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Neuroscience

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l'état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Published: February 12, 2014 doi: 10.3791/50783
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 2, 3, 4
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Afin de préserver les processus neuronaux pour l'analyse ultrastructurale, nous décrivons un protocole pour le placage de neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivies par la congélation instantanée, ce qui donne des échantillons en suspension dans une couche de glace vitreuse. Ces échantillons peuvent être examinés avec un microscope cryo-électronique pour visualiser les structures à l'échelle nanométrique.

Abstract

Neurites, les dendrites et les axones, sont des processus cellulaires neuronales qui permettent la conduction des impulsions électriques entre les neurones. Définition de la structure des neurites est essentielle pour comprendre comment ces processus qui déplacent des matières et des signaux qui facilitent la communication synaptique. microscopie électronique (EM) a été traditionnellement utilisé pour évaluer les caractéristiques ultrastructurales dans neurites, mais l'exposition au solvant organique lors de la déshydratation et l'incorporation de résine peut fausser les structures. Un objectif important non satisfait est la formulation de procédures qui permettent des évaluations structurelles pas touchés par ces objets. Ici, nous avons établi un protocole détaillé et reproductible pour la croissance et entières neurites flash-gel des différents neurones primaires sur des grilles de microscopie électronique suivie de leur examen à la tomographie cryo-électronique (cryo-ET). Cette technique permet la visualisation en 3-D de neurites, hydratés-congelés à résolution nanométrique, facilitant assessment de leurs différences morphologiques. Notre protocole donne une vue sans précédent du ganglion de racine dorsale (DRG) neurites, et une visualisation des neurites de l'hippocampe dans leur état quasi-native. En tant que tel, ces méthodes créent une fondation pour les études futures sur neurites des deux neurones normaux et ceux qui sont touchés par des troubles neurologiques.

Introduction

Les neurones établissent l'essentiel des circuits complexes de la fonction des systèmes nerveux central et périphérique, par l'élaboration de dendrites et des axones recevoir des informations, souvent assez volumineux, de communiquer avec des neurones en aval. L'extension des neurites joue un rôle fondamental pendant le développement embryonnaire et la différenciation neuronale et la maintenance des neurites soutient de manière critique de la fonction du système nerveux. Processus séniles également critique dans les lésions neuronales et de régénération, ainsi que des troubles du système nerveux. L'étude de l'architecture neuronale est crucial de comprendre à la fois le cerveau normal et pathologique. Heureusement, les systèmes de culture de cellules neuronales physiologiquement pertinentes existent qui peuvent récapituler structures cellulaires complexes et hétérogènes. Basé sur l'élucidation des plates-formes expérimentales solides, des stratégies de visualisation efficaces qui permettent des analyses qualitatives et quantitatives de la morphologie des neurones sont nécessaires. Particulièrement utile seraitune méthodologie détaillée qui fournit une plate-forme uniforme pour la visualisation de neurites, les axones et les dendrites à l'échelle du nanomètre.

Microscopie électronique traditionnelle nécessite l'utilisation de solvant organique lors de la déshydratation et l'incorporation de résine, ce qui peut induire des distorsions dans les spécimens de leur véritable état. À ce jour, la plupart des caractérisations structurales à l'échelle du nanomètre sont basées sur des cellules plus grandes ou des tissus qui sont soumis à ces produits chimiques agressifs - limitant ainsi l'interprétation des résultats 4,9,25. De plus, pour la pénétration du faisceau d'électrons, le sectionnement est requis pour les organismes cellulaires ou de saillies présentant une épaisseur supérieure à 1 um 12. Enfin, en coupe ou fraisage résultats de tissus dans la collection d'ensembles de données spécifiques aux tranches discrètes, ce qui rend fastidieux la définition de la fonction de forme allongée de neurites. Même pour cryo-EM, dans lequel la coupe d'un échantillon congelé-hydraté est possible, la méthode présente compression artifagit 1.

