Summary
אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.
Abstract
שיטות לקיבוע משטח מהיר של מולקולות קטנות ביו עם שליטה על התמצאות וצפיפות חוסר תנועה הן רצויות מאוד עבור יישומי biosensor וmicroarray. במחקר זה, אנו משתמשים bioorthogonal יעיל ביותר קוולנטיים [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine (טז) על מנת לאפשר קיבוע microfluidic של מולקולות derivatized-TZ TCO / . אנו מנטרים את התהליך בזמן אמת בתנאי זרימה רציפים באמצעות התהודה plasmon פני השטח (SPR). כדי לאפשר קיבוע הפיך ולהרחיב את טווח הניסוי של פני השטח החיישן, אנו משלבים רכיב ללכוד אנטיגן נוגדן שאינו קוולנטיים עם תגובת cycloaddition. על ידי לסירוגין הצגת moieties TCO או Tz למשטח החיישן, תהליכי הלכידה-cycloaddition מרובים הם עכשיו אפשריים על משטח חיישן אחד ללימודי הרכבה ואינטראקציה על השבב של מגוון רחב של מבנים מרובים רכיבים. אנו illustrate שיטה זו עם שני ניסויים שונים קיבוע על שבב biosensor; מולקולה קטנה, AP1497 שנקשר חלבון קושר FK506 12 (FKBP12); ואותה מולקולה קטנה, כחלק מnanoparticle פונקציונליות אתרו משותק וב.
Introduction
תגובות נטיה יעילה הן כלים רבי ערך לחיבור מולקולות ביו למשטחים עבור מגוון רחב של יישומים בתחום הביוטכנולוגיה. לאחרונה, bioorthogonal מהר מאוד [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine (טז) כבר משמשים תווית משטחי תאים, מבני subcellular, נוגדנים וחלקיקים 1. - 7 כאן, אנו משתמשים תגובת cycloaddition [4 +2] בשילוב עם לכידת אנטיגן / נוגדן (GST / אנטי GST) להפיכה סינתזה של מבנים רב רכיב למשטח Plasmon תהודה (SPR) ניתוח אינטראקציה על השבב ולעקוב אחר תהליך בזמן אמת (איור 1). 8,9 יש לציין, האסטרטגיה ללכוד חיי בן אשר מאפשרת התחדשות פני השטח באמצעות פרוטוקול מבוסס. 8 כתוצאה מכך, הרכבה של משטחי חיישן יציבים עם שליטה על נטייה ליגנד וצפיפות עבור מגוון רחב של assay החדש פורמטים אפשרי עכשיו. באמצעותאסטרטגיה זו אנו מדגימים את חוסר התנועה של מולקולות קטנות derivatized-TZ TCO / ומאפיינים את חיי בן אשר שיעורים במגוון רחב של תנאי חיץ. אנחנו בחרנו באינטראקציה הידועה בין FKBP12 וAP1497 מולקולה נקשרת FKBP12 10-12 לדוגמא ירושלים כדי לוודא שהאסטרטגיה ללכוד cycloaddition משמרת את יכולתה של המולקולה הקטנה לאינטראקציה עם היעד שלה, כאשר גם מחובר ישירות לאנטיגנים GST משותקים או לחלקיקים משותקים (NPS).
שיטה זו מציעה מספר יתרונות. ראשית, חוסר התנועה הפיכה של מולקולות קטנות על שבבי חיישן אפשרי עכשיו. שנית, חוסר תנועת TCO / Tz של מולקולות קטנות גם מאפשר מחקרי אינטראקציה ללא תווית שלהפוך את הכיוון של מחקרי SPR הקנונית, ועשויה לספק תצוגה משלימה של אינטראקציה מחייבת. שלישית, שיטה זו מאפשרת את סינתזת microfluidic של חלקיקים ממוקדים, והערכה מיידית של bindinמאפיינים גרם. זה מבטיח לשפר את היעילות של הערכה או הקרנת חלקיקים ממוקדים, וגם להקטין את הכמויות של חלקיקים הנדרשים. 13-15 הרביעית, גישה זו יכולה למדוד קינטיקה התגובה של תגובות cycloaddition bioorthogonal בזמן אמת תחת זרימה רציפה. לבסוף, הכימיה קיבוע TCO / TZ היא חזקה בנוכחותו של סרום. יחדיו, אנו צופים כי גישה תכליתית זו תהיה רחבה להקל על הבנייה של משטחי חיישן יציבים למגוון רחב של מחקרי microfluidic עם שייכות במבחנה וביישומים סלולריים vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת GST וNanoparticle (NP) Conjugates
- הכנת GST-TCO:
- הוסף 8 μl של פתרון TCO-NHS (50 מ"מ DMSO) לשל GST (1 מ"ג / מיליליטר PBS) 100 μl ולנער את התערובת על RT במשך שעה 1.
