Summary
Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada.
Abstract
Los métodos tradicionales de inmunohistoquímica (IHC) siguientes de fijación del tejido permiten la visualización de varios tipos de células. Estos suelen proceder a la aplicación de anticuerpos para unirse a antígenos e identificar células con características que son una función de la biología y el desarrollo inherente. Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en la que una célula madre neural de reposo puede convertirse en activa y proceder a través de las etapas de la proliferación, la diferenciación, la maduración y la integración funcional. Cada fase es distinta con una morfología característica y la regulación positiva de genes. La identificación de estas fases es importante entender los mecanismos de regulación en el juego y cualquier alteración en este proceso que subyacen en la fisiopatología de los trastornos debilitantes. Nuestro enfoque de recuperación de antígeno inducida por el calor mejora la intensidad de la señal que se detecta y permite la correcta identificación del tipo de células progenitoras. Como se discutió en estepapel, sobre todo, nos permite evitar los problemas actuales en la detección de ciertos tipos de células progenitoras.
Introduction
La neurogénesis, la generación de nuevas neuronas a partir de células madre neurales, ahora se sabe que se producen constantemente en la edad adulta en dos regiones especializadas en el cerebro. Estos incluyen la zona subventricular (SVZ) de el bulbo olfativo y la zona subgranular (SGZ) de la circunvolución dentada en el hipocampo. Durante la última década, el campo de la neurogénesis del hipocampo adulto ha visto un trabajo importante. La región ha atraído mucho interés ya que las neuronas recién nacidas en la SGZ contribuyen a la plasticidad neuronal mejorada que puede mantener las funciones cerebrales específicas 1-5. Neurogénesis del hipocampo adulto se ha implicado a desempeñar un papel importante en la regulación del estado de ánimo, la regeneración y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, ha habido un esfuerzo concertado para entender el desarrollo y la regulación de las neuronas en este rico nicho neurogénico.
Un aspecto inevitable e importante de estudiar neurogénesis del hipocampo adulto es la identificación de sta separadobios que una célula madre neural activado atraviesa en su camino a convertirse en una neurona completamente funcional. En este proceso, la célula madre neural de reposo se activa y procede a través de una serie de principios activos y finales de los tipos de células progenitoras activas (Figura 1). Estas poblaciones distintas de progenitores neurales pueden ser identificadas por la morfología y su expresión de marcadores moleculares tales como MCM2, nestina, tbr2 y Doublecortin (DCX) y NeuN que guían la conversión de RGLs en sus respectivos tipos de células progenitoras. La nestina es una proteína de filamento intermedio que se expresa a través de las células de la glia-como radiales y algunos tipos de células progenitoras tempranas. Otro marcador es tbr2 que se expresa específicamente en las células progenitoras de amplificación. La expresión del transgén tbr2 está inicialmente apagada en las células de tipo 1 (radial-glia similares), activado a través de los Type-2a, progenitores-Type 2ab y Type-2b y apagó entre los más diferenciado Type-3 e inmaduroneuronas (Figura 1). DCX es un marcador de la migración neuronal que se expresa en el Tipo-2ab, Tipo-2b y Tipo-3 progenitores neurales. El uso de esta combinación de tres marcadores, podemos etiquetar subtipos distintos de progenitores neurales. Estos incluyen el tipo 1 (MCM2 + nestin + tbr2-), Tipo-2a (MCM2 + nestin + tbr2 +), Tipo-2ab (MCM2 parcial + nestin-tbr2 + y parcial MCM2 + tbr2 + DCX-), Tipo-2b ( MCM2 + + tbr2 DCX +) y Tipo-3 (MCM2 + tbr2-DCX +). Células post-mitóticas tales como las neuronas inmaduras y funcionalmente integrados pueden ser identificados mediante la utilización de DCX y el marcador neuronal maduro, NeuN.