Au cours des dernières années, les chercheurs ont appris à cultiver des neurones d'hippocampe directement sur ​​les grilles EM et le flash-gel dans les éthane liquide pour visualiser la suite neurites en utilisant cryo-ET 8,10,18,23. Toutefois, ces études utilisent soit un dispositif sur mesure 10,23, ou le manque de détails sur l'étape buvard pour générer suffisamment de glace vitreuse mince pour la visualisation de routine 8,18. Par exemple, une étude recommande l'utilisation de 30-40 secondes pour buvard la grille EM 10, mais cette valeur est optimisée pas pour un usage général, mais est spécifique à ce dispositif de plongée gel sur mesure. L'utilisation d'un dispositif sur mesure plutôt que disponible dans le commerce 17 pour maintenir l'humidité avant de plonger au point de congélation de l'échantillon pourrait constituer un obstacle pour la reproductibilité généralisée.

Bien que ces études ont été révolutionnaire dans la visualisation de neurites par cryo-ET, nous avons franchi une nouvelle étape pour explorer l'APplicability de cryo-ET à une variété de spécimens neuronales (neurones de l'hippocampe et le ganglion de la racine dorsale). De plus, nous discutons de deux résultats optimaux et sous-optimaux, ainsi que les artefacts potentiels que l'on peut rencontrer en utilisant cryo-ET pour ces spécimens.

Définition d'une technique détaillé pour la préservation et la visualisation des neurites entiers à l'échelle du nanomètre dans un état quasi-native serait de renforcer la capacité pour plus de chercheurs de mener des études ultrastructurales. À cette fin, nous décrivons un protocole efficace et détaillée en utilisant un équipement disponible dans le commerce pour préparer non fixées, les neurones non colorées pour visualiser neurites. Il s'agit d'une première étape importante vers détaillant l'ultrastructure des neurites en bonne santé et de jeter les bases pour comprendre ce que les différences structurelles sont présents dans des modèles de maladies du système nerveux. Depuis cryo-ET peut résoudre non fixées, les caractéristiques de neurites non colorées en 3-D à l'échelle du nanomètre, la méthode permettant de ne jamais êtreavant de définir l'architecture neuritique 12.