- הסר מגיב עודף באמצעות טור desalting הספין זב. התסנין התאושש מכיל את הצמוד GST-TCO מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- הכנת GST-TZ:
- הוסף 6 μl של פתרון TZ-NHS (25 מ"מ בDMF) ל75 μl של GST (1 מ"ג / מיליליטר PBS) ולנער את התערובת על RT במשך שעה 1.
- לדלל את תערובת התגובה עם 25 μl של PBS ולטהר באמצעות טור desalting ספין. התסנין המכיל את הצמוד GST-TZ מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- הכנת NP-TCO:
- הוספה של פתרון TCO-NHS 100 μl (50 מ"מ DMSO) כדי150 μl של nanoparticle aminated (NP-NH 2, 8.7 מ"ג פה / מיליליטר PBS, ליבת ברזל 3 ננומטר ~ 8,000 פה / NP) ולנער את התערובת על RT במשך שעה 1.
- הסר מגיב עודף על ידי סינון ג'ל באמצעות טור NAP-10 eluted עם חיץ PBS. לאסוף את הלהקה בצבע המכילה את מוצר NP-TCO.
- לרכז את התסנין לנפח סופי של μl ~ 150 באמצעות מכשיר צנטריפוגלי מסנן (100 k MWCO).
- הוסף 50 μl של אנהידריד succinic, (M 0.1 DMSO) לפתרון NP-TCO ולנער ב RT עבור שעה 1 (אנהידריד מגיב עם כל אמינים שנותרו כדי ליצור חומצות קרבוקסיליות מסוף. זה מונע אינטראקציות ספציפיות עם משטח dextran).
- לטהר את המוצר ה-NP-TCO באמצעות טור NAP-10 משחררי עם PBS. אחסן את הפתרון של NP-TCO על 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
2. הכנת שטח
כל מבחני התהודה plasmon המשטח מבוצעים על מכשיר Biacore T100 (GE Healthcare) בשעה25 מעלות צלזיוס באמצעות שבב חיישן CM5 וPBS-P כחיץ פועל אלא אם צוינה אחרת. Biacore בקרה ותוכנת הערכה מסופקת עם המכשיר מועסקות להגדרת ניסויים וניתוח נתונים. שני מצבי פעולה, אשפי יישום ומדריך לריצה ישמשו להכנת שטח וניטור ללכוד חיי בן אשר על השבב. מצב הבונה השיטה ישמש להגדרת ניסויים המחייבים נטייה הפוכה ולמדידת שיעורי תגובת cycloaddition. הנתונים הם התייחסות כפולה מופחתים וניתוחים הקינטית מבוצעים תוך שימוש במודל מחייב אנגמיור 1:1.
- השתמש בתבנית הקיבוע האמין האשף וקיבוע בחר בתאי זרימת 1 (הפניה) ו -2 (זיהוי). שינוי שיטה אמין להפעלת קבוצות קרבוקסיליות פני השטח על ידי הזרקה של פתרון 1:1 של 0.4 M EDC: 0.1 M NHS ל480 שניות בקצב זרימה של 10 μl / min. הגדר את ההזרקה של ethanolamine כדי להרוות אסטרים פעילים שנותרו לזמן מגע 420 שניות בקצב זרימה של 10 μl / min.
- שם קלט יגנד, אנטי GST (/ מיליליטר 18 מיקרוגרם במאגר אצטט, pH 5.0) ולהגדיר להזריק לזמן מגע של 420 שניות בקצב זרימה של 10 μl / min.
- הנח בקבוקוני פתרון נדרשים במגיבים מתלה 2 והקפד להתאים את העמדות עם רשימת התוכן. שמור ולהתחיל קיבוע.
