Summary
구조화 된 프로토콜은 셀룰러 유전체 분광법 (CDS)를 사용 특발성 측만증의 예후를 예측하는 기능 테스트와 같은 세포 기반 분석을 위해 제시된다. 분석은 신선하거나 냉동 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)로 수행 될 수 있고 절차는 4 일 안에 완료된다.
Abstract
이 프로토콜은 증상과 영향을받는 어린이 특발성 척추 측만증의 예후를 예측할 수있는 기능 테스트로 우리의 실험실에서 개발 된 세포 기반 분석을위한 실험 및 분석 절차에 대해 자세히 설명합니다. 분석은 삼 관능기 (FG1에 자동 CDS 기반 기기, 어린이의 분류를 사용하여, 세포의 유전 분광법 (CDS)에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 GI와 Gs의 단백질의 기능 상태의 평가 이루어져 GI와 천불 단백질의 자극에 대한 반응의 정도 사이의 불균형의 프로파일에 대하여, FG2, FG3). 분류는 더 그룹과 질병의 심각한 진행을 FG2에 의해 참조되는 가운데 위장관 자극에 대한 응답에 오스테 오 폰틴 (OPN)의 차동 효과에 의해 확인된다. 약, 혈액 10 ㎖의 볼륨이 피콜 - 그라데이션과 세포에 의해 PBMC를 추출하는 데 필요한 그 후 액체 질소에 저장됩니다. P의 적절한 수의골수 세포 분석을 수행 할 수는 세포 배양 두 일 후에 얻을 수있다. 기본적으로, 세포는 처음 phytohemmaglutinin (PHA)와 함께 배양된다. 24 시간 배양 후, 매체는 이전의 세포 파종 및 OPN의 치료에 추가로 24 시간 동안 PHA없는 배지로 대체됩니다. 세포는 다음 광학적으로 각각 자신의 동족 수용체를 통해 GI와 Gs의 단백질을 활성화 소마토스타틴 (somatostatin)과 이소에 대한 답변, 상영된다. 소마토스타틴 및 이소 프로 테레 놀은 모두 동시에 집적 유체 시스템으로 주입되고 세포의 반응은 15 분 동안 모니터링된다. 분석은 신선하거나 동결 된 PBMC를 사용하여 수행 될 수 있고 절차는 4 일 안에 완료된다.
Introduction
특발성 척추 측만증은 일반적으로 척추 회전 1과 함께 10도보다 큰 측면 곡률로 정의 원인을 알 수없는 척추 기형이다. 조건은 소아 인구의 4 %에 영향을 미치는 가장 일반적으로 9~13년 2,3,4 세 사이에 진단됩니다. 진단은 주로 배제되며 해당 척추 기형, 신경 근육 또는 syndromic 질환으로 척추 기형의 다른 원인을 배제 이후됩니다. 전통적으로, trunkal 비대칭 아담스 앞으로 굽힘 시험에 의해 밝혀 및 신체 검사 5시 된 scoliometer으로 측정된다. 진단은 방사선 투과 곡선의 관찰 및 콥 방법 6을 사용 각도 측정에 의해 확인 될 수있다.
일단 진단, 측만 아이들을 관리하는 의사에 대한 주요 관심사는 커브가 진행할지 여부입니다. 사실, 곡선의 진행은 종종 예측 불가능하고더 자주 여자 사이에서 관찰 소년 7보다. 치료되지 않는 경우, 곡선은 중요한 신체 기형, 심지어 심장과 폐에 문제를 만드는 극적으로 진행하실 수 있습니다. 이러한 증상은 곡선이 70 ° 8,9를 초과 할 경우 생명을 위협이된다. 곡선의 진행을 방지하거나 중단하는 현재의 치료 옵션이 보강 수술이 (가) 있습니다. 수술 곡선보다 45 ° 또는 보강에 응답하기 위해 예약되어있는 동안 일반적으로, 보강은 25 ~ 40 ° 사이의 곡선을 권장합니다.