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Protocol

Une. La préparation des plats avec EM grilles pour placage neurones primaires

  1. Examiner l'intégrité de carbone troué sur les grilles EM d'or à l'aide d'un microscope optique à un grossissement d'au moins 25X. Assurez-vous que les trous de carbone sont> 98% intact.
  2. Pour le placage neurones primaires, utiliser un brûleur Bunsen à flamme stériliser les grilles EM et en même temps rendre hydrophile. Utilisez des pinces pour ramasser la grille de EM par son bord, pas la partie quadrillée central. ATTENTION: Ne laissez jamais un brûleur Bunsen allumé sans surveillance, et ne pas utiliser de gants ou des pincettes avec des composants en plastique tout en effectuant les étapes suivantes:
    1. Avant d'allumer le brûleur Bunsen, définir les réglages d'air et de gaz à une position d'ouverture minimale.
    2. Allumer le brûleur Bunsen l'aide d'un silex de l'attaquant ou briquet au butane.
    3. Modifier les réglages de l'air et de gaz à atteindre une petite flamme intérieure bleue dans un plus grand, plus léger flamme bleue / violette. La pointe de la flamme intérieure est la partie la plus chaude de la flamme. Le bouton sousNeath le brûleur permet de régler la quantité de gaz entrant dans le tube de brûleur, tandis que le canon du brûleur peut être tourné pour ajuster la quantité d'air entrant dans le brûleur. Tourner le réglage de l'air dans le sens horaire diminue l'air (résultant en une flamme violette) et augmente dans le sens antihoraire l'air (résultant en une flamme jaune).
    4. L'aide de pinces métalliques (pas de pièces en plastique) pour maintenir la grille de EM, passer rapidement à travers la flamme deux fois, face carbone vers le haut. Le côté de carbone apparaît plus mat (moins brillant) et avec plus d'une teinte grisâtre de l'autre côté.
    5. Transférer immédiatement la grille (carbone vers le haut) dans le centre de l'assiette à fond de verre placé à 10 cm du brûleur Bunsen. Utilisez une grille de EM par plat (figure 1). N'utilisez que des plats à fond de verre qui sont pré-stérilisés, soit par irradiation gamma.
  3. Utiliser un microscope optique pour vérifier l'intégrité de la grille (trous de carbone intact) tout en gardant la grille de EM à l'intérieur du verre Bottplat de l'OM (pour éviter la contamination). Lors de l'application de toute substance sur la grille ou quelque chose qui va entrer en contact avec les neurones, utilisez la procédure stérile et embouts de pipette stériles.
  4. Dans une hotte de culture de tissu en utilisant la procédure stérile, appliquer 250 ul de la substance d'enrobage approprié lentement et avec précaution à la zone de verre centrale de la boîte de Pétri. Assurez-vous que la substance de revêtement approprié couvre la grille EM entier.
    1. Pour les neurones de l'hippocampe, en utilisant la poly-L-lysine (PLL, 1 mg / ml) en tant que la substance de revêtement, préparée comme décrit précédemment 19. Notez que 250 pi sont nécessaires par grille EM, par plat, si l'échelle du lot en conséquence. Pour ganglion de racine dorsale (DRG), utiliser un mélange de protéines gélatineuse sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de la souris (voir le tableau des matériaux et réactifs) que la substance de revêtement, préparer comme suit. Notez que 250 pi sont nécessaires par grille EM, par plat, si l'échelle du lot en conséquence.
      1. Décongeler une bouteille dedu mélange gélatineux protéine sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Des cellules de sarcome de souris pendant une nuit à 4 ° C.
      2. Gardez à froid le mélange de protéines gélatineuse sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de la souris, et tous les composants utilisés pour rendre la solution, c'est à dire en les gardant sur ​​la glace.
      3. Alors que sur la glace, diluer ce mélange de protéines dans du milieu Neurobasal gélatineux pour obtenir une dilution de 1:20 (à savoir 500 pi de diluer le mélange de protéines gélatineux dans 10 ml de Neurobasal).
      4. Diviser dilué mélange de protéines gélatineux en aliquotes de 1 ml, et de stocker immédiatement toutes les aliquotes supplémentaires à -20 ° C.
      5. Appliquer 250 ul par grille EM, par plat, comme décrit à la section 1.4.
  5. Couvrir la boîte de Petri avec son sommet et incuber (soit avec PLL pour les spécimens de l'hippocampe, ou avec le mélange de protéines gélatineux pour les spécimens de DRG) pendant 1 heure à la température ambiante sous la hotte de culture de tissu.
  6. Aspidonner toutes PLL (pour les échantillons de l'hippocampe) ou le mélange de protéines gélatineux (pour les échantillons de DRG) de la vaisselle. Pour ce faire, utiliser le système à vide dans la hotte de culture de tissu. Utilisation d'une pointe de pipette stérile fixé au tube à vide. Eviter le contact direct avec la grille de EM.
  7. Utiliser une pipette de l'air à déplacement réglable pour appliquer soigneusement 250 ul de PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate) à la grille de EM dans la zone du verre central de chaque boîte de Petri, de telle sorte que la grille EM est entièrement couverte par PBS. Ensuite, aspirer le PBS de chaque plat. Répétez 3x.
  8. Laissez les plats avec des grilles EM à sécher sous le tissu de la culture capot pendant 15 min. Assurez-vous qu'ils sont complètement secs en cochant au microscope optique dans la chambre de culture de tissus. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'humidité dans la grille. Si c'est le cas, aspirer soigneusement à côté de la grille EM pour éliminer cette humidité supplémentaire. La grille revêtu doit être utilisé immédiatement pour revêtir les neurones.