שים לב: הפעלת אשף הקיבוע באופן זה תוצאות ברמות חוסר תנועה אנטי GST בטווח של ~ 14,000 ל17,000 RU. - ערוך את אשף הקיבוע להזריק רק יגנד GST פתרון (20 מיקרוגרם / מיליליטר) ל420 שניות ב 5 μl / min מעל תא זרימת התייחסות 1.
3. ניטור לכידת-חיי בן אשר על השבב של מולקולות פונקציונליות
- ניטור על השבב ללכוד חיי בן אשר בזמן אמת (איור 2).
- הנח GST-TCO (20 מיקרוגרם / מיליליטר), TZ-BnNH 2 (10 מיקרומטר) והתחדשות (גליצין 10 מ"מ, pH = 2.0) בקבוקוני פתרון במגיבים מדף 2. בחר את האיששיטה להפעיל רע"מ, קבעה את קצב הזרימה עד 5 μl / min ונתיב זרימה לתא זרימת 2.
- הזרק פתרון של GST-TCO ל420 שניות.
- הזרק פתרון של TZ-BnNH 2 ל600 שניות.
- להתחדש המשטח עם שתי זריקות 30 שניות של פתרון התחדשות.
- ניטור הרכבה של מבנים רב רכיב בזמן אמת (איור 3) על שבב:
- הנח GST-TZ (20 מיקרוגרם / מיליליטר), NP-TCO (100 פה / מיליליטר מיקרוגרם), TZ-BnNH 2 (10 מיקרומטר) והתחדשות (גליצין 10 מ"מ, pH = 2.0) בקבוקוני פתרון במגיבים מדף 2. בחר את שיטת ריצת מדריך למכשיר, קבע את קצב הזרימה עד 5 μl / min ונתיב הזרימה לתא זרימת 2.
- הזרק פתרון של GST-TZ ל60 שניות.
- הזרק פתרון של NP-TCO ל60 שניות.
- הזרק פתרון של TZ-BnNH 2 ל60 שניות.
- להתחדש המשטח עם שתי זריקות 30 שניות של פתרון התחדשות.
4. Monitoring צפיפות קיבוע וקביעת cycloaddition המחירים
- אפיון של שיעורים קטנים מולקולת תגובת cycloaddition (איור 4).
- בחר פרמטרים כלליים שיטה וקלט חדשים. בפנל צעדי assay ליצור מדגם זה צעד ושם חדש. הגדר את המטרה וחבר הגדרות בסיס למדגם.
- בפנל סוגי מחזור יצירת צעד מחזור חדש והכנס את הפקודות הבאות: צלם, לדוגמא, התחדשות 1 והתחדשות 2.
- בחר בפקודה לכידת; שם יגנד הקלט (GST-TCO, 20 מיקרוגרם / מיליליטר), זמן מגע 120 שניות ב 5 μl / min ונתיב זרימה מוגדר: שני. בחר בפקודה לדוגמא: קלט 180 זמן מגע שניות, זמן ניתוק 60 שניות, קצב זרימת 30 μl / min ולהגדיר נתיב זרימה ל: גם וגם. בחר בפקודה התחדשות 1; שם פתרון התחדשות קלט (10 מ"מ גליצין-HCl pH 2.0), זמן מגע של 30 שניות ב30 μl / min ולהגדיר נתיב זרימה ל: שני. חזור על אותו להתחדשות 2 הפקודה. </ Li>
- הפעל בחר התקנה ולהגדיר נתיב זרימה ל: 2-1. בחר הבא ולמלא את רשימת דוגמאות עם פתרון אנליטי (TZ-BnNH 2) וסדרת ריכוז (.3-10 מיקרומטר, 1:2 דילול). בחר הבא כדי לצבור פנל עמדה. בקבוקוני פתרון מקום במגיבים סדרת דילול מדף 2 ובצלחת 96 היטב והקפד להתאים את העמדות עם רשימת התוכן. לשמור את התבנית של שיטה ולהתחיל assay מחייב. איגוד נתונים וניתוח הקינטית מוצגים באיור 4.
- אפיון של שיעורי NP תגובת cycloaddition (איור 4).