약, 특발성 척추 측만증으로 진단 된 아이들의 10 %는 교정 수술 (10)을 필요로하는 곡선의 진행을해야합니다. 현재, 더 입증 된 방법이나 환자의이 종류를 식별 할 수 시험은 없습니다. 결과적으로, 모든 진단 어린이들은 골격 성숙에 도달 보통 때까지 몇 년 동안 여러 방사선 촬영을 실시한다. 그것은 척추 측만증을 가진 전형적인 환자가있을 것으로 추정된다3 년 동안 11에 약 22 방사선 검사. 때문에 여러 방사선 학적 검사의 잠재적 인 위험, 전리 방사선에 아이들을 노출하지 않고 특발성 척추 측만증의 예후를 수행 할 수있는 다른 방식의 접근이 강하게 바람직하다. 이러한 요구를 충족 할 목적으로, 우리는 이전에 빨리 특발성 척추 측만증을 개발의 위험에 자각 증상이없는 아이들을 식별 할 수있는 예후 시험으로 세포 기반 스크리닝 검사를 개발했습니다. 시험은 GI 단백질의 기능적 상태를 검사하고 CDS 의해 측정 GI 단백질 자극 (12)의 최대 반응의 정도에 따라 삼 관능기 (FG1, FG2 및 FG3)에 어린이를 구분하여 두 무증상 및 영향 어린이의 임상 결과를 예측 기반 시스템. 이 시스템은 주로 다양한 세포 유형 13,14,15,16에서 G 단백질을 통해 신호 전달을 평가하기 위해 사용된다. 그것은에 관한 정보를 얻을세포 표면 수용체의 활성화 아래의 임피던스의 변화를 측정함으로써, 외부 자극에 대한 세포의 전체 통합 반응. 세포를 웰의 바닥에 전극을 포함하고, 시스템은 세포와 세포 횡단 전류를 유도 작은 전압을인가 즉 마이크로 플레이트로 시딩 하였다. 잘로 화합물 주입 후, 세포 표면 수용체가 자극 및 신호 전달 사건은 세포와 세포 횡단 전류의 흐름에 영향을 미치는 세포 변화 선도 발생시켜 측정 크기에 영향을 미친다. 이 방법을 사용, 척추 측만증을 개발의 위험에 측만 환자와 아이들 더 건강한 대조군과 비교했을 때 GI 단백질의 자극에 덜 반응하고, 분류는 그룹을 제어 할 수 감소의 상대적인 정도의 비율에 따라 결정됩니다. 분류 범위는 FG3, 40 FG2에 대한 60 %, 60 및 FG1 12 90 % 10 40 % 사이에 고정되어 있습니다.
17를 필요로하는 시점에 진행 위험이 더 있다는 증거를 제공했다. 이 분류 시험의 정밀도는 더 작용기 사이 위장관 자극에 응답에 오스테 오 폰틴 (OPN)의 차동 효과를 입증함으로써 개선되었습니다.
여기에서 우리는 현재 우리의 실험실에서 수행이 기능 테스트의 실험 및 분석 방법의 세부 단계를 문서화합니다.
Protocol
전체 절차는 무균 생물 후드에서 실시하고있는 모든 솔루션과 장비가 세포에 접촉되는 멸균해야합니다.
1. 필수 솔루션의 제조
- 표 1에 따라 솔루션을 준비합니다.
- 사용 시간이 될 때까지 4 ° C의 실내 온도와 모든 다른 솔루션에 균형 염 용액 (BSS)를 유지한다.
- 사용하기 전에 몇 분 동안 물을 욕조에 37 ° C 따뜻한 차가운 미디어.
2. PBMC를 제조 및 저장
- 각 나누어지는에 대한 5 ㎖를 사용하여 PBMC를 두 분주을 준비하는 EDTA 처리 된 컬렉션 튜브에 전체 혈액의 10 ㎖를 수집합니다.
- 50 ML 튜브에 EDTA 처리 포집 관에서 전송 전체 혈액 5 ㎖.
- BSS의 동일한 볼륨을 추가하고 위아래로 부드러운 피펫으로 샘플을 섞는다.
- 두 15 ML 팔콘 튜브에 피콜 3 ㎖를 놓습니다.
- 조심스럽게 4.5 ml의 레이어각 튜브에 피콜 위에 혈액 혼합물을 희석 하였다.
- 튜브 혈액과 피콜의 명확한 분리를 선호하는 최대 5 분 동안 휴식을 보자.
- 아니오 브레이크 실온에서 30 분 동안 400 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 레이어를 방해하지 않도록 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. PBMC를가 BSS / 피콜 인터페이스에서 볼 수 있습니다.