2. Préparation et PlAting neurones primaires sur EM Grilles

  1. Pour plaque neurones primaires, première disséquer, trypsiniser (en utilisant 2,5% de trypsine) et trituration de dissocier l'hippocampe (ou ganglion de racine dorsale des embryons de rat de 18 jours de) dans des cellules individuelles, comme décrit précédemment 19.
    1. Triturer est un terme couramment utilisé par les neurobiologistes pour décrire touffes de dissociation de cellules en cellules individuelles, en particulier par l'utilisation d'une pipette en verre avec une pointe polie au feu. Le résultat est obtenu en tirant lentement et avec précaution et la libération des cellules, vers le haut et vers le bas, de multiples fois (~ 30) à travers la pipette.
  2. Suivez procédures décrites précédemment pour DRG dissection et l'isolement cellulaire 24, prenant note d'utiliser 0,25% de trypsine (dans HBSS) pour isoler les neurones DRG de rat, plutôt que d'utiliser les enzymes proposées (papaïne, la collagénase / dispase) qui sont plus adaptés pour la souris neurones de DRG.
  3. Calculer le nombre de neurones isolés (c'est à dire en utilisant un hématimètre)et utiliser cette valeur pour calculer le volume approprié de cellules à appliquer à chaque plat pour obtenir une concentration de 50 000 cellules / ml par boîte. Le volume maximal à appliquer est de 250 pi. Notez que cela ne remplit la zone centrale en verre, pas tout le plat.
  4. Incuber les boîtes pendant 30 min dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Permettent aux cellules de se rétablir et adhèrent.
  5. Ajouter lentement 1,5 ml de milieu réchauffé à chaque plat, en prenant soin de ne pas perturber la grille de EM. Le type de support dépend du type de cellule (ou de l'hippocampe DRG).
    1. Préparer le support approprié soit pour les neurones hippocampiques 19 ou dorsales neurones du ganglion de racine 24, qui doit être chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C avant de l'utiliser. Incuber les boîtes pendant la nuit dans l'incubateur à CO 2.
    2. Pour neurones de l'hippocampe, changer les médias le lendemain. Changer la moitié des médias tous les deux jours ultérieurs pendant 14 jours. Réchauffez les médias dans un bain d'eau à 37 ° avant de l'utiliser. Pour les neurones de DRG, le lendemain dissection / placage, préparer un nouveau bilan des médias avec un agent anti-mitotique (uridine et 5'-fluoro-2'-désoxyuridine) faire une solution mère à 10 mM de chacun, séparément; utiliser une finale concentration de 10 uM de chaque. Retirer la moitié des médias de DRG (875 pi) et ajouter 875 ul de milieu frais avec l'agent anti-mitotique.
      1. Pour les neurones DRG, tous les deux jours pour la première semaine, suppléant changer de support entre les médias antimitotiques et médias DRG standard. Pour la deuxième semaine, changer de support de standards DRG tous les deux jours.

3. Vitrification neurones sur EM Grilles

  1. Préparer le matériel et tous les matériaux pour la congélation et le stockage des grilles EM d'or à la température cryogénique: un dispositif de vitrification avec une chambre d'humidité 17, pointes fines pinces spécifiques pour la machine de vitrification, point longue et plate pincettes, Dewar (s) de l'azote liquide (LN 2), crécipient oolant, boîte de rangement de grille EM, papier filtre sans calcium.
  2. Lancer le dispositif de vitrification. Régler le taux d'humidité à 100% et la température à 32 ° C. Dans la section «Console», régler le temps de transfert à zéro seconde. Cela permet de buvard manuel à travers le côté fenêtre de la chambre d'humidité de la machine de vitrification.
  3. Manipulez le papier filtre sans calcium avec des gants, les couches de telle sorte que trois documents sont empilés. Couper la pile dans 0,5 cm de larges bandes qui sont ~ 2 cm de long. Plier à un angle de telle sorte que d'un côté du papier a un 0,5 cm x 0,5 cm pour le visage (figure 2) à 90 °. L'aide de pinces, retirer le papier du milieu et placez-le sur un autre papier filtre sans calcium jusqu'à utilisation.
  4. Mettre le bouton de stockage de grille dans le porte-bouton à l'intérieur de la chambre de vitrification. Remplir la chambre intérieure du conteneur d'agent de refroidissement à l'azote liquide et attendre jusqu'à évaporation complète. Remplir la chambre extérieure de ee conteneur réfrigérant avec de l'azote liquide jusqu'à ce qu'il atteigne une température stable pour procéder à l'étape suivante. Remplir la chambre intérieure de haute pureté avec de l'éthane gazeux qui se condense à l'état liquide à l'intérieur de l'enceinte réfrigérée.
  5. Déplacer l'antenne (s) de l'incubateur, dans une large plat en polystyrène de 100 mm pour le transport vers la chambre de vitrification, s'il n'est pas dans le voisinage immédiat. Utilisez les pinces de vitrification spécialisées à soigneusement choisir la grille EM de l'antenne. Remarque quel côté les neurones se développent sur la grille de EM, la position sera question pour la prochaine étape. Utilisez le verrou coulissant noir sur la pince à épiler pour verrouiller solidement les pinces sur la grille de EM.
  6. Insérer la pince à épiler dans la machine, tels que la vitrification de côté de la grille EM sur lequel les neurones sont collées les faces de la gauche, à l'écart de l'orifice à ouverture latérale de la machine de vitrification. Rentrez les pinces spécialisées dans la machine de vitrification.
  7. Placer le récipient de liquide de refroidissement dans le support appropriéde la machine de vitrification. Il doit être rempli avec LN adéquate 2 et de l'éthane liquide. En utilisant la commande appropriée de l'écran de la machine de vitrification, soulever la chambre d'agent de refroidissement vers le haut jusqu'à ce qu'il soit balayé avec le fond de la chambre d'humidité.
  8. Avec les pinces à bout plat, saisir un bord de papier filtre de telle sorte que le côté le plus court (les 0,5 cm x 0,5 cm du visage) est perpendiculaire à la pince à épiler. Ce visage entrera en contact direct avec la grille de EM pour blot (figure 2B). Insérez délicatement le papier filtre dans le petit trou de la chambre de l'humidité de la machine de vitrification (figure 2A). Maintenir de manière stable le papier contre la grille EM (le côté opposé à l'échantillon) pendant 10 s. Jeter le papier après et immédiatement plonger-congeler les échantillons dans de l'éthane liquide à l'aide de l'automatisation de la machine de vitrification.
  9. Soigneusement transférer votre grille EM congelé-hydraté à une des fentes dans l'un desboutons de stockage de grille. Répétez le processus pour les grilles EM supplémentaires dans les plats. Les boutons de stockage de grille EM utilisés dans ces expériences peuvent stocker plusieurs grilles EM congelés hydraté.

