस्थ नियंत्रण विषयों के साथ तुलना में जब सैनिक प्रोटीन उत्तेजना कम करने के लिए उत्तरदायी हैं, और वर्गीकरण समूह को नियंत्रित करने के लिए कमी रिश्तेदार की डिग्री के प्रतिशत के आधार पर किया जाता है. वर्गीकरण पर्वतमाला FG3, 40 और FG2 के लिए 60%, और 60 और FG1 12 के लिए 90% के लिए 10 और 40% के बीच तय कर रहे हैं.
17 जरूरत के मुद्दे पर प्रगति के जोखिम पर अधिक कर रहे हैं कि सबूत प्रदान की है. इस वर्गीकरण परीक्षण की शुद्धता आगे कार्यात्मक समूहों के बीच सैनिक उत्तेजना के जवाब पर osteopontin (OPN) की एक अंतर प्रभाव का प्रदर्शन द्वारा सुधार किया गया है.
यहाँ हम वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन इस कार्यात्मक परीक्षण की प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं की विस्तृत चरण दस्तावेज़.
Protocol
इस पूरी प्रक्रिया में बाँझ जैविक हुड के तहत किए गए और सभी समाधान और उपकरण कोशिकाओं के संपर्क में आ रहा है बाँझ होना चाहिए.
1. ईथर के समाधान की तैयारी
- तालिका 1 के अनुसार समाधान तैयार करें.
- उपयोग के समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान और सभी अन्य समाधान पर संतुलित नमक समाधान (बीएसएस) रखें.
- उपयोग करने से पहले कुछ मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म, ठंडा मीडिया.
2. PBMCs की तैयारी और भंडारण
- प्रत्येक विभाज्य के लिए 5 मिलीलीटर का उपयोग PBMCs के दो aliquots तैयार करने के लिए EDTA इलाज संग्रह ट्यूबों में पूरे रक्त के 10 एमएल लीजिए.
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को EDTA इलाज संग्रह ट्यूब से स्थानांतरण पूरे रक्त के 5 मिलीलीटर.
- बीएसएस के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और ऊपर और नीचे कोमल pipetting द्वारा नमूना मिश्रण.
- दो 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में Ficoll के 3 मिलीलीटर रखें.
- ध्यान से 4.5 मिलीग्राम परतके प्रत्येक ट्यूब में Ficoll से अधिक रक्त मिश्रण पतला.
- ट्यूबों रक्त और Ficoll का एक स्पष्ट विभाजन के पक्ष में करने के लिए 5 मिनट के लिए आराम करते हैं.
- कोई ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 400 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
- Layering को परेशान नहीं करने के रूप में इतनी सावधानी अपकेंद्रित्र से ट्यूबों निकालें. PBMCs बीएसएस / Ficoll इंटरफेस में दिखाई दे रहे हैं.
- एक विंदुक के साथ दोनों ट्यूबों के इंटरफेस में PBMCs के बादल परत फसल और एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण.
- पूरा मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए 288 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- अनुपूरक मीडिया के 500 μl में सेल गोली Resuspend.
- ठंड मीडिया के एक बराबर मात्रा में जोड़ें.
- एक cryovial सेल निलंबन स्थानांतरण.
- Isopropanol साथ एक cryofreezing कंटेनर में cryovial रखें.
- -80 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर ठंड कंटेनर स्टोर.
- ट्रेडफिनansfer जमे हुए PBMCs लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए विभाज्य.
3. कार्यात्मक परख
1. दिन 1
- एक मिनट के लिए या defrosted तक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तरल नाइट्रोजन से विभाज्य रखें.
- एक बाँझ विंदुक के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
- पूरा मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन.
- आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- धीरे पीएचए मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित.
- एक ही मीडिया के साथ 20 मिलीलीटर मात्रा को पूरा करें.
- हवा में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए शिथिल ट्यूब टोपी.
- मौन लिम्फोसाइटों तेजी से proliferating lymphoblasts में परिणत करने के लिए अनुमति देने के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ट्यूब छोड़ दें.
2. दिन 2
- इनक्यूबेटर से बाहर ट्यूब ले लो, पूरी तरह से टोपी स्क्रू और 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिनकमरे के तापमान पर.
- आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- धीरे पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित.
- एक ही मीडिया के साथ 20 मिलीलीटर मात्रा को पूरा करें.
- हवा में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए शिथिल ट्यूब टोपी.
- सेल नंबर विस्तार करने के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ट्यूब छोड़ दें.
3. 3 दिन
- इनक्यूबेटर से बाहर ट्यूब करें, पूरी तरह से टोपी स्क्रू और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन.
- आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा RPMI 1640 के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं.
- धीरे RPMI 1640 के 600 μl में सेल गोली resuspend.
- एक स्वचालित सेल काउंटर और व्यवहार्यता विश्लेषक का उपयोग, सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता उपाय.
- 1.5 x 10 5 cells/20 μl की एक सेल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए RPMI 1640 की उचित मात्रा में जोड़ें. Eppendorf ट्यूबों के 1.5 मिलीलीटर में पुनः संयोजक OPN (rOPN) या वाहन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं का इलाज.
- दो बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों के लिए सेल निलंबन के 100 μl स्थानांतरण.
- 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक ट्यूब में rOPN जोड़ें.
- दूसरी ट्यूब में पीबीएस के एक बराबर मात्रा में जोड़ें.
- धीरे से ऊपर और नीचे pipetting दो बार 100 μl में एक बाँझ विंदुक सेट का उपयोग करके प्रत्येक हालत मिश्रण.
- छोटा सा नमूना 96 अच्छी तरह से microplate तैयार करें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से RPMI 1640 के 5 μl जोड़ें.
- किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 3 मिनट के लिए 200 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
- अनुपचारित कोशिकाओं के साथ ही rOPN या पीबीएस के साथ इलाज किया कोशिकाओं बीज.
- Microplate के लिए ट्यूब से कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले, धीरे से ऊपर विंदुक और नीचे एक बार कोशिकाओं की एक वर्दी निलंबन सुनिश्चित करने के लिए.
- ROPN या पीबीएस के लिए दो प्रतियों में, अनुपचारित कोशिकाओं के लिए चार प्रतियों में अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 40 μl जोड़ें कोशिकाओं का इलाज किया. फिर सेडिजाइन के लिए 1 चित्रा को फेर. इस डिजाइन 12 रोगियों को एक ही microplate पर परीक्षण की अनुमति देता है.
- कोशिकाओं इनक्यूबेटर में रखने से पहले आराम और अच्छी तरह से नीचे के लिए समान रूप से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए बाँझ हुड के तहत सेल थाली छोड़ दें.
- OPN के प्रभाव का अनुकूलन करने के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए थाली सेते हैं.
4. 4 दिन
- यौगिकों के साथ थाली चलाएँ.
- इनक्यूबेटर से बाहर थाली ले लो और लगभग 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें.
- RPMI 1640 के 990 μl में शेयर समाधान (10 मिमी) के 10 μl जोड़कर RPMI 1640 में सोमेटोस्टैटिन और isoproterenol से 100 माइक्रोन के 1 मिलीलीटर तैयार करें.
- चित्रा 2 में संकेत के रूप में उपयुक्त कुओं में 20 μl वितरण से मिश्रित थाली भरें.
- पहले वाष्पीकरण के कारण परिसर एकाग्रता में परिवर्तन से बचने के लिए एक precut pierceable मुहर के साथ मिश्रित प्लेट कवरया सीडीएस आधारित प्रणाली में ऊष्मायन के दौरान.
- लोड सेल प्लेट, पिपेट टिप्स, और सीडीएस आधारित प्रणाली में मिश्रित थाली.
- सीडीएस आधारित साधन सॉफ्टवेयर में थाली नाम.
- उचित प्रोटोकॉल का चयन करें. PBMCs साथ वर्गीकरण के लिए संपादित प्रोटोकॉल 'Agonist गैर पक्षपाती कोशिकाओं छोटा नमूना थाली आरटी 15 मिनट' कहा जाता है. प्रोटोकॉल बॉक्स में जाओ और प्रोटोकॉल की सूची में इस प्रोटोकॉल का चयन
- 'आरंभ' पर क्लिक करके प्रोटोकॉल आरंभ करें.