- פתח את תבנית השיטה הצילה מלמעלה ולשנות את הפרמטרים הבאים. בחר הפנל לכידת; שם יגנד שינוי לGST-TZ, 20 מיקרוגרם / מיליליטר. בחר פנל לדוגמא; זמן מגע שינוי לעת קשר 120 שניות וזמן ניתוק 120 שניות.
- בחר את רשימת המדגם; לשנות אנליטי לNP-TCO וסדרות ריכוז (7-224 ננומטר, דילול 1:2). בקבוקוני פתרון מקום במדף מגיב2 וסדרה בצלחת 96 היטב דילול והקפד להתאים את העמדות עם רשימת התוכן. לשמור את התבנית של שיטה ולהתחיל assay מחייב. איגוד נתונים וניתוח הקינטית מוצגים באיור 4.
5. מדידת עקידת FKBP12 לAP1497 ללא יכולת לזוז
מחקרים המחייבים התהפכה אוריינטציה להעסיק FKBP12 כאנליטי וAP1497 המתחם כיגנד המשותק (איור 5). השיטה הכללית לassay זה מוגדר באופן הבא משתמש בכלי הבונה שיטה:
- בחר פרמטרים כלליים שיטה וקלט חדשים. בפנל צעדי assay ליצור וצעדים שם לכידת, לדוגמא והתחדשות. בחר מטרה מקבילה וחיבור הגדרות בסיס.
- בחר פנל סוגי מחזור וליצור 3 שלבי מחזור: צלם, לדוגמא והתחדשות.
- הכנס את פקודת לכידת פעמיים בשלב מחזור לכידת. בחר פנל לכידת 1 ופתרון הלכידה בחר כvariablדואר, לקבוע זמן קשר ל300 שניות בקצב זרימה של 5 μl / min ונתיב זרימה מוגדר: שני. בחר פנל לכידת 2 ופתרון הלכידה בחר כמשתנה, לקבוע זמן קשר ל250 שניות בקצב זרימה של 5 μl / min ונתיב זרימה מוגדרת: שני.
- הכנס את הפקודה לדוגמא בשלב מחזור לדוגמא. בחר הפנל לדוגמא; סט קשר זמן 60 שניות, זמן ניתוק ל200 שניות בקצב זרימה של 30 μl / min ולהגדיר נתיב זרימה ל: גם וגם.
- הכנס את פקודת ההתחדשות פעמיים מתחת לצעד מחזור ההתחדשות. בחר פנל התחדשות 1; שם פתרון התחדשות קלט (10 מ"מ גליצין-HCl pH 2.0), זמן מגע של 30 שניות ב30 μl / min ולהגדיר נתיב זרימה ל: שני. חזור על אותו לפנל התחדשות 2.
- הפעל בחר התקנה ולהגדיר נתיב זרימה ל: 2-1. בחר פתרון הלכידה שמות הבאים וקלט (GST-TCO וAP1497-TZ), שם מדגם (FKBP12), סדרת ריכוז (0.020-5 מיקרוגרם / מיליליטר, 1:2 דילול) וMW (13,000). בקבוקוני פתרון המקום בreagent סדרת דילול מדף 2 ובצלחת 96 היטב והקפד להתאים את העמדות עם רשימת התוכן. לשמור את התבנית של שיטה ולהתחיל assay מחייב. נתונים ניתוח קינטי מוצגים באיור 5.
6. מדידת עקידת FKBP12 לAP1497 המצורפת למשותקים צירופים שמנים מיודע
השיטה הכללית לקיבוע nanoparticle, derivatization מולקולה הקטן וassay מחייב FKBP12 היא ההגדרה כדלקמן שימוש בכלי הבונה שיטה:
- פתח את תבנית השיטה הצילה מלמעלה ולשנות. הכנס פקודת לכידת נוספת תחת צעד מחזור לכידת. בחר פנל 1 לכידת; לבטל את הבחירה בפתרון הלכידה כמשתנה ושם פתרון הלכידה 1 (GST-TZ). הגדר קשר זמן 60 שניות בקצב זרימה של 5 μl / min ולהגדיר נתיב זרימה לשני. בחר פנל 2 לכידה; לבטל את הבחירה בפתרון הלכידה כמשתנה ושם פתרון הלכידה 2 (NP-TCO). זמן מגע הגדר 90 שניות בקצב זרימה של 5 μl / min ונתיב זרימה להגדיר שני. בחר את לכידת הפנל 3; לבטל את הבחירה בפתרון לכידת כפתרון משתנה ושם לכידה 3 (AP1497-TZ). קשר קבוצת זמן 180 שניות בקצב זרימה של 5 μl / min ולהגדיר נתיב זרימה לשני.
- הפעל בחר התקנה ולהגדיר נתיב זרימה ל: 2-1. בחר הבא פעמיים. בקבוקוני פתרון מקום במגיבים סדרת דילול מדף 2 ובצלחת 96 היטב והקפד להתאים את העמדות עם רשימת התוכן. לשמור את התבנית של שיטה ולהתחיל assay מחייב. נתונים ניתוח קינטי מוצגים באיור 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים ודמויות הותאמו מהתייחסות 8.
חוסר תנועה הפיכה יעילה של מולקולות קטנות, ביו עם שליטה על התמצאות וצפיפות ממלאת תפקיד מרכזי בפיתוח של יישומי biosensor חדשים. באמצעות תגובת bioorthogonal מהירה בין TCO וTz, אנו מתארים שיטה להרכבה בשלבים וההתחדשות של משטחי יגנד עם שמירה של פעילות ביולוגית. איור 2 מראה ניטור של TZ-BnNH קיבוע 2 בזמן אמת. פתרון של GST-TCO מוזרק על משטח אנטי GST משותק מראש וכתוצאה מכך ~ 400 עליית RU בתגובה. זריקה שנייה עם TZ-BnNH 2 מראה ~ 15 עליית RU מהירה בתגובה. אין ניתוק של אנטיגן derivatized הוא ציין לאחר המעבר להפעלת מאגר מתן עדות ליציבות מבנה. פני השטח נוצר מחדש בשלב האחרון של המחזור כדי לאפשר מחזורים ללכוד cycloaddition מרובים. לנוing הליך זה ולהחליף את מחצית TZ-BnNH 2 עם מולקולת AP1497-TZ יוצר משטח ביו המשמש למחקרי אינטראקציה עם FKBP12 היעד שלו (איור 5). שיבוש של האינטראקציה הנוגדן / אנטיגן (כפי שמוצג באיור 2) מחדש את פני השטח אנטי GST, המאפשר הרכבה מולקולרית חדשה שתיבנה. במקרה זה, הזרקת GST-TZ (לכידתו של ~ 800 RU) ואחריו עם הזרקה של NP-TCO (cycloaddition ~ 600 RU), למעשה לשתק nanoparticle אל פני השטח החיישן (איור 3). קבוצות unreacted TCO על NP זמינות לחיי בן אשר מוזרקים עם TZ-BnNH 2 (~ 22 RU). לחלופין, AP1497-TZ משמש כדי לפקח על אינטראקציות nanoparticle-FKBP12 פונקציונליות (איור 5). אין ניתוק של המבנים מרובים רכיבים (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) הם נצפו במתן העדות ליציבות מבנה ופעילות ביולוגי (AP1497-Tz/FKBP12 בinding).
עם יכולות לחוסר תנועה בזמן אמת ניטור תגובה (חיי בן אשר) והתחדשות פני השטח, האפיון הפשוט של שיעור עמותת k (שיעור חיי בן אשר) מושגת כפי שמוצג באיור 4. ידע של קינטיקה התגובה מספק הנחיות לבקרת צפיפות קיבוע (זמן מגע וריכוז), פרמטר חשוב עבור מבחני biosensor. הזרקת הגדלת ריכוזים של TZ-BnNH 2 או NP-TCO בשני עותקים על משטחי GST-TCO או GST-TZ, בהתאמה, מייצר הנתונים המחייבים (קווים אדומים). הנתונים המחייבים עבור שתי דגימות אנליטי רציפים של הריכוז זהה על אותו המשטח שכמעט superimposable משקפים הפסד מינימאלי של נוגדן מחייב קיבולת בשל מחזורים רבים של הלכידה-cycloaddition והתחדשות. תוכנת ההערכה מספקת ניתוחים הקינטית מיטבית (קווים שחורים ) לגשיעורי תגובת ycloaddition k מוצגים באיור 4.
איור 1. אסטרטגית נטיית Bioorthogonal לקיבוע הפיך של מולקולות derivatized. א [4 +2] תגובת cycloaddition בין טרנס cyclooctene (TCO) ו1,2,4,5-tetrazine moieties (טז) לתת adduct 1,4-dihydropyridazine . תכנית הניסויית ב 'לקיבוע הפיך של צ / TCO מתויגת מולקולות. ערכה הניסויית ג לקיבוע nanoparticle הפיך וfunctionalization. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. ניטור של חוסר תנועת מולקולה קטנה בזמן אמת) Baseline 1:.. משותק מראש אנטי GST 2) לכידת של הזריק GST-TCO על ידי נוגדן אנטי GST (t = 0-420 שניות), ואחריו על ידי הזרקה של חיץ ריצה (t Cycloaddition = 420-540 שניות) מראה התמדה של אינטראקציה 3) בין שנתפס GST-TCO וtetrazine (TZ-BnNH 2;. ~ 15 עליית RU בתגובה; t = 540-1,140 שניות). אין דעיכת אות מתרחשת למרות מיתוג השלב הנייד להפעלת מאגר (t = 1,140-1,820 שניות). התחדשות של פני השטח אנטי-GST עם 2 זריקות קצרות של 10 גליצין מ"מ, pH 2.1 (t = 1,820-2,000 שניות) 4).
"עבור: src =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
איור 3. ) Baseline ניטור של חוסר תנועת nanoparticle וfunctionalization בזמן אמת. 1. 2) לכידת של GST-TZ (t = 0-60 שניות מוזרקות). 3) cycloaddition בין נתפס GST-TZ והזריק NP-TCO (t = 135-195 שניות), ואחריו על ידי הזרקה של הפעלת מאגר, ללא ריקבון באות (t = 195-300 שניות). 4) cycloaddition בין משותק NP-TCO והזריק TZ-BnNH 2 (~ 22 עליית RU בתגובה, t = 300-360 שניות). אין דעיכת אות למרות מיתוג השלב הנייד להפעלת מאגר (t = 360-480 שניות) מתן עדות ליציבות מרובה רכיבים.
איור 4. sensorgrams נציג מראה בנתוני inding (קווים אדומים) וניתוחים הקינטית (קווים שחורים) לתגובת cycloaddition בין Tz וTCO מתויגים מולקולות בנוכחותו או היעדריו של FBS 100%. טבלה מסכמת קבועי שיעור עמותה (חיי בן אשר), k.
איור 5. מחקרי SPR של אינטראקציות קטנות מולקולה / חלבון בתצורות שונות (למעלה) נגזרים סינטטי של FK506:. AP1497 וAP1497-TZ. הטבלה מציגה הקינטית וקבועים שיעור שיווי משקל נגזר מהנתונים המחייבים. נתונים מניסויים מחייבים שבו החלבון הוא משותק (כלומר ניסויי SPR מסורתיים) נכללים לצורך ההשוואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת הלכידה-cycloaddition המתואר כאן מאפשרת קיבוע מהיר, הפיך של חלקיקים שונה ומולקולות קטנות לאינטראקציה מבוססת שבב ללא תווית ומחקרים קינטית. פרוטוקול הקיבוע ניתן לבצע בדקות דורשות <10 מיקרומטר ריכוזים של ligands מולקולה קטנה. על ידי ויסות ריכוז ליגנד וצפיפויות קיבוע זמן מגע ניתן לשלוט באופן הדוק. הנתונים שלנו מראים כי תגובות bioorthogonal על השבב לשמר את היכולת של חלקיקים פונקציונליות באתר או מולקולות קטנות משותקים לאינטראקציה עם המטרות שלהם. יש לנו גם מאופיין שיעורי cycloaddition bimolecular בין שתי מולקולות קטנות, (TCO וצ) עם משקולות מולקולריות נמוכות. אנחנו מדמיינים שניתן לבצע מבחני דומים כדי למדוד ולהשוות את שיעורים של תגובות bioorthogonal מהירות אחרות.
, חוסר תנועה הפיכה זרימה רציפה על שבב nanoparticle ויחסי הציבור functionalization באתרovides גישה מהירה למגוון רחב של חלקיקים שונה לסינון וניתוח אינטראקציה כולם באותו הניסוי. 13-15 בהשוואה לסינתזת nanoparticle קונבנציונלי, אשר דורשת צעדים שונים לטיהור, חוסר תנועה והקרנה, השיטה שלנו מקטינה באופן משמעותי כמויות הזנה של חומרים ביולוגיים, חומרים ממסים וחומרים כימיים, ובמקביל להקטין במקביל חששות סביבתיים העוסקים בשימוש nanoparticle וסילוק. 16 חשוב לציין, תגובות functionalization nanoparticle הם חזקים לנוכחות של ריכוזים בסרום בדרך כלל משמשים לניסויי תרבית תאים, ואפילו לריכוזים בסרום גבוהים מאוד. תכונה זו יכולה להקל על יחסי פעילות המבנה, לעיצוב nanoparticle בנוכחות הסרום (אשר יכול להשפיע על מאפייני קורונה החלבון ופני שטח של nanoparticle). 17,18
ברוב מבחני SPR, שבו אינטראקציות מולקולת חלבון קטן נלמדות, החלבון (ליגנד) הואמשותק באמצעות תג זיקה (GST, ביוטין, וכו ') או דרך קשרים קוולנטיים אמיד. אנליטי לאחר מכן עבר על יגנד בי תוצאות מחייבות בוריאציות המוניות פני השטח, המתגלים כשינויי מקדם שבירים. היפוך כיוון SPR הקנונית ולשתק המולקולה הקטנה בצורה נוחה והפיך מספק גישה קלילה ללימודים מחייב ישיר של מטרות macromolecular מסיסים ומבהיר שלב ספציפי (משותק לעומת מסיס) צורכים. 19,20 פורמטי Assay מסוג זה הם בעיקר ערך ללימודי עיכוב ותחרות. 21 ביטול הנטייה גם יכול להיות יתרון תחת מספר תנאים, כלומר) עם analytes של משקל מולקולרי נמוך, בהתחשב בכך שהאות מחייבת היא פרופורציונלית למשטח צבירה) שינוי ההמוני ב ושאינו ספציפי של analytes הידרופובי 22 מסולק ביצוע אפיון ג הפשוט ניתוח נתונים) קלסרים זיקה גבוהים יכוללהיות מאתגר בשל זמנים ארוכים מגורים (להאט מחוץ לשערים, במיוחד כאשר התמודדות עם מעכבים קוולנטיים) 23 ואת הצורך בתנאי חידוש פני השטח כהכנה לניתוח ד המחזור הבא) עשויים להיות סוכני התחדשות תופעות משפילות במבנה או התפקוד של חלבון משותק.
על ידי שילוב של שיטת הלכידה-cycloaddition bioorthogonal כחלק מהאסטרטגיה של חוסר התנועה שלנו, לעקוף חלק מהקשיים הקשורים בטכניקות קיבוע מולקולה קטנה קונבנציונליות. אלה דורשים ריכוז ליגנד הרבה יותר גבוה מאז האטרקציות אלקטרוסטטי המובילות אל פני השטח לפני ריכוזים אופייניים לפרוטוקולי קיבוע חלבון אינן יעילות עם מולקולות קטנות. בהתאם לכך, הגדלת ריכוזים של ligands מובילה להגדלת יחסים של שיתוף ממס אורגני לפירוק ליגנד. שני התנאים הללו אינם תואמים למערכות זרימת מיקרו fluidic וכתוצאה מכך, אני קונבנציונליmmobilizations חייבת להתבצע מחוץ למכשיר שבו הניטור בזמן אמת לא ניתן. 24 לבסוף, במקרה של חוסר תנועה קונבנציונלית מוצלחת, שינוי פני השטח קוולנטיים מונע התחדשות פני השטח ומגביל את טווח הניסוי של משטחי biosensor וכתוצאה מכך גידול בהשקעות בזמן, מאמץ ועלויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מכירים במימון מ-NIH (NHLBI חוזה מס 'HHSN268201000044C לRW, SH וSYS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 | |
References
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
- Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
- Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
- Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
- Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
- Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
- Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
- MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
- Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
- Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
- Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
- Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
- Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
- Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
- Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
- Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
- Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
- Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
- Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
- Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
- GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , Edition AB, (2005).