4. Collection de l'image, traitement et annotation

  1. Procéder pour collecter des micrographies électroniques 2-D et / ou 3-D série 5 d'inclinaison des neurites en utilisant un microscope électronique de cryo-dans des conditions à faible dose. Les images 2-D ont été conçus pour évaluer la qualité de la grille en termes d'épaisseur de la glace et les zones possibles pour être utile pour 3-D série d'inclinaison.
    1. Dans ce cas, toutes les images ont été recueillies à l'aide d'une caméra 4k x 4k CCD fixée à un microscope 200 d'électrons kV équipé d'un seul et même titulaire de l'azote liquide de transfert de cryo d'inclinaison, à 20k microscope grossissement sur une cible underfocus de 7 um et d'échantillonnage de 4,4 Å / pixel.
    2. Pour obtenir une tomographie 3D de l'échantillon, prendre une série d'images de projection tout en inclinant progressivement l'échantillon along un axe du microscope électronique à transmission (MET). Compte tenu des angles d'inclinaison et d'autres paramètres expérimentaux, il existe plusieurs logiciels différents disponibles pour collecter automatiquement la série de basculement 5. La série d'inclinaison 3-D représenté ici ont été collectées sur le même microscope à l'aide de semi-automatisé logiciel d'acquisition de la série d'inclinaison 26 sur une plage de -60 ° à 60 ° dans des incréments de 5 ° avec une dose cumulée de ~ 60 e / A 2.
  2. Reconstruire la série d'inclinaison des neurites en utilisant un logiciel de traitement d'image 21 comme décrit précédemment pour d'autres échantillons 5,29.
  3. Color-annoter les caractéristiques en 3-D des neurites par la segmentation de la première tomogramme et la création d'un modèle de surface en utilisant un logiciel de traitement d'image 3-D comme précédemment décrit 5.

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Representative Results

Avant la congélation et l'imagerie par cryo-ET, images au microscope optique devraient être prises de la grille de EM sur lequel les neurones sont de plus en plus. Neurites doivent être clairement visibles sans chevauchement important avec l'autre. Une boîte de couleur dans la figure 3A représente une zone qui est agrandie en montrer un plus fort grossissement de la figure 3B, dans laquelle neurites s'étendent à travers le treillis de la grille. Chaque grille-carré est composé d'un film de carbone à trous qui prend en charge les neurones et leurs axones. Ces trous sont visibles dans une image à faible dose cryo-EM prise au grossissement de 4k, qui montre le corps de neurone comme un objet relativement grand, noir, dense aux électrons (figure 3C), à partir de laquelle les neurites projet vers l'extérieur.