- एकीकृत fluidics प्रणाली एक साथ 50 μl की कुल मात्रा में 10 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 5 μl इंजेक्शन द्वारा सभी कुओं को यौगिकों कहते हैं.
- सीडीएस आधारित प्रणाली स्वतः मिश्रयोग के बाद 15 मिनट के लिए डेटा एकत्रित करता है.
- डेटा विश्लेषण
- गैर के लिए निकाले मूल्यों की गणना करते समय उपयोग करने के लिए आवृत्तियों के निम्न और उच्च श्रेणियों का चयनपक्षपाती कोशिकाओं.
- समय के साथ आधारभूत प्रतिबाधा माप में रैखिक परिवर्तन को सही करने के बहाव सुधार का चयन करें.
- कारण इलेक्ट्रॉनिक शोर और यौगिक इसके लिए गतिज प्रतिक्रिया माप में बदलाव को कम करने के लिए डेटा को छानने का चयन करें.
- पूरा विश्लेषण समय के लिए मैक्स मिन पद्धति का चयन करें.
- थाली प्रारूप विकल्प के तहत Excel में निर्यात डेटा.
- निम्न सूत्र का उपयोग जी उत्तेजना (RmGs) के जवाब परिमाण की औसत से सैनिक उत्तेजना (RmGi) के जवाब परिमाण का औसत घटाकर डेल्टा जी (ΔG) की गणना:
ΔG = RmGi - RmGs - (पीबीएस की उपस्थिति में उत्तेजना सैनिक के जवाब परिमाण के औसत के साथ OPN (RmGiOPN) की उपस्थिति में सैनिक उत्तेजना के जवाब परिमाण का औसत विभाजित करके सैनिक की मध्यस्थता प्रतिक्रिया पर OPN के गुना प्रभाव (Fe) के प्रतिशत की गणना RmGiPBS) निम्न सूत्र का उपयोग:
फे = 100 एक्स (RmGiOPN / RmGiPBS) - टी करने के लिए देखेंरोगियों को वर्गीकृत करने के लिए 2 में सक्षम.
Representative Results
सेल व्यवहार्यता 86 और 96% की सीमा में संगत मानों के साथ सभी नमूनों के बीच तुलना किया गया था. इसके विपरीत, उच्च विविधताओं के नमूने (3 टेबल) के बीच सेल संख्या में नोट कर रहे थे. इस्तेमाल किया 32 नमूनों में से दो कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या में थे और वर्गीकृत नहीं किया गया है. सैनिक और जी एस संकेतन के बीच असंतुलन की डिग्री के अनुसार कार्यात्मक वर्गीकरण के परिणामों का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. इस आंकड़े के ऊर्ध्वाधर अक्ष FG2 के लिए 10 और -10 के बीच, FG3 के लिए> 10 के रूप में स्थापित गतिशील पर्वतमाला के साथ कार्य समूहों delineating तीन वर्गों में बांटा गया है, और अंत में <-10 FG1 के लिए है. यहाँ परीक्षण 30 रोगियों के अलावा, 14, 6, और 5 रोगियों स्पष्ट रूप से FG2, FG3 में वर्गीकृत किया गया है, और क्रमशः FG1, पांच रोगियों, विशेष रूप से 345, 353, 370, 371, और 382, श्रेणियों की सीमा रेखा पर थे. सैनिक उत्तेजना के जवाब पर OPN प्रभाव का मूल्यांकन OPN देहात में प्रतिक्रिया में वृद्धि हुई कि पता चला