Los métodos tradicionales de IHC utilizan anticuerpos para identificar antígenos para tipos de células específicas en función de su expresión génica. La visualización posterior a través de técnicas de formación de imágenes de alta resolución tales como la microscopía confocal se puede utilizar para su identificación. Sin embargo, actualmente hay problemas que existen con estos métodos que no permiten la identificación eficaz delos tipos de células de células glia-como radiales y progenitoras tempranas. Es difícil identificar estos tipos de células particulares debido a que el anticuerpo aplicado no es capaz de penetrar y unir la proteína nestina de manera eficiente. La nestina es la proteína de filamento intermedio que comprende los procesos radiales producidas por la célula-glía como radial. La ineficiente de unión de un anticuerpo al antígeno puede ser el resultado de muchos factores, incluyendo tiempo de fijación, la temperatura y la técnica utilizada 6-7. Para ayudar a resolver estos problemas, hemos desarrollado un antígeno de recuperación o método de "ebullición". Además de nestina, este método de recuperación de antígeno también mejora la tinción para otros marcadores tales como Ki67, BrdU, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), tbr2 y MCM2. Nuestro método combina junto enfoques químicos y físicos. Se trata de la fijación química del tejido en paraformaldehído y la posterior alta temperatura de ebullición de secciones de hipocampo coronales delgadas en un tampón de un desnaturalizante y chaotroptratamiento IC. Esto mejora la accesibilidad del antígeno al anticuerpo, mejora la especificidad del anticuerpo y permite una mejor identificación de los tipos de células progenitoras. Nuestro enfoque es simple de usar que requiere herramientas y reactivos en su mayoría ya están disponibles en el laboratorio. Hemos utilizado extensivamente para estudiar el desarrollo de las células madre neurales y su regulación a través de factores ambientales o genéticos intrínsecos extrínsecos 8.
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Protocol
1. Pre-inmunohistoquímica: Perfusión e Histología
- Perfundir ratones según un protocolo transcardial generales adaptados para los ratones y extraer los cerebros en paraformaldehído al 4% (PFA) 9.
- Agregar los cerebros en PFA durante la noche a 4 ° C (por ejemplo, un tubo cónico de 10 ml llena con PFA). Tenga en PFA durante al menos 12 a 24 horas, no más de 36 horas para el pleno fijación. Después de la fijación durante la noche, vaciar PFA de tubo cónico, pero dejan el cerebro por dentro. Verter 30% de sacarosa en el tubo y lavar los cerebros durante un breve 5 segundos para eliminar cualquier PFA residual. Finalmente, el tubo de llenado que contiene cerebros con 30% de sacarosa de nuevo. Mantener el cerebro en sacarosa a 4 ° C hasta que el cerebro se hunden hasta el fondo del tubo.
- Cortar 40 micras secciones del cerebro en un micrótomo. Consulte a un atlas de cerebro de ratón para iniciar la recogida de las secciones desde el principio del giro dentado hasta su extremo. Preservar secciones de solución anticongelante (una receta simple es de 300 g de sacarosa en 500 ml de 0,1 M PBS y 300 ml ethileno glicol) hasta que esté listo para inmunohistoquímica.
- Monte el tejido cortado en portaobjetos de microscopio específicamente diseñadas para adherirse fuertemente a los tejidos. Estas diapositivas proporcionan una fuerte influencia en el tejido durante la fase de ebullición. Después de montar el tejido, por favor, dejar secar diapositivas durante 10 min o hasta que esté completamente seco. El secado puede ser acelerado si el portaobjetos se apoyó en una superficie vertical con el borde inferior de la diapositiva en una toalla de papel. Si se está montando más de una diapositiva, el otro carro (s) se puede dejar secar durante ese tiempo (1-2 horas está bien) hasta que esté listo para proceder con el siguiente paso.
- Una vez que la diapositiva está seca, lavar con PBS tres veces durante 5 minutos cada uno y seco otra vez (tampón PBS = M NaCl 0,137, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na 2 PO 4). Esto garantiza que la química anterior (tales como glicerol a partir de solución de almacenamiento anticongelante) se elimina suficientemente y no puede perjudicar la adherencia del tejido a la diapositiva.