- 피펫 두 튜브의 인터페이스에서 PBMC를 흐린 층을 수확하고 새로운 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 전체 미디어의 20 ML을 추가합니다.
- 실온에서 12 분 동안 288 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 부가 매체의 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 냉동 매체의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- cryovial에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 이소프로판올로 cryofreezing 용기에 cryovial를 놓습니다.
- -80 ° C 하룻밤에 냉동 컨테이너를 저장합니다.
- TRansfer 냉동 PBMC를 장기간 저장을 위해 액체 질소로 나누어지는.
3. 기능 분석
1. 1 일
- 분 또는 해동 될 때까지 37 ° C에서 물을 욕조에 액체 질소에서 나누어지는 놓습니다.
- 멸균 피펫으로 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 전체 미디어의 15 ML을 추가하고 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운.
- 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 부드럽게 PHA 미디어의 1 ml의 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- 동일한 미디어에 20 ㎖에 볼륨을 작성합니다.
- 공기가 입력 할 수 있도록 느슨하게 튜브를 모자.
- 대기 림프구가 빠르게 확산 lymphoblasts로 변환 할 수 있도록 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 하룻밤 튜브를 남겨주세요.
2. 2 일
- 인큐베이터 밖으로 관을 완전히 스크류 캡과 5 분 200 XG에서 세포를 스핀 다운실온에서.
- 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 부드럽게 전체 미디어의 1 ml의 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- 동일한 미디어에 20 ㎖에 볼륨을 작성합니다.
- 공기가 입력 할 수 있도록 느슨하게 튜브를 모자.
- 세포 수를 확장하는 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 하룻밤 튜브를 남겨주세요.
3. 3 일
- 인큐베이터 밖으로 튜브를 얻을 완전히 스크류 캡은 실온에서 5 분 200 XG에서 세포를 스핀 다운.
- 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
- 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 RPMI-1640 10 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 부드럽게 RPMI-1640 600 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
- 자동 세포 계수기와 생존 분석기를 사용하여 세포 농도와 생존 능력을 측정한다.
- 1.5 × 10 5 cells/20 μL의 세포 농도로 조정하는 RPMI-1640의 적절한 볼륨을 추가합니다. 에펜 도르프 튜브의 1.5 ml의 재조합 OPN (rOPN) 또는 차량 (PBS)으로 세포를 치료.
- 두 멸균 1.5 ML 에펜 도르프 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 전송합니다.
- 0.5 μg / ML의 최종 농도에 하나의 튜브에 rOPN를 추가합니다.
- 제 2 튜브에 PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 부드럽게 피펫 팅과 아래로 두 번 100 μL에 멸균 피펫 세트를 사용하여 각 조건을 섞는다.
- 작은 샘플 96 - 웰 마이크로 플레이트를 준비합니다.
- 각 웰에 RPMI-1640 5 μl를 추가합니다.
- 공기 방울을 제거하기 위해 3 분 200 XG에서 접시를 원심 분리기.
- 처리되지 않은 세포뿐만 아니라 rOPN 또는 PBS로 처리 된 세포를 시드.
- 마이크로 튜브에 세포를 전송하기 전에 부드럽게 최대 피펫 아래로 한 번 세포의 균일 한 현탁액을 보장합니다.
- rOPN 또는 PBS에 대한 중복 처리되지 않은 세포에 대한 사통 잘 당 세포 현탁액의 40 μl를 추가 세포를 치료. 다시디자인을위한 그림 1 FER. 이 디자인은 12 명의 환자는 동일한 마이크로 플레이트에서 테스트 할 수있다.
- 세포 배양기에 배치하기 전에 휴식과 우물의 바닥에 균등하게 정착 할 수 있도록 5 분 동안 멸균 후드 세포 판을 둡니다.
- OPN의 효과를 최적화하기 위해 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 18 시간 동안 접시를 품어.
4. 4 일
- 화합물 플레이트를 실행합니다.
- 인큐베이터 밖으로 접시를 타고 약 30 분 동안 실온에서 둡니다.
- RPMI-1640 990 μL에 원액 (10 ㎜)의 10 μl를 추가하여 RPMI-1640 소마토스타틴 (somatostatin)과 이소 100 μM의 1 ㎖를 준비합니다.
- 그림 2에 나타낸 바와 같이 적절한 우물에 20 μl를 분배하여 복합 플레이트를 입력합니다.
- 전에 인해 증발 화합물 농도의 변화를 방지하기 위해 규격에 맞게 자르는 뚫을 씰 복합 플레이트를 커버또는 CDS-기반 시스템에서 배양하는 동안.
- 로드셀 접시, 피펫 팁, CDS-기반 시스템에 복합 플레이트.
- CDS 기반 기기의 소프트웨어 판의 이름을 지정합니다.
- 적절한 프로토콜을 선택합니다. PBMC를 함께 분류에 대한 편집 된 프로토콜은 '작용제 비 부착 세포 작은 샘플 플레이트 RT 15 분'이라고합니다. 프로토콜 상자로 이동하여 프로토콜 목록에서이 프로토콜을 선택
- '시작'을 클릭하여 프로토콜을 시작합니다.
- 통합형 유체 시스템은 동시에 50 μL의 총 부피의 10 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 웰 당 5 μl를 주입하여 모든 웰에 화합물을 추가한다.
- CDS-기반 시스템은 자동으로 화합물을 첨가 한 후 15 분 동안 데이터를 수집한다.
- 데이터 분석
- 비에 대한 추출 된 값을 계산할 때 사용하는 주파수의 하한 및 상한 범위를 선택자기편 세포.
- 시간이 지남에 따라베이스 라인 임피던스 측정의 선형 변화를 해결하는 데 드리프트 보정을 선택합니다.
- 때문에 전기적인 노이즈 및 화합물 첨가에 운동 응답 측정의 변동을 줄이기 위해 데이터 필터링을 선택합니다.
- 전체 분석 시간을 최대 - 최소 방법을 선택합니다.
- 판 형식 옵션에서 Excel로 데이터를 내 보냅니다.
- 다음과 같은 공식을 사용하여 천불 자극 (RmGs)에 대한 응답의 크기의 평균에서 위장관 자극 (RmGi)에 대한 응답 크기의 평균을 뺀 델타 G (ΔG)를 계산한다
ΔG = RmGi - RmGs - (PBS의 존재 하에서 자극 GI에 대한 응답 크기의 평균과 OPN (RmGiOPN)의 존재 하에서 위장관 자극에 응답하여 진폭의 평균을 분할하여 GI-매개 반응에 OPN의 폴드 효과 (철)의 백분율을 계산 RmGiPBS) 다음과 같은 공식을 사용하여 :
철 = 100 × (RmGiOPN / RmGiPBS) - T 참조환자를 분류 할 수 2.
Representative Results
세포 생존율은 86과 96 %의 범위에서 일관된 값으로 모든 샘플 사이에 비교했다. 대조적으로, 높은 변형은 샘플 (표 3) 사이에서 세포 수에 주목 하였다. 사용 된 32 개의 샘플, 두 세포의 수가 부족했고, 분류되지 않았다. GI와 천불 신호 사이의 불균형의 정도에 따라 기능 분류 결과의 예를 그림 3에 보여 주었다됩니다. 이 그림의 세로축은 FG2 +10과 -10 사이 FG3를위한> +10 설립 동적 범위와 작용기 윤곽을 세 부분으로 나누어, 그리고 마지막으로 <-10 FG1입니다. 여기에 테스트를 30 명의 환자 중, 14, 6, 5 명 명확 FG2는 FG3로 분류하고 있었다 각각 FG1, 명의 환자, 특히 345, 353, 370, 371, 및 382, 범위의 경계에있는 동안. 위장관 자극에 대한 반응에 OPN 효과의 평가는 OPN은 펜실베이니아에있는 응답을 증가 것으로 나타났다했다353 및 371 tients. 대조적으로, 반응은 환자 (345) 및 (382)에서 50 % 이상 및 rOPN 처리 다음 환자 370에서 50 % 이하로 감소 하였다. 그래서, 우리의 분류 기준 (표 2)에 따라, 우리는 FG1에있는 환자 353 371을 분류 할 수 있었다 환자 345 FG2 382, 및 FG3있는 환자 370. 병렬로, 모든 환자는 GI 단백질의 자극에 대한 반응에 대한 검사 및 주제를 제어하는 비교 하였다. 예상 한 바와 같이, 모든 환자는 대조군보다 반응이 있었고, 우리의 새로운 절차에 의해 같은 기능 그룹으로 분류되는 환자는 최대 응답 (그림 5)의 비슷한 수준을 보였다. 또한, 각 기능 그룹의 환자 사이의 격차는 새로운 절차의 유효성을 검사, 분류 (12) 우리의 고전적인 범위와 일치했다. 정기적으로 생 저스틴 병원에서 우리의 특수 클리닉에 따라 측만 환자의 큰 일대의 분류는 계시하는 세 가지FG2이 질병의 심각한 진행에 대한 위험이 더으로이 기능 그룹으로 분류 된 환자를 식별하고이 분류 테스트에 유용 할 수 있음을 나타냅니다, 심한 경우들 (그림 6) 주된 동안 작용기 마찬가지로, 보통의 경우에 분산 된 특발성 척추 측만증의 예후.
| 솔루션 | 무수 D-글루코스 | 0.1 % |
| 염화칼슘 2H 2 O | 0.05 ㎜ | |
| MgCl2를 | 0.98 밀리미터 | |
| 의 KCl | 5.4 mM의 | |
| 트리스 | 145 밀리미터 | |
| 솔루션 B | 염화나트륨 | 140 밀리미터 |
| 균형 소금 솔루션 (BSS) | 솔루션 | 1 볼륨 |
| 솔루션 B | 9 볼륨 | |
| RPMI-1640 | 500 ㎖의 | |
| 항생제 항진균 | 1 % | |
| FBS | 10 % | |
| 보충 미디어 | RPMI-1640 | 50 ㎖ |
| 항생제 항진균 | 1 % | |
| FBS | 40 % | |
| 냉동 미디어 | RPMI-1640 | 50 ㎖ |
| 항생제 항진균 | 1 % | |
| FBS | 40 % | |
| DMSO | 20 % | |
| PHA 미디어 | RPMI-1640 | 500 ㎖의 |
| 항생제 항진균 | 1 % | |
| FBS | 10 % | |
| Phytohemaglutinin | 1 % |
표 1. 필수솔루션을 제공합니다.
| ΔG 동적 범위 | 기능 그룹 | 철 동적 범위 |
| ΔG <-10 | FG1 | 페> 100 % |
| -10 <ΔG <+10 | FG2 | 철 <50 % |
| ΔG> +10 | FG3 | 50 % <철 <95 % |
ΔG 및 먹이 설립 동적 범위에 따라 작용기의 표 2. 범주화.
| 환자 | 생존율 (%) | 세포 농도 (× 10 6 / ㎖) | 댓글 |
| 343 | 88.7 | 11.64 | |
| 344 | 90.5 | 13.6 | |
| 345 | 94.4 | 8.54 | |
| 346 | 94.3 | 25.79 | |
| 347 | 94.2 | 27.36 | |
| 348 | 94.6 | 8.52 | |
| 349 | 91.2 | 0.82 | 세포의 수가 부족 |
| (350) | 90.3 | 8.92 | |
| (352) | 92.6 | 8.28 | |
| 353 | 91.3 | 12.75 | |
| 354 | 86.9 | 7.62 | |
| 355 | 91.2 | 7.51 | |
| 356 | 90.3 | 9.36 | |
| 358 | 95.1 | 16.94 | |
| 359 | 92.3 | 13.89 | |
| (360) | 89.4 | 7.67 | |
| 361 | 93.5 | 7.84 | |
| 365 | 86.5 | 2.2 | 세포의 수가 부족 |
| 368 | 92.6 | 15.69 | |
| 369 | 93.4 | 10.9 | |
| (370) | 92.5 | 19.93 | |
| 371 | 88.8 | 10.68 | |
| 374 | 93.9 | 16.86 | |
| 376 | 92.9 | 15.67 | |
| 377 | 93.1 | 9.99 | |
| 378 | 93.6 | 13.57 | |
| 379 </ TD> | 92.6 | 19.86 | |
| (380) | 91.1 | 8.46 | |
| 381 | 93.9 | 14.82 | |
| 382 | 92.1 | 23.06 | |
| 383 | 92.9 | 11.82 | |
| 384 | 89.1 | 7.73 |
표 3. 자동 세포 계수기 및 생존력 분석을 이용하여 결정 퍼센트 생존율 및 세포 농도.
세포 파종 그림 1. 디자인.
그림 2.화합물 분배를위한 디자인.
그림 3. CDS-기반 시스템을 사용하여 기능적인 분류의 다이나믹 레인지. 그래프 GI 특발성 척추 측만증 환자에서 PBMC를 얻을 Gs의 자극에 대한 반응 사이의 불균형의 정도의 값을 보여줍니다. 밸류는 소마토스타틴 및 이소 10 μM에 응답하여 CDS-기반 시스템에 의해 측정 하였다. 각 점은 중복 된 두 반응의 ΔG를 나타냅니다.
그림 4. 된 PBMC의 위장관 자극에 대한 반응에 rOPN의 효과. 세포의 존재 또는 0.5 ㎍ / ㎖의 rOPN의 부재에서 18 시간 동안 혈청에 굶주린 다음 10로 자극 하였다 56, 소마토스타틴 (somatostatin)의 M은 GI-매개 세포 반응을 시작합니다. 그래프의 데이터는 최대 - 최소 임피던스에서 생성 및 복제에 대한 응답의 평균에 해당되었다.
그림 5. 제어 및 scoliostic 과목에서 PBMC를있는 GI 단백질의 기능 상태를 표시합니다. 대조군과 측만 환자의 PBMC를가 내생 소마토스타틴 수용체를 통해 GI 단백질을 자극하는 소마토스타틴 (somatostatin)의 농도 증가에 노출되었다. 절차 섹션에서 설명 된대로 세포 반응은 CDS-기반 시스템에 의해 측정 하였다. 곡선은 최대 - 최소 임피던스에서 생성되었다. 각각의 곡선은 비선형 회귀를 나타냅니다. 데이터는 대조군에서 세포의 최대 반응을 정상화하고 각 지점은 중복에 대한 응답의 평균에 해당되었다./ 50768/50768fig5large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
척추 측만증의 다른 단계들 작용기의 그림 6. 배포. 정기적으로 생 저스틴 병원에 따라 794 정도 (10-44 ° 사이의 곡률), 162 (이상 45 °를 곡률) 심한 경우와 측만 환자의 큰 일대는 GI와 천불에 반응 사이의 불균형의 자신의 정도에 따라 분류되었다 자극. 반응은 소마토스타틴과 이소 10 μM에 응답하여 CDS-기반 시스템에 의해 측정 하였다.
Discussion
우리는 갓 격리 또는 액체 질소에서 최대 1 년 동안 냉동 보존 말초 혈액 단핵 세포에 적용 할 수있다 특발성 척추 측만증에 대한 세포 기반 예후 테스트 (PBMC를)에 대한 자세한 절차를 설명했다. 개인의 큰 숫자를 테스트 할 때 갓 고립 된 PBMC를 사용하는 것이 부담이되기 때문에, 절차는 임상 환경에서보다 실용적인 대안을 제공 냉동 PBMC를 제시했다. 냉동 된 PBMC를 처음 분석 간 변동에 때때로 선도, 사용 된 경우에는, 해동시 세포 응집에 문제가 발생했다. 분석의 재현성을 극대화하기 위해, 우리는 동결 - 해동 사이클을 피하고 한 번 고정 된 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 절차는 단시간에 결함 GI 단백질 기능의 정확한 검출을 허용 매우 간단하다. 이 절차를 사용하여, 증상 및 측만 아이들은 쉽게 더 나은 자신의 건강에 대한 위험없이 임상 결과를 예측하는 분류 될 수있다. 호건강한 대조군 12 GI 자극 상대에 대한 최대 응답의 정도에 따라 분류를 수행 할 때 Wever에게는 대조군에 대한 몇 가지 요구 사항이 충족되어야한다. 실제로, 적절한 비교 코호트를 갖기 위해, 대조군은 약물의 종류에 있어야하고, 그러한 과거 개별 / 가족 병력 등의 개인 정보를 제공하지, 나이 및 성별과 일치해야한다. 이러한 요구 사항은 대조군의 채용에 중요한 장애물을 구성 할 수있다. 따라서, 동일한 개인의 GI와 Gs의 단백질 자극에 응답 사이의 불균형의 정도를 검사함으로써 종별을 수행하면 대조군을 사용의 필요성을 제거하기 위해 이상적이다.
이 예후 테스트를 수행하는 CDS-기반 시스템의 이용은 동시에 동일한 분석에서 GI와 GS-매개 세포 반응을 제공하는 측면에서 중요하다. 많은 환자 명 AM으로 분류 될 수 있지만본 보고서의 결과에 의해 도시 된 바와 같이 biguity이 분석을 위해 고정 된 동적 범위를 이용하여, 환자의 소수는, 광범위의 경계에서의 값을 나타낼 것이다. 이러한 개인을 구별하기 위해, 우리는 OPN은 세 가지 기능 그룹 중 GI-매개 세포 반응에 차등 효과를 유도하는 것을 보여줌으로써 위장관 자극에 응답에 OPN의 효과의 평가를 소개했다. 사실, 우리는 OPN, FG1에있는 위장관 자극의 증가에 대응하여,의 존재가 FG2에서 더 높은 정도, FG2와 FG3 감소하는 동안 것으로 나타났습니다. OPN의 높은 비용에도 불구하고, 본 케모카인의 사용이 모호한 경우를 구별하고, 따라서 우리 종별 분석의 정확성을 향상시키기 위해 필수적이다. 그러나 이러한 분석은 웰 당 1.5 × 105 세포의 최소값은 우리 실험 조건 하에서 CDS 기반 시스템과 세포 반응을 관찰하기 위하여 필요하다는 단점이있다. 특정 환자의 샘플은 충분한 수의가되지 않습니다시험되어야하는 세포. 이 경우에는 의료 검사실 직원 가정용 우려 초조 수있는 추가 채혈을 위해 환자를 호출 할 필요가있다. 전향 적 연구는이 문제를 해결하기 위해 우리 실험실에서 계획되어 있습니다.
그럼에도 불구하고, 현재의 프로토콜 테스트가 세포의 반응을 모니터링하기 위해 검증 된 레이블이없는 시스템 (13, 14)를 사용하여 자동화하는 동안 세포를 준비하는 간단하고 입증 된 방법을 사용합니다. 다른 질병의 예후에 해당하는 유전 플랫폼과 비교하여 테스트 플랫폼은 상대적으로 저렴하다. 또한, 혈액 수집 튜브, 조언, 특수한 전극 마이크로 플레이트, 및 원추형하고 에펜 도르프 튜브를 포함하여 모든 일회용 재료의 비용은 매우 고가가 아니며 약 천 환자에 대한 테스트를 완료 할 $ 3,000 이하로 추정된다. 이 추정치는 샘플의 제조를위한 인건비를 포함하지 않지만및 테스트를 수행,이 테스트는 상당히 저렴한 차세대 시퀀싱 플랫폼보다 남아있다. 주목할는 유전 플랫폼 비용 비교뿐만 아니라, 그러나보다 구체적 AIS의 분야에 관련, 방사선 촬상에 관련된 비용이다. 오늘날, 미국에서 백만 명 이상의 아이들과 캐나다에서 약 100,000 아이들은 특발성 척추 측만증으로 진단하고, X-선 노출에 의한 진단과 측만 아이들의 감시의 총 비용은 북미에서 연간 25 억 달러 이상입니다됩니다. 따라서, 우리의 세포 기반 분석의 절차는 일상적인 검사 및 건강 위험없이 저렴한 비용으로 특발성 척추 측만증 아동의 모니터링에 적합 할 것으로 예상된다.
Disclosures
여러 특허에지도이 작품은 여러 나라에서 보류중인 생 저스틴 대학 병원 및 많은 다른 사람에 의해 개최. 네 번째 차원 척추 LLC는 생 저스틴 대학 병원의 독점적 인 면허 소지자입니다.
Acknowledgments
이 작품은 (닥터 모로에) 라 매그 이브 Cotrel 드 난 문화원 드 프랑스, 파리, 프랑스에서 교부금에 의해 지원되었다, 건강 연구의 캐나다 연구소는 (닥터 모로에 PP2-99466을 부여)와 네 번째 차원 척추 LLC에서 , 뉴욕, 미국 (닥터 모로에 연구 보조금).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
| FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
| Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
| Somatostatin | Tocris | 1157 | |
| Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
| PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
| Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
| Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
| 50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
| Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
| Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
| Equipment | |||
| Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
| Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
| Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
| Water bath | VWR International | 89032-204 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
| Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
| Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
| Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |
References
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