था353 और 371 tients. इसके विपरीत, प्रतिक्रिया रोगियों 345 और 382 में 50% से अधिक द्वारा और rOPN इलाज के बाद मरीज को 370 में कम से कम 50% की कमी थी. इसलिए, हमारे वर्गीकरण मापदंड (तालिका 2) के अनुसार, हम FG1 में रोगियों 353 और 371 को वर्गीकृत करने में सक्षम थे, रोगियों 345 और FG2 में 382, और FG3 में रोगी 370. समानांतर में, सभी रोगियों सैनिक प्रोटीन उत्तेजना को अपनी प्रतिक्रिया के लिए जांच और विषयों को नियंत्रित करने की तुलना में थे. जैसी कि उम्मीद थी, सभी रोगियों नियंत्रण विषयों की तुलना में कम संवेदनशील थे, और हमारी नई प्रक्रिया द्वारा एक ही कार्यात्मक समूह में वर्गीकृत रोगियों अधिकतम प्रतिक्रिया (चित्रा 5) के समान स्तर का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, प्रत्येक कार्य समूह के रोगियों के बीच असमानता हमारी नई प्रक्रिया मान्य वर्गीकरण 12 के बारे में हमारी शास्त्रीय सीमा के अनुरूप था. नियमित रूप से सैंटे जस्टिन अस्पताल में हमारे विशेष क्लिनिक में पीछा scoliotic रोगियों की एक बड़ी पलटन के वर्गीकरण से पता चला है कि तीनFG2 रोग के गंभीर प्रगति के लिए जोखिम में अधिक के रूप में इस कार्यात्मक समूह में वर्गीकृत रोगियों की पहचान करने और इस वर्गीकरण परीक्षण में उपयोगी हो सकता है यह दर्शाता है कि गंभीर मामलों में (चित्रा 6) प्रमुख था, जबकि कार्य समूहों इसी प्रकार, उदारवादी मामलों के बीच वितरित किए गए इडियोपैथिक स्कोलियोसिस के रोग का निदान.
| समाधान एक | निर्जल डी ग्लूकोज | 0.1% |
| 2 CaCl 2H 2 हे | 0.05 मिमी | |
| 2 MgCl | 0.98 मिमी | |
| KCl | 5.4 मिमी | |
| Tris | 145 मिमी | |
| समाधान बी | NaCl | 140 मिमी |
| बैलेंस्ड नमक समाधान (बीएसएस) | समाधान एक | 1 मात्रा |
| समाधान बी | 9 मात्रा | |
| RPMI 1640 | 500 मिलीलीटर | |
| एंटीबायोटिक antimycotic | 1% | |
| FBS | 10% | |
| पूरक मीडिया | RPMI 1640 | 50 मिलीलीटर |
| एंटीबायोटिक antimycotic | 1% | |
| FBS | 40% | |
| ठंड मीडिया | RPMI 1640 | 50 मिलीलीटर |
| एंटीबायोटिक antimycotic | 1% | |
| FBS | 40% | |
| DMSO | 20% | |
| पीएचए मीडिया | RPMI 1640 | 500 मिलीलीटर |
| एंटीबायोटिक antimycotic | 1% | |
| FBS | 10% | |
| Phytohemaglutinin | 1% |
तालिका 1. आवश्यकसमाधान.
| ΔG साथ गतिशील पर्वतमाला | कार्य समूहों | फ़े के साथ गतिशील पर्वतमाला |
| ΔG <-10 | FG1 | फे> 100% |
| -10 <ΔG <+10 | FG2 | फ़े <50% |
| ΔG> 10 | FG3 | 50% <फ़े <95% |
ΔG और फ़े के साथ स्थापित गतिशील पर्वतमाला के अनुसार कार्य समूहों की तालिका 2. वर्गीकरण.
| मरीजों को | व्यवहार्यता (%) | सेल एकाग्रता (× 10 6 / एमएल) | टिप्पणियां |
| 343 | 88.7 | 11.64 | |
| 344 | 90.5 | 13.6 | |
| 345 | 94.4 | 8.54 | |
| 346 | 94.3 | 25.79 | |
| 347 | 94.2 | 27.36 | |
| 348 | 94.6 | 8.52 | |
| 349 | 91.2 | 0.82 | कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या |
| 350 | 90.3 | 8.92 | |
| 352 | 92.6 | 8.28 | |
| 353 | 91.3 | 12.75 | |
| 354 | 86.9 | 7.62 | |
| 355 | 91.2 | 7.51 | |
| 356 | 90.3 | 9.36 | |
| 358 | 95.1 | 16.94 | |
| 359 | 92.3 | 13.89 | |
| 360 | 89.4 | 7.67 | |
| 361 | 93.5 | 7.84 | |
| 365 | 86.5 | 2.2 | कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या |
| 368 | 92.6 | 15.69 | |
| 369 | 93.4 | 10.9 | |
| 370 | 92.5 | 19.93 | |
| 371 | 88.8 | 10.68 | |
| 374 | 93.9 | 16.86 | |
| 376 | 92.9 | 15.67 | |
| 377 | 93.1 | 9.99 | |
| 378 | 93.6 | 13.57 | |
| 379 </ P> | 92.6 | 19.86 | |
| 380 | 91.1 | 8.46 | |
| 381 | 93.9 | 14.82 | |
| 382 | 92.1 | 23.06 | |
| 383 | 92.9 | 11.82 | |
| 384 | 89.1 | 7.73 |
तालिका 3. एक स्वचालित सेल काउंटर और व्यवहार्यता विश्लेषक का उपयोग करके निर्धारित प्रतिशत के रूप में व्यवहार्यता और सेल एकाग्रता.
सेल बोने के लिए चित्रा 1. डिजाइन.
चित्रा 2.यौगिकों के वितरण के लिए डिजाइन.
चित्रा 3. सीडीएस आधारित प्रणाली का उपयोग कर कार्यात्मक वर्गीकरण के गतिशील रेंज. ग्राफ़ सैनिक और अज्ञातहेतुक स्कोलियोसिस के साथ रोगियों से PBMCs में प्राप्त जी उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं के बीच असंतुलन की डिग्री के मूल्यों को दिखाता है. मान सोमेटोस्टैटिन और isoproterenol से 10 माइक्रोन के जवाब में सीडीएस आधारित प्रणाली द्वारा मापा गया. प्रत्येक बिंदु दो प्रतियों में दोनों प्रतिक्रियाओं के ΔG का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 4. PBMCs में सैनिक उत्तेजना के जवाब पर rOPN का प्रभाव. कोशिकाओं उपस्थिति या 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल rOPN के अभाव में 18 घंटे के लिए सीरम की कमी से जूझ और फिर 10 से प्रेरित थे 56; सोमेटोस्टैटिन के एम सैनिक की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए. ग्राफ में डाटा अधिकतम न्यूनतम प्रतिबाधा से उत्पन्न होता है और दो प्रतियों में प्रतिक्रिया के औसत के अनुरूप थे.
चित्रा 5. नियंत्रण और scoliostic विषयों से PBMCs में सैनिक प्रोटीन के कार्यात्मक स्थिति. नियंत्रण विषयों और scoliotic रोगियों से PBMCs अंतर्जात सोमेटोस्टैटिन रिसेप्टर के माध्यम से सैनिक प्रोटीन को प्रोत्साहित करने के लिए सोमेटोस्टैटिन की सांद्रता में वृद्धि से अवगत कराया गया. प्रक्रिया खंड में वर्णित के रूप में सेलुलर प्रतिक्रिया सीडीएस आधारित प्रणाली द्वारा मापा गया था. घटता अधिकतम न्यूनतम प्रतिबाधा से उत्पन्न किया गया. प्रत्येक वक्र nonlinear प्रतिगमन का प्रतिनिधित्व करता है. डेटा नियंत्रण विषयों से कोशिकाओं में अधिक से अधिक प्रतिक्रिया के लिए सामान्यीकृत और प्रत्येक बिंदु दो प्रतियों में प्रतिक्रिया के औसत से मेल खाती गया./ 50768/50768fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
स्कोलियोसिस के विभिन्न चरणों के बीच कार्य समूहों की चित्रा 6. वितरण. नियमित रूप से सैंटे जस्टिन अस्पताल में पीछा 794 मध्यम (10-44 डिग्री के बीच curvatures) और 162 (अधिक से अधिक 45 डिग्री वक्रता) गंभीर मामलों के साथ scoliotic रोगियों की एक बड़ी काउहोट, सैनिक और जी एस के जवाब के बीच असंतुलन के अपने डिग्री के अनुसार वर्गीकृत किया गया उत्तेजना. प्रतिक्रियाएँ सोमेटोस्टैटिन और isoproterenol से 10 माइक्रोन के जवाब में सीडीएस आधारित प्रणाली द्वारा मापा गया.
Discussion
हम हौसले से अलग या तरल नाइट्रोजन में करने के लिए एक वर्ष के लिए जमे हुए संरक्षित परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं के लिए लागू है कि अज्ञातहेतुक स्कोलियोसिस के लिए एक सेल आधारित शकुन परीक्षण (PBMCs) की एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन किया है. व्यक्तियों की बड़ी संख्या का परीक्षण जब हौसले से अलग PBMCs का उपयोग कर बोझिल है, प्रक्रिया नैदानिक सेटिंग में एक अधिक व्यावहारिक विकल्प प्रदान करते हैं कि जमे हुए PBMCs के साथ प्रस्तुत किया गया था. जमे हुए PBMCs शुरू में अंतर - परख परिवर्तनशीलता के लिए कभी कभी अग्रणी इस्तेमाल किया गया, लेकिन, जब विगलन पर सेल clumping के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ा था. परख reproducibility बढ़ाने के लिए, हम फ्रीज पिघलना चक्र से बचने और केवल एक बार जम नमूना का उपयोग करना चाहिये. प्रक्रिया कम समय में दोषपूर्ण सैनिक प्रोटीन समारोह का सटीक पता लगाने के लिए अनुमति देता है, बहुत सरल है. इस प्रक्रिया का उपयोग, स्पर्शोन्मुख और scoliotic बच्चों को आसानी से बेहतर उनके स्वास्थ्य के लिए किसी भी खतरे के बिना उनके नैदानिक परिणाम की भविष्यवाणी करने में वर्गीकृत किया जा सकता है. होस्वस्थ नियंत्रण विषयों से 12 सैनिक उत्तेजना रिश्तेदार को अधिकतम प्रतिक्रिया की डिग्री के अनुसार वर्गीकरण जब प्रदर्शन wever, नियंत्रण विषयों के लिए कई जरूरतें पूरी नहीं की जानी चाहिए. दरअसल, एक उचित तुलना पलटन के क्रम में, नियंत्रण विषयों दवा के किसी भी प्रकार पर हो सकता है, और इस तरह के अतीत व्यक्ति / पारिवारिक चिकित्सा के इतिहास के रूप में निजी जानकारी प्रदान नहीं, उम्र और मिलान लिंग होना चाहिए. इन जरूरतों को नियंत्रण विषयों की भर्ती के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा गठन कर सकते हैं. इसलिए, एक ही व्यक्ति में सैनिक और जी प्रोटीन उत्तेजना के जवाब के बीच असंतुलन की डिग्री का परीक्षण करके वर्गीकरण प्रदर्शन नियंत्रण विषयों का उपयोग करने की आवश्यकता को खत्म करने के लिए आदर्श है.
इस शकुन परीक्षण करने के लिए सीडीएस आधारित प्रणाली का उपयोग एक साथ एक ही परख में सैनिक और जी एस की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रियाओं उपलब्ध कराने के मामले में महत्वपूर्ण है. कई रोगियों को कोई AM साथ वर्गीकृत किया जा सकता हैवर्तमान रिपोर्ट के परिणामों से यह साफ रूप biguity इस परख के लिए तय गतिशील रेंज का उपयोग कर, रोगियों की एक छोटी संख्या, श्रेणियों की सीमा रेखा पर मानों प्रदर्शन करेंगे. इन व्यक्तियों भेदभाव करने के लिए, हम OPN तीन कार्यात्मक समूहों के बीच सैनिक की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिक्रिया पर एक अंतर प्रभाव लाती है कि प्रदर्शन द्वारा सैनिक उत्तेजना के जवाब पर OPN के प्रभाव का मूल्यांकन शुरू की है. दरअसल, हम OPN, FG1 में सैनिक उत्तेजना बढ़ जाती है, के जवाब की उपस्थिति में यह FG2 में एक उच्च सीमा तक, FG2 और FG3 में कम हो जाती है, जबकि पाया. OPN की उच्च लागत के बावजूद, इस केमोकाइन का उपयोग अस्पष्ट मामलों भेद, और इसलिए हमारे वर्गीकरण परख की सटीकता में सुधार के लिए आवश्यक है. हालांकि, इस परख अच्छी तरह से प्रति 1.5 x 10 5 कोशिकाओं की एक न्यूनतम हमारे प्रयोगात्मक परिस्थितियों में सीडीएस आधारित प्रणाली के साथ सेलुलर प्रतिक्रिया निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है कि में एक नुकसान है. कुछ रोगी के नमूने लिए पर्याप्त संख्या में नहीं होगापरीक्षण किया जा कोशिकाओं. इस मामले में, यह चिकित्सा और प्रयोगशाला के कर्मचारियों के लिए परिवारों के लिए चिंता की बात है और निराशा हो सकती है जो अतिरिक्त रक्त संग्रह के लिए रोगियों को याद करने के लिए आवश्यक है. भावी अध्ययनों से इस मुद्दे के समाधान के लिए हमारी प्रयोगशाला में की योजना बनाई है.