2. Preparación de los reactivos y Minor Equipos
- Preparar Solución A (0,1 M o ácido cítrico 19,21 g / l) y la solución B (0,1 M o 24,9 g l de citrato / Tris-sodio) en la que se pueden hervir secciones de tejido.
- En un cilindro graduado, combinar 9 ml de la solución A y 41 ml de la solución B. Añadir 450 ml de ddH2O a esta mezcla.
- Vierta esta mezcla en un recipiente vacío (por ejemplo, una caja de puntas de pipeta de vacío) que es apto para microondas.
3. Inducida por calor La recuperación del antígeno
- Hervir la solución hecha en el paso 2 durante 5 minutos a la elaboración de normas en el microondas estándar. La solución se iniciará de ebullición a o por encima de 100 ° C.
- Una vez que hierva, retire con cuidado el recipiente del horno de microondas y coloque las diapositivas secas en él, lo que garantiza la diapositiva-cara con secciones de hipocampo está mirando hacia abajo y totalmente expuesta al líquido. Si es posible, coloque los portaobjetos en un ángulo contra las paredes de la caja y la pila otras diapositivas que les rodean. Asegurar su "encajar" dentro de la caja de is apretado para las diapositivas no tienen espacio para moverse en la parte superior de uno al otro.
- Hierva esta mezcla con diapositivas durante 7 minutos a los ajustes estándar en el microondas. La solución se hierve durante este tiempo en o por encima de 100 ° C.
- Durante esta etapa de ebullición, llenar dos cubos de hielo hasta la mitad con hielo.
- Una vez que hierva en el paso 3.3, retire el recipiente del horno de microondas y colocarlo dentro de uno de los cubos de hielo. Verter el resto del hielo desde el otro cubo de todo el recipiente y cubrir por completo. Dejar reposar durante 1 hora.
4. Primaria y Secundaria tinción de anticuerpos
- Al final del período de espera de 1 hora, eliminar las diapositivas desde el recipiente y lavar con TBS-T 3x tampón durante 5 min cada uno. Cualquier aparato puede ser utilizado para llevar a cabo estos lavados básicos. (Tampón TBS = Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, TBS-T = 0,05% de Triton X-100 tampón TBS, TBS-TT = 4% de suero de burro tampón TBS-T).
- Después del lavado, deje que los portaobjetos se sequen en un lugar oscuro (
- Una vez que el carro se haya secado, dibuja un contorno alrededor de las secciones de tejido utilizando una pluma repelente al agua. Durante el paso 4.5, este esquema actúa como una barrera que impida la mezcla de anticuerpo que fluye sobre.
- Preparar la mezcla de anticuerpo primario en TBS-TT. Por lo menos 500 l se requiere para cubrir toda una diapositiva, por ejemplo, si el anticuerpo de valores es en 1:500 concentración, añadir 1 l de anticuerpo particular, para 500 l de TBS-TT). Utilizar anticuerpos primarios como se menciona en la tabla reactivos.
- Colocar el portaobjetos secos en la parte superior de la etapa en la víaaining cámara. Añadir 500 l de los anticuerpos primarios lentamente y cubrir toda la superficie. Cubra el aparato entero y envolver en papel de aluminio para bloquear la luz externa. Dejar reposar durante toda la noche a temperatura ambiente.
- El día siguiente, lavar el portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón TBS-T. Deje que se seque en un lugar oscuro, como se describe en el paso 4.2.
- Preparar la mezcla de anticuerpo secundario similar a la etapa 4.4. Consulte la tabla de reactivos para anticuerpos secundarios.
- Colocar el portaobjetos en la cámara de secado tinción como se describe en los puntos 4.2 y 4.5. Añadir 500 l de los anticuerpos secundarios lentamente y cubrir toda la superficie. Envuelva la cámara de tinción en papel de aluminio para protegerlo de la luz externa. Dejar reposar cubierto y protegido de la luz exterior durante al menos 2 horas a temperatura ambiente.
- Después de la terminación de la tinción secundaria, lavar el portaobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón TBS-T. Deje que el portaobjetos seco en una zona oscura. Después del secado, ponga solución de montaje y cubrir la diapositiva won un cubreobjetos evitando cuidadosamente toda introducción de burbujas. Deje que el portaobjetos se sientan en una zona oscura durante al menos 2 horas antes de su análisis posterior.
- Realice time-lapse o análisis confocal en el tejido manchado.
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Representative Results
Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso secuencial en el que el tipo de células progenitoras representante en cada etapa puede ser identificado con una combinación de marcadores. Fijación química cuidadosa y antígeno de recuperación mejora la eficacia y la accesibilidad de los marcadores que son difíciles de detectar. Uno de ellos es nestina que se expresa entre las células madre radiales-gliales como neuronales y algunos tipos de células progenitoras tempranas activos. Nestin puede ser una proteína clave en la identificación de tipos de células progenitoras pronto como su expresión se pierde cuando la célula madre o progenitoras diferencia a continuación en una neurona madura.
Un diagrama esquemático del proceso secuencial de neurogénesis en el hipocampo adulto que ocurre en la SGZ se muestra en la Figura 1A. Se divide en la mitosis y las etapas post-mitótico. Los marcadores genéticos que permitan la identificación se muestran en todo el espectro de su expresión. El radial neural cel madre-glia comoL puede ser identificado a través de su expresión de GFAP y nestina, una proteína del filamento intermedio que comprende los procesos radiales. Células glia como radiales quiescentes y en división activa pueden identificarse a través de su expresión de MCM2, un marcador de proliferación expresó uno de los tipos de células progenitoras de la mitosis. Los tipos de células progenitoras o células progenitoras intermedia de amplificación transitorias expresan una variedad de marcadores que se pueden utilizar para identificar ellos. Estos incluyen tbr2 que se expresa transitoriamente a través de los primeros progenitores activos, DCX que es un marcador de maduración neuronal NeuN y que es un marcador neuronal maduro. El uso de esta combinación de tres marcadores, etiquetamos tipos distintos de células amplificadoras transitorias; Tipo-1 (MCM2 + nestin + tbr2 -), Tipo-2a (MCM2 + nestin + tbr2 +), Tipo-2ab (MCM2 parcial + nestin-tbr2 + y parcial MCM2 + + tbr2 DCX -), Tipo-2b (MCM2 + tbr2
Figura 1. Desarrollo de células madre neurales durante la neurogénesis del hipocampo adulto. (A) neurogénesis en el hipocampo adulto se representa a través de la zona subgranular de la circunvolución dentada. An-glia radial como células madre activado (tipo 1) pasa por fases distintas que se diferencia, madura y funcionalmente se integra con una morfología compleja en el circ neuronaluit. Cada una de las fases y los respectivos tipos de células pueden ser identificados en base a su expresión de una combinación de marcadores. MCM2 es un marcador de proliferación que se expresa a través de todos los tipos de células progenitoras de la mitosis, mientras que nestin se expresa sólo entre la célula madre radial-glia como progenitores y Tipo-2a. A medida que los progenitores Type-2a se diferencian, nestin expresión se activa antes que nada y aumenta la expresión tbr2. En el progenitor post-mitótico, la expresión de MCM2 se pierde mientras DCX y expresión NeuN dictan la migración y la maduración en una neurona funcional. Imagen confocal muestra de MCM2 (púrpura), nestin (verde) y DAPI (rojo (B) se muestra a la izquierda es ) tinción. El aumento en caja muestra un progenitor expresar nestin-glia como radial, MCM2 y DAPI. Se muestra a la derecha es una imagen confocal muestra de MCM2 (azul), tbr2 (rojo), DCX (verde) y DAPI (gris) de la tinción. Esto es característico de un tipo-2b tipo de células progenitoras que se muestra en la caja de exp ampliaciónressing MCM2, tbr2, DCX y DAPI. Las barras de escala: 20 micras. Haz click aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Los pasos más importantes para el éxito de la recuperación de antígeno y la tinción de tipos de células progenitoras son: 1) la utilización de buena perfusión y tejido fijado del espesor coronal óptima; 2) con tiempo suficiente para la ebullición y posterior enfriamiento durante la recuperación de antígenos, y 3) la destreza manual en montaje secciones coronales fijos y prevenir su daño al hacerlo.