Une partie du repos des neurites au-dessus d'un trou dans le carbone est choisi dans un cadre de couleur sur la figure 3C, et agrandie en à un grossissement supérieur (20k) de la Figure 3D. À ce grossissement, structures cellulaires internes claires, y compris des microtubules, des vésicules, et les mitochondries doivent être clairement (figure 3D), en particulier dans la glace de façon optimale mince généré en suivant ce protocole. Les structures noirs foncés dans le centre de l'image (Figure 3D) sont des particules de glace hexagonaux qui sont considérés comme contamination et doivent généralement être évités, mais étant donné qu'ils sont très clairsemées et à l'extérieur des neurites eux-mêmes, ils n'interfèrent pas avec l' reconstruction et couleur annotation des structures internes pour l'analyse et l'interprétation (Figure 4). Un autre à faible dose, l'image à faible grossissement est représenté sur la figure 5, à partir de laquelle un des neurites peut être localisée, après quoi plusieurs images 2-D peuvent être prises et numériquement cousues ensemble en utilisant un logiciel de traitement d'image pour générer un montage (figure 6).

La premièrefaible concentration de placage (50 000 cellules / ml par plaque) de neurones sur les grilles EM permet de neurones qui sont suffisamment éloignées pour assurer une visualisation claire de leurs axones (figure 3C); des concentrations supérieures à celle recommandée (> 50 000 cellules / ml par plaque ) peut entraîner des images sous-optimales de neurites bondés qui sont difficiles à suivre ou à attribuer des composants cellulaires (figures 7b et 7c).

Figure 1
Figure 1. Schéma de la croissance des neurones sur des grilles EM dans des plats à fond de verre. (A) des plats à fond de verre sont présentés, partiellement rempli avec les médias de la cellule (rose). (B) Chaque plat contient une grille EM d'or, comme un point de vue plus approfondi révèle. (C) Revêtement de la EM grille de poly-lysine est représenté comme un dessin animé côté-coupe. Le plat de fond de verre est composé d'une lamelle de verre carrée qui est fixé au fond d'une boîte de culture en matière plastique, recouvrant une ouverture circulaire qui a été initialement découpé dans le fond. Ces plats à fond de verre sont stérilisés gamma et commercialement achetés tels premade. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2
Figure 2. Schéma de blot manuel de EM grilles avec des neurones adhéré. (A) Close-up de glisser la fente d'entrée de la machine de vitrification (flèche noire) à l'/ chambre buvard d'humidité, dans lequel pinces seront insérées pour effacer l'échantillon manuellement. (B)régime de dessin animé montrant comment le papier filtre sans calcium (0,5 cm x 0,5 cm visage) doit être manipulé à l'aide des pinces de point plat et inséré dans la fente d'entrée dans la chambre de l'humidité de la machine de vitrification pour buvard la grille EM sur lequel les neurones sont respectées (gouttelettes de milieux cellulaires rose représenté). La grille EM est tenu par pointes fines pinces spécialisées à l'intérieur de la chambre de l'humidité. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. Visualisation, les neurones hydratés-congelés en microscopie électronique (EM) or des grilles. (A) l'image de microscope optique à un grossissement de 10X de la zone centrale d'une grille d'EM sur laquelle les neurones primaires de rat ont été groaile pendant 2 semaines. (B) en vue agrandie de la boîte à eau représenté en (A), dans laquelle les neurones et de leurs projections de neurites sont visibles (flèches roses). (C) micrographie électronique à un grossissement de 4K un neurites en saillie vers l'extérieur depuis le corps de neurone (flèche rouge). Correspond schématiquement à une zone (c'est à dire la zone rouge) dans l'une des cases de la grille figurant dans (B). Boîte bleue est considérée close-up en (D), où les caractéristiques internes de la neurites sont clairement visibles à 20k grossissement (flèche verte mitochondries; microtubules flèches oranges; vésicule flèche bleue). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4
Figure 4. Reconstruction 3-D et l'annotation d'un axone tomographie DRG de rat. (A) tranche tomographique à partir d'une pile reconstruit des images prises à différents angles d'inclinaison d'un axone de DRG. (B) correspondant 3-D annotation de la même axone. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 5
Figure 5. 2-D image de cryo-EM d'un neurone DRG de rat (centre-gauche) avec projections axonales (encadré rouge) à 4k grossissement. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 6 Figure 6. Montage de quatre 2-D images cryo-EM d'un seul axone DRG de rat. Chaque image a été prise à 20k grossissement. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 7
Figure 7. Les images 2-D cryo-EM de neurites. (A) Un axone de DRG de rat imagées plus près à proximité du corps cellulaire. (B, C) ​​Exemples de surpeuplement des neurites en raison de la concentration élevée de placage des neurones sur des grilles EM. Tous les neurites étaient surgelé deux semaines après placage sur des grilles EM d'or. Toutes les images ont été prises à 20k;. Agrandissement Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 8
Figure 8. Reconstruction 3-D et de l'annotation d'un tomogramme neurites de l'hippocampe de rat (A). Tranche tomographique reconstruite à partir d'une pile d'images prises à différents angles d'inclinaison de l'un des neurites de l'hippocampe. (B) correspondant 3-D annotation de la même neurites. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