फिर भी, मौजूदा प्रोटोकॉल परीक्षण कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए एक मान्य लेबल से मुक्त प्रणाली 13, 14 का उपयोग कर स्वचालित है, जबकि कोशिकाओं को तैयार करने के लिए सरल और सिद्ध तरीकों पर निर्भर करता है. अन्य रोगों के निदान के लिए उपलब्ध आनुवंशिक मंच की तुलना में परीक्षण मंच अपेक्षाकृत सस्ती है. इसके अलावा, रक्त संग्रह ट्यूबों, टिप्स, विशेष इलेक्ट्रोड microplates, और शंक्वाकार और Eppendorf ट्यूब सहित सभी डिस्पोजेबल सामग्री की लागत, बहुत महंगा नहीं है और लगभग एक हजार रोगियों के लिए एक परीक्षण पूरा करने के लिए कम से कम 3,000 डॉलर होने का अनुमान है. इस अनुमान के नमूने की तैयारी के लिए श्रम लागत शामिल नहीं है हालांकिऔर परीक्षण प्रदर्शन, यह परीक्षण काफी अधिक सस्ती अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्मों से बनी हुई है. उल्लेखनीय है, आनुवंशिक प्लेटफार्मों पर लागत तुलना ही नहीं है, लेकिन और अधिक विशेष एआईएस के क्षेत्र से संबंधित, रेडियोलॉजिकल इमेजिंग के लिए जुड़े लागत है. आज, संयुक्त राज्य अमेरिका में एक लाख से अधिक बच्चों और कनाडा में लगभग 100,000 बच्चों इडियोपैथिक स्कोलियोसिस के साथ का निदान, और एक्स - रे जोखिम के निदान और scoliotic बच्चों की निगरानी की कुल लागत उत्तरी अमेरिका में सालाना 2.5 अरब डॉलर से अधिक है. इस प्रकार, हमारे सेल आधारित परख प्रक्रिया नियमित जांच और स्वास्थ्य जोखिम के बिना और कम कीमत पर इडियोपैथिक स्कोलियोसिस के साथ बच्चों की निगरानी के लिए उपयुक्त होने की उम्मीद होगी.
Disclosures
कई पेटेंट के लिए नेतृत्व यह काम कई देशों में लंबित हैं सैंटे जस्टिन विश्वविद्यालय अस्पताल और कई अन्य लोगों ने पकड़. चौथा परिमाण रीढ़ LLC सैंटे जस्टिन विश्वविद्यालय अस्पताल के अनन्य लाइसेंसधारी है.
Acknowledgments
यह काम (डॉ. मोर्यू के लिए) ला Fondation यवेस Cotrel डी ल Institut डी फ्रांस, पेरिस, फ्रांस से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (डॉ. मोर्यू को PP2-99466 अनुदान) और चौथा आयाम रीढ़ LLC से , न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमेरिका (डॉ. मोर्यू के लिए अनुसंधान अनुदान).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
| FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
| Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
| Somatostatin | Tocris | 1157 | |
| Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
| PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
| Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
| Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
| 50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
| Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
| Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
| Equipment | |||
| Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
| Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
| Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
| Water bath | VWR International | 89032-204 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
| Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
| Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |
References
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