Es crítico para IHC usar tejido perfundido que ha sufrido suficiente fijación pero no sobre-fijación. Una dificultad principal puede ser la inaccesibilidad del antígeno al anticuerpo. Nuestro método fue diseñado para mejorar la accesibilidad. Perfundir correctamente el animal durante la cirugía y posterior fijación es esencial como un primer paso. En nuestro protocolo, permitimos que la PFA 4% a perfundir a través del animal durante al menos 5 minutos antes de extraer el cerebro. Posteriormente, creemos que es importante dejar que el cerebro extraído en PFA al 4% durante un mínimo de 12 horas durante la noche para un máximo de 24Hr -36. Se trata de una duración óptima de PFA y un período más largo puede sobre-corregir el tejido introduciendo más enlaces cruzados de proteínas. Después de PFA fijación, el cerebro se puede dejar en sacarosa por un período indefinido de tiempo sin afectar la viabilidad del tejido. Cuando esté listo para el análisis histológico, el grosor del tejido desempeña un papel importante. Cerebros de hipocampo deben ser completamente congelado antes de ser cortado para mantener la consistencia del tejido en el espesor y la integridad de la estructura. Hemos utilizado las secciones 40 a 60 micras para IHC. Este espesor se eligió principalmente porque 1) es de suficiente espesor para la accesibilidad de antígeno-anticuerpo y vinculante, y 2) la utilización de la microscopía confocal, hemos sido capaces de tomar fotografías en los puntos focales separados dentro de este grosor y unir las imágenes de tres Resolución dimensiones del nicho neurogénico. Espesor coronal más de 60 micras pueden impedir la accesibilidad del antígeno y la eficacia del proceso de recuperación de antígeno como se describe.
En general, la fijación del tejido introduce enlaces cruzados de proteínas que posteriormente son descompuestos por el antígeno de recuperación durante la etapa de ebullición. El grado de esta reticulación puede ser un resultado de tiempo de fijación, temperatura y concentración de 6. Por lo tanto, el pensamiento Debe prestarse especial atención a la duración de la fijación como se describió anteriormente. Nuestro método de antígeno de recuperación utiliza tanto un enfoque químico y físico. Si bien nuestro enfoque químico es la fijación cuidadosa de los tejidos en PFA, nuestro enfoque físico es el de ebullición después de romper los enlaces cruzados de proteínas. Desnaturalización térmica utilizando un horno de microondas promueve un efecto de desenmascaramiento, ya que altera la estructura secundaria y terciaria de las proteínas 6. Se han propuesto otros mecanismos incluyendo la oscilación rápida molecular 6,10,11. Por lo tanto, la ebullición en el tampón de ácido cítrico y citrato trisódico es un paso clave en la recuperación de antígeno. Enlaces de proteínas se descomponen y la accesibilidad del antígeno toa determinado anticuerpo mejorado mucho. Mientras que los 5 min de precalentamiento se han proporcionado en los pasos 3.1, es vital para asegurarse de que la solución está hirviendo en la final de la etapa 3.1 (por encima de 100 ° C). Cuando sumergiendo los portaobjetos de tejido en esta solución a hervir, las diapositivas debe estar boca abajo en el recipiente y totalmente expuestas a la solución. Esto asegurará que el efecto de la ebullición (y la tinción de anticuerpos después) es incluso a través de todas las secciones. Por último, una cierta cantidad de destreza manual es útil en el montaje de las secciones de hipocampo a las diapositivas. Mientras que las secciones se adhieren muy fuertemente a los portaobjetos utilizados en este protocolo, es útil para asegurarse de que 1) las secciones se montan plana sobre los toboganes y 2) después del montaje, las secciones de hipocampo se secan, a continuación, se lavaron con PBS y se secaron de nuevo antes de ser hervido en el paso 3.3. El propósito de un lavado con PBS es eliminar todos los productos químicos (tales como glicerol del almacenamiento previo de material histológico en solución anticongelante) que puedenhacer que las secciones de "slip" y salirse de las diapositivas cuando se hierve. Por otra parte, para BrdU o tinción de Ki67 para etiquetar células que se dividen, en comparación con un método de recuperación de antígeno tratado con HCl, el método de recuperación de antígeno hirviendo que aquí se presenta es más eficiente en la prestación de un número constante de células marcadas. Además, en el caso de la parafina de tejido seccionada, cualquier resto de parafina sustrato presente en el tejido se puede eliminar a través de este método de ebullición. Por lo tanto, nuestro método de ebullición también puede ayudar en la inmunotinción de parafina de tejidos seccionados.
El protocolo descrito aquí proporciona un método fácil de uso del antígeno de recuperación que mejora la eficacia con la que se identifican los tipos de células progenitoras en el nicho neurogénico de la SGZ. Esto evita los problemas actuales en la identificación de los procesos radiales de células madre neurales-glia como radiales, y mejora o mantiene la eficiencia de la identificación de otros tipos de células progenitoras. Tanto el O integridadf el tejido y la especificidad de los anticuerpos se mantiene lo que permite imágenes de alta resolución. Neurogénesis en el hipocampo de adultos es un proceso clave que mantiene y mejora la naturaleza plástica del cerebro. Por lo tanto, una comprensión del desarrollo y la regulación de una célula madre neural en una neurona funcionalmente integrado puede darnos pistas sobre cómo la neurogénesis mejora las funciones específicas del cerebro, y también cómo se puede manipular terapéuticamente para tratar trastornos cerebrales debilitantes. Nuestro método de antígeno de recuperación es una herramienta simple pero potente que puede ayudar en este proceso.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
La metodología fue desarrollada originalmente en el laboratorio del Dr. Hongjun canción en el Instituto de Ingeniería Celular, Departamento de Neurología de la Escuela de Medicina Johns Hopkins. Este trabajo fue financiado por el NIMH (R00MH090115), NARSAD, la Orden Fraternal de la Fundación para la Investigación del Cáncer Mayo de águilas, y un paquete de puesta en marcha de la Fundación Mayo adjudicado a MHJ y Ciencia Investigación Básica del Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (A3014385) otorgados a WRK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus Slide | Fisherbrand | 12-550-15 | Provides strong adherence to hippocampal tissue during boiling |
| PVA/DABCO Mounting Media | Sigma Aldrich | 10981-100 ml | |
| Nestin (chicken) | Aves Lab | NES | Neural stem cell marker |
| GFAP (rabbit) | Dako North America | Z033401-2 | Astrocyte and neural stem cell marker |
| MCM2 (mouse) | BD Transduction Laboratory | 610701 | Proliferation marker |
| DCX (goat) | Santa Cruz Biotechnology | SC8066 | Immature neuron marker |
| Tbr2 (rabbit) | Abcam | Ab23345 | Amplifying progenitor marker |
| NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Mature neuron marker |
| Cy2 (anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch | 111-226-047 | |
| Cy2 (anti-chicken) | Jackson Immunoresearch | 303-165-006 | |
| Cy5 (anti-mouse) | Jackson Immunoresearch | 315-175-047 | |
| Cy5 (anti-goat) | Jackson Immunoresearch | 305-165-047 | |
| DAPI | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Dako Pen | S2002 | Dako | Water-repellant pen |
References
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