Nous montrons que le rat neurones embryonnaires (ganglionnaires de la racine dorsale et l'hippocampe) peuvent être cultivées en microscopie électronique or (EM) des grilles et dans la glace vitreuse suffisamment minces pour leurs neurites être imagées à l'aide de 2-D cryo-EM et 3-D cryo- ET. Alors que neurites hippocampe ont déjà été imagées en utilisant cryo-ET 8,10,18,23, un protocole suffisamment détaillée pour reproduire avec succès en utilisant des dispositifs disponibles dans le commerce qui a fait défaut. En outre, alors que leur recherche a lancé l'utilisation de cryo-ET pour visualiser neurites hippocampe, nos études explorent l'applicabilité de cryo-ET à plus d'un type de spécimen neuronales.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé préparation EM grilles avec soit de l'hippocampe et ganglion de racine dorsale (DRG), les buvard pour atteindre la glace mince de manière optimale, et plongeons-gel eux pour l'imagerie par cryo-ET. Temps de blotting optimale est celle qui ne donne pas lieu à la glace trop épaisse pour que le faisceau d'électrons à pénétrer,ni trop mince que la glace vitreuse apparaît dégradé sensiblement différent de bord du carbone troué au plus profond de carbone troué. En outre, la réalisation de la glace mince de manière optimale grâce à l'utilisation d'une machine de vitrification 17 peut être légèrement différente pour chaque projet, et le gel robuste utilisant la machine de vitrification nécessite une courbe d'apprentissage.

Bien que des recherches antérieures ont porté sur les neurones de l'hippocampe, également exploré ici dans nos études, nous sommes allés plus loin pour montrer des images à l'échelle nanométrique de intactes, les axones entiers congelés hydraté du ganglion de la racine dorsale (DRG), jamais imagé avant d'utiliser la cryo- EM ou cryo-ET. cellules de DRG ont été choisis car ils (contrairement aux neurones de l'hippocampe) donnent exclusivement lieu à axones 34. Un protocole pour eux l'imagerie par cryo-EM/cryo-ET pourrait être utile pour ceux qui s'intéressent à déduire ultrastructure axonale c'est à dire dans les neurones sensoriels. Nous avons également présent et discuter des résultats à la fois optimales et sous-optimales, ainsique les artefacts potentiels que l'on peut rencontrer en utilisant cryo-ET pour ces spécimens.

A la concentration cellulaire appropriée (50.000 cellules / ml par boîte), l'espacement des neurones est telle que neurites permettent un excellent accès en utilisant la lumière et la microscopie électronique (figures 3A et 3B) avec un ou deux neurones apparaissant par une grille carrée (figure 3B) . Laissant suffisamment de séparation entre les neurones est nécessaire à la visualisation claire des neurites par cryo-EM (figures 3C et 3D). Les neurones et leurs axones sont supportés sur un film de carbone à trous de la grille d'or, comme on le voit clairement sur ​​les images cryo-EM (figures 3C et 3D). Les corps des neurones, qui peut varier de ~ 15-50 um pour neurones de l'hippocampe et ganglion de racine dorsale (DRG) 30,33 sont trop épais pour l'imagerie utilisant cryo-EM et apparaissent complètement noir, ce qui est typique pour very objets denses aux électrons et des spécimens d'épaisseur, par rapport aux projections relativement plus minces des neurites (ne dépassant pas 1 um de diamètre) rayonnant à partir d'eux (figures 3C et 5).

3-D du tissu cérébral résine enrobé ne révