Summary
我々は、順次、オンチップバイオ直交環化学と抗体抗原取り込みを使用して、低分子の急速な可逆固定化および表面プラズモン共鳴（SPR）の研究のための官能化ナノ粒子集合体のための手法を提案する。
Abstract
配向および固定化密度を制御有する生物活性小分子の迅速な表面固定化のための方法は、バイオセンサー、マイクロアレイの用途に非常に望ましい。本研究では、TCO / TZ-誘導体化分子のマイクロ流体の固定化を可能にするために非常に効率的な共有結合性バイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）の間[4 +2]環化反応および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）を使用する。我々は、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて連続流条件下で、リアルタイムでプロセスを監視する。可逆的な固定化を可能にし、センサ表面の実験範囲を拡張するために、我々は、付加環化反応と非共有結合抗原 - 抗体捕捉成分を結合する。交互にセンサ表面にTCOまたはTzの部分を提示することによって、複数の捕獲 - 環化のプロセスは、多成分構造体の様々なオンチップ·アセンブリとの相互作用の研究のために一つのセンサー表面上に今や可能である。私たちは、私バイオセンサーチップ上に2つの異なる固定化実験で、この方法をllustrate、小分子、FK506結合タンパク質12（FKBP12）に結合AP1497と同じ低分子固定化され、 その場官能化ナノ粒子中の一部として。
Introduction
効率的な結合反応は、バイオテクノロジーの様々なアプリケーションのために表面に生物活性分子を付着させるための貴重なツールです。最近では、非常に高速なバイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）間の[4 +2]環化反応は、細胞表面、細胞内構造、抗体およびナノ粒子を標識するために使用されてきた1。 - 7ここでは、表面プラズモン共鳴（SPR）相互作用分析のための多成分構造の可逆オンチップ合成のために、抗原/抗体捕捉（GST /抗GST）との組み合わせで、[4 +2]付加環化反応を使用してモニターリアルタイムでのプロセス（ 図1）。8,9特に、キャプチャ付加環化戦略が確立されたプロトコルを使用して表面の再生を可能にします。8結果として、新たなアッセイの様々なリガンドの向きや密度を制御して安定したセンサ面の集合体フォーマットが可能になりました。使い方この戦略は、我々は、TCO / TZ-誘導体化小分子の固定化を実証し、バッファの様々な条件で環化率を特徴づける。我々は、直接、固定化GST抗原に結合した場合、キャプチャ·環戦略がその標的と相互作用する低分子の能力を保持していることを確認するために、一例として、FKBP12 10-12結合しFKBP12分子AP1497の間のよく知られた相互作用を選びましたまたは固定化ナノ粒子（NPS）へ。
この方法は、いくつかの利点があります。まず、センサーチップ上の小分子の可逆的な固定化が可能になりました。第二に、低分子のTCO / Tzの固定化にも標準的なSPRの研究の方向を逆転させるラベルフリー相互作用の研究を可能にし、結合相互作用の補完的なビューを提供することがあります。第三に、この方法は、標的化ナノ粒子のマイクロ流体合成、およびそれらのバインディンの即時評価を可能G特性。これは、標的化ナノ粒子の評価又はスクリーニングの効率を向上させ、また必要なナノ粒子の量を減少させることを約束する。13-15第四に、このアプローチは、連続流の下でリアルタイムにバイオ直交付加環化反応の反応速度を測定することができる。最後に、TCO / Tzの固定化化学は、血清の存在下でロバストである。一緒になって、我々は、この汎用性の高いアプローチが広くin vitroおよびin vivoの携帯アプリケーションでの関連性のマイクロ流体研究の多種多様な安定したセンサ面の構築を容易にすることを期待しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。 GSTおよびナノ粒子（NP）複合体の調製
- GST-TCOの調製：
- GST（PBS中1 mg / ml）を100μlにTCO-NHS溶液8μL（DMSO中50 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。
- のZebaスピン脱塩カラムを使用して過剰の試薬を除去。 GST-TCOコンジュゲートを含有するろ液を回収し、使用前に4℃で保存する。
- GST-TZの準備：
- GST（PBS中1 mg / ml）を75μlにTZ-NHS溶液6μL（DMF中25 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。
- PBS25μlの反応混合物を希釈し、スピン脱塩カラムを用いて精製する。 GST-Tzのコンジュゲートを含有する濾液を、使用前に4℃で保存する。
- NP-TCOの調製：
- TCO-NHS溶液を100μl（DMSO中50 mM）をを追加アミノ化ナノ粒子を150μl（NP-NH 2、8.7mgの鉄/ PBS溶液で、3nmの鉄心〜8,000のFe / NP）と室温で1時間、混合物を振る。
- PBS緩衝液で溶出したNAP-10カラムを用いたゲル濾過によって過剰の試薬を除去する。 NP-TCOの生成物を含む色のバンドを収集します。
- 遠心フィルター装置（100 K MWCO）を使用して〜150μlの最終容量をろ液を濃縮する。
- （無水物末端カルボン酸を形成するために、残りのアミンと反応し、これはデキストラン表面に非特異的な相互作用を防止する）、NP-TCO溶液（DMSO中0.1M）、無水コハク酸を50μlを加え、室温で1時間振とうする。
- PBSで溶出NAP-10カラムを用いてNP-TCO生成物を精製する。使用前に4℃でのNP-TCOの溶液を保管してください。
2。表面処理
すべての表面プラズモン共鳴アッセイにおいてバイアコアT100計器（GE Healthcare）で実行される25°C、特に断りのない限り、ランニングバッファーとしてCM5センサーチップおよびPBS-Pを使用して。ビアコア制御および測定器に供給される評価ソフトウェアは、実験を設定し、データを分析するために使用される。二つの動作モード、アプリケーションウィザードと手動運転を表面処理し、監視、オンチップキャプチャ環のために使用されます。方法ビルダーモードは逆方向結合実験のセットアップおよび環化反応速度を測定するために使用される。データは、二重参照を差し引いおよび動力学分析は、1:1ラングミュア結合モデルを使用して実行されている。
- フローセル上のアミン固定化ウィザードテンプレートを選択し、固定化1（参考）と2（検出）を使用します。 0.4 M EDCの1:1溶液を注入することにより、表面カルボキシル基を活性化アミンメソッドを修正する：480秒、0.1 M NHSを10μL/分の流速で。で420秒の接触時間に残りの活性化エステルをクエンチエタノールアミンの注入を設定するを10μl/分の流速。
- 入力リガンド名、抗GST（酢酸緩衝液、pH5.0中の18μgの個/ ml）し、10μl/分の流速で420秒の接触時間のために注入するように設定。
- コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら2試薬ラックに必要なソリューションバイアルを置きます。保存して、固定化を開始します。
注：〜14,000〜17,000 RUの範囲内の抗GST固定化レベルのこのよう結果に固定化ウィザードの実行。 - のみ参照フローセル1を介して5μL/分で420秒間（20μg/ ml）をソリューションを、GSTリガンドを注入するために固定化ウィザードを編集します。
3。官能基化分子のオンチップキャプチャ環を監視
- オンチップリアルタイムでキャプチャ-環（ 図2）の監視。
- GST-TCO（20μg/ ml）を、TZ-BnNH 2（10μM）と再生（10 mMグリシン、pH値= 2.0）試薬ラック2内の溶液バイアルを置きます。男を選択UALの実行方法は、5μlの/分に流量を設定し、セル2フローのパスを流れる。
- 420秒間、GST-TCOの溶液を注入する。
- 600秒間TZ-BnNH 2の溶液を注入する。
- 再生溶液の2 30秒の注射で表面を再生。
- リアルタイム（ 図3）の多成分構造のオンチップ·アセンブリを監視する。
- 場所GST-Tzを（20μg/ ml）を、NP-TCO（100μgの鉄/ ml）を、TZ-BnNH 2（10μM）および再生（10mMグリシン液、pH = 2.0）溶液バイアル試薬ラック2。測定器の取扱説明書の実行方法を選択し、セル2のフローに5μL/分の流路に流量を設定。
- 60秒間、GST-TZの溶液を注入する。
- 60秒間のNP-TCOの溶液を注入する。
- 60秒間TZ-BnNH 2の溶液を注入する。
- 再生溶液の2 30秒の注射で表面を再生。
4。 M環化率の固定化密度と決意をonitoring
- 小分子の付加環化反応速度の特徴付け（ 図4）。
- 新しい手法や入力一般的なパラメータを選択します。アッセイ工程パネルで新たな一歩と名前のサンプルを作成します。目的を設定し、サンプルするために基本設定を接続します。
- サイクルタイプパネルで新しいサイクルステップを作成し、次のコマンドを挿入して、キャプチャ、サンプル、再生1及び再生2。
- captureコマンドを選択すると、入力リガンド名（GST-TCO、20μg/ ml）を、5〜10μL/分と設定された流路での接触時間120秒：秒。サンプルコマンドを選択し、入力180秒の接触時間、60秒の解離時間、30μL/分の流速とに設定された流路：両方。再生1コマンドを選択し、入力された再生溶液名（10 mMのグリシン-HCl pHは2.0）、30μL/分に設定された流路で30秒の接触時間：セカンド。再生2コマンドのために同じことを繰り返します。</李>
- 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。次の選択し、検体溶液（TZ-BnNH 2）および一連の濃度（0.3〜μM、1:2希釈）でサンプルリストを埋める。ポジションパネルをラックに横に選択します。 96ウェルプレート内の試薬ラック2と希釈系列に置き液バイアルは、コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。データバインディングおよび動力学的分析は、 図4に示されている。
- NP付加環化反応速度の特徴付け（ 図4）。
- 上から保存されたメソッドのテンプレートを開き、次のパラメータを変更してください。キャプチャパネルを選択します。GST-TZ、20μg/ mlのへの変更リガンド名。サンプルパネルを選択し、120秒〜120秒の接触時間および解離時間への変更の接触時間を。
- サンプルリストを選択します。NP-TCOに変更検体および濃度シリーズ（7から224 nMで、1:2希釈）。試薬ラックに固定液バイアル2およびコンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら、96ウェルプレート内の希釈系列。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。データバインディングおよび動力学的分析は、 図4に示されている。
5。固定化されたAP1497へのFKBP12の結合を測定する
逆向きの結合研究は、固定化リガンドとして検体および化合物のAP1497（ 図5）のようなFKBP12を採用している。次のようにこのアッセイのための一般的な方法は、メソッドBuilderツールを使用して設定されます。
- 新しい手法や入力一般的なパラメータを選択します。アッセイ工程パネルで作成し、名前キャプチャ、サンプルおよび再生の手順。対応する目的を選択して、基本設定を接続します。
- サイクルタイプのパネルを選択し、3サイクル工程作成：キャプチャ、サンプルおよび再生を。
- キャプチャサイクルのステップの下二回captureコマンドを挿入します。ヴァリアブルとしてキャプチャ1のパネルを選択し、キャプチャソリューションを選択第二：電子、5μlの/分に設定した流路の流量で300秒の接触時間を設定する。第二：5〜10μL/分と設定された流路の流量で250秒の接触時間を設定する変数としてキャプチャ2のパネルを選択捕捉溶液を選択する。
- サンプルサイクルステップ下でのサンプルコマンドを挿入します。サンプルパネルを選択し、30μL/分に設定された流路の流速で200秒〜60秒とし、接触時間を、解離時間：両方。
- 再生サイクルのステップの下二回生指令を挿入します。再生1パネルを選択し、入力された再生溶液名（10 mMのグリシン-HCl pHは2.0）、30μL/分に設定された流路で30秒の接触時間：セカンド。再生2パネルのために同じことを繰り返します。
- 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。次の入力キャプチャソリューション名（GST-TCOおよびAP1497-TZ）、サンプル名（FKBP12）、一連の濃度（0.020から5μg/ mlの1:2希釈）とMW（13000）を選択します。 R溶液バイアルを置きますコンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら96ウェルプレートに2および希釈シリーズラックeagent。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。動力学的分析データを図5に示す。
6。固定化のNPに添付AP1497にFKBP12の結合を測定する
ナノ粒子固定化、低分子誘導体化およびFKBP12結合アッセイのための一般的な方法は、セットアップされている方法Builderツールを使用して次のように
- 上から保存されたメソッドのテンプレートを開き、変更します。キャプチャサイクルステップの下に追加のcaptureコマンドを挿入します。キャプチャ1のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション1（GST-TZ）としてキャプチャソリューションの選択を解除します。 5μl/分の流速および第二のセットの流路で60秒に設定された接触時間。キャプチャ2のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション2（NP-TCO）などのキャプチャソリューションの選択を解除します。設定された接触時間を5μl/分の流速で90秒、及び第二のセットの流路。キャプチャ3のパネルを選択します。変数と名前のキャプチャソリューション3（AP1497-TZ）としてキャプチャソリューションの選択を解除します。 5μl/分の流速および第二のセットの流路180秒に設定された接触時間。
- 2-1：に設定して実行し、設定された流路を選択します。二度横に選択します。 96ウェルプレート内の試薬ラック2と希釈系列に置き液バイアルは、コンテンツリストとの位置を合わせるように注意しながら。メソッドテンプレートを保存し、結合アッセイを開始します。動力学的分析データを図5に示す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
データおよび図は、参照8から適応されている。
向きや密度の制御付きの生理活性小分子の効率的な可逆的な固定化は、新しいバイオセンサーのアプリケーションの開発に重要な役割を果たしている。 TCOとTzの間の高速バイオ直交反応を用いて、我々は、生物学的活性を保持したリガンド面の段階的な組み立ておよび再生のための方法を記載している。 図2は、-TzをBnNH 2の固定化のリアルタイムモニタリングを示す。 GST-TCOの溶液応答して〜400 RUの上昇をもたらすプレ固定された抗GST表面上に注入される。 TZ-BnNH 2回目の注射は、応答の高速〜15 RUの上昇を示しています。誘導体化された抗原のいかなる解離は、構造安定性のための証拠を提供するランニングバッファーに切り替えた後に観察されない。表面は、複数のキャプチャ·環サイクルを可能にするために、サイクルの最後のステップで再生されている。私達この手順をINGとAP1497-TZ分子とTZ-BnNH 2部分を交換すると、そのターゲットFKBP12（ 図5）との相互作用の研究のために使用した生物活性表面を生成します。抗体/抗原相互作用の破壊は、（ 図2に示すように）新しい分子集合体を構築することができるように、抗GST表面を再生する。この場合には、GST-Tzを注入（〜800 RUの捕捉）を効率的にセンサ表面（ 図3）ナノ粒子を固定化する、NP-TCO（環〜600 RU）の注射によって行われる。 NP上の未反応のTCOグループは、注入されたTZ-BnNH 2（〜22 RU）との付加環化のために用意されています。あるいはまた、AP1497-TZは、官能化ナノ粒子FKBP12相互作用（ 図5）を監視するために使用されている。多成分構造の無解離（GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2）構造の安定性と生物活性（AP1497-Tz/FKBP12 bについての証拠を提供して観測されるinding）。
図4に示すように、リアルタイムの固定化（環状付加）反応監視及び表面再生のための機能により、会合速度k a を （環化率）の直接的な特徴付けが行われる。反応速度の知識は、固定化密度（接触時間及び濃度）、バイオセンサーアッセイのための重要なパラメータを制御するためのガイドラインを提供します。 GST-TCOまたはGST-TZ表面上、二重にTZ-BnNH 2またはNP-TCOの濃度を増加注入、それぞれ、結合データ（赤線）を発生する。同一表面上の同じ濃度の2連続した分析対象サンプルのデータバインディングは、ほぼ重ね合わせることにより、キャプチャ環と再生の複数のサイクルに容量を結合する抗体の最小の損失を反映している。評価ソフトウェアはベストフィットの運動解析（黒い線を提供しています）Cについてycloaddition反応速度は、 図4に示されるk個 。
図1。 1,4 -ジヒドロ付加物を与えるためにバイオ直交誘導体化された分子の可逆的固定化のためのコンジュ戦略 トランスシクロオクテン間。A. [4 +2]付加環化反応（TCO）および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）部分。B.実験はTzを/ TCOの可逆的固定化のためのスキームは、分子をタグ付けされた。可逆ナノ粒子固定化および機能化のためのC.実験スキームを。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2。 。低分子固定化のリアルタイムモニタリング1）ベースライン：ランニングバッファー（Tの注入に続く抗GST抗体（T = 0から420秒）によって注入されたGST-TCOの前に固定化抗GST 2）キャプチャ、応答〜15 RUの上昇、Tは540-1,140秒=）。撮影したGST-TCOおよびテトラジン（TZ-BnNH 2間= 420から540秒）の相互作用の持続性を示す3）環化。無信号減衰。4）10 mMグリシン、pHが2.1（T = 1,820-2,000秒）の2短い注射で抗GST表面の再生バッファー（T = 1,140-1,820秒）を実行し、移動相の切り替えにもかかわらず、発生しません。
「FO：SRC = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg" />
図3。キャプチャされたGST-TZおよびNP-TCO（T = 135から195を注入されたとの間に注入、GST-TZ（T = 0〜60秒のナノ粒子固定化および機能化をリアルタイムで監視。1）ベースライン。2）キャプチャ）。3）付加環固定化されたNP-TCOとの間の信号（T = 195から300秒）無しの崩壊でランニング緩衝液の注入が続く秒）。4）付加環およびTZ-BnNH 2（応答〜22 RUの上昇、Tが300から360を=注射さ秒）。無信号の減衰は、多成分の安定性のための証拠を提供するバッファ（T = 360から480秒）を実行し、移動相の切り替えにもかかわらず、存在しない。
図4。 Bを示す代表的なセンサーグラムTzのTCOとの間の付加環化反応のためのindingデータ（赤線）と運動解析（黒線）が100％のFBSの存在下または非存在下で分子をタグ付け表アソシエーション（環化）速度定数を要約し、kは 。
図5。様々な構成での小分子/タンパク質相互作用のSPRの研究 （上）、FK506の合成誘導体：AP1497およびAP1497-TZ。表では、結合データから誘導された速度および平衡速度定数を示しています。タンパク質が固定化される結合実験（ すなわち 、従来のSPR実験）からのデータは比較のために含まれています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで説明するキャプチャ付加環化の方法は、ラベルフリーチップベースの相互作用および動力学的研究のための修飾ナノ粒子および小分子を迅速に、可逆的な固定化を可能にします。固定化プロトコルは、<小分子リガンドの10μMの濃度を必要数分で行うことができる。リガンド濃度と接触時間の固定化密度を調節することにより厳密に制御することができる。我々のデータは、オンチップバイオ直交反応がそれらの標的と相互作用するその場での官能化ナノ粒子又は固定化された小分子の能力を維持することを示している。また、低分子量の2小分子、（TCOとTzの）間の二分子付加環化率を特徴としている。我々は、類似のアッセイは、他の高速なバイオ直交反応の速度を測定し、比較するために行うことができることを想定する。
可逆、連続した流れのオンチップナノ粒子の固定化とその場で官能化PRovidesすべての精製、固定化およびスクリーニングのための別の手順が必要です従来のナノ粒子の合成と比較すると、同様の実験。13〜15でのスクリーニングとの相互作用解析のための修飾ナノ粒子の様々への迅速なアクセス、我々の方法が大幅に生体材料の入力量、溶剤を減少させおよび試薬は、同時にナノ粒子の使用および処分を扱う環境問題を減少させながら16は、重要なことに、ナノ粒子の官能化反応は、典型的には、細胞培養実験に使用される血清濃度の存在に対してロバストであり、さらに非常に高い血清濃度である。この特徴は（ナノ粒子のタンパク質コロナ及び表面特性に影響を与えることができる）血清の存在下でのナノ粒子の設計のための構造活性相関を容易にすることができる。17,18
タンパク質 - 低分子相互作用が研究されているほとんどのSPRアッセイでは、タンパク質（リガンド）があるアフィニティータグ（GST、ビオチンなど ）を介して、または共有結合、アミド結合を介して固定化された。検体は、次いで屈折率変化として検出される表面の質量の変化、結果における結合リガンド上を通過させる。正規のSPRの向きを逆にし、便利で可逆的に低分子を固定化することは、可溶性の高分子ターゲットの直接結合を研究するための容易なアクセスを提供し、成果物（可溶性対固定化）期特異的を明確にしています。このタイプの19,20のアッセイ形式は、特に抑制や競争的研究のための貴重な。向きの21反転はまた、いくつかの状況下で有利で あることができる、 すなわち A）結合シグナルが質量変化B）の集約と疎水性の検体22の非特異性を表面に比例することを考慮すると、低分子量の分析物とデータ解析の高親和性結合の直接的c）の特徴付けを行うことができ解消されるによる長い滞留時間（共有結合阻害剤を扱う場合は特に、オフ速度が遅くなる）23と、次の分析サイクルd）再生剤は、構造または機能に分解作用を有し得るための準備における表面再生条件の必要性に挑戦することタンパク質を固定化した。
我々の固定化戦略の一部としてバイオ直交捕獲 - 環化法を組み込むことによって、我々は、従来の小分子固定化技術に関連する困難のいくつかを回避する。静観光名所、タンパク質固定化プロトコルのための典型的なプリ濃度の表面導くので、これらのリガンドは、はるかに高い濃度を必要と小分子と効果がない。したがって、リガンドの濃度を増加させ、リガンドの溶解のための有機共溶媒の比率を高めることにつながる。これらの条件の両方がマイクロ流体フローシステムと適合性ではない結果として、従来のiをmmobilizationsは、リアルタイム監視が不可能な器具外で実行されなければならない。24最後に、成功した従来の固定化の際に、共有表面改質は、表面の再生を防止し、即座に投資の増加をもたらすバイオセンサ表面の実験の範囲を制限する努力とコスト。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、NIHから（NHLBI契約番号HHSN268201000044C RW、SHおよびSYSに）資金を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 | |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , Edition AB, (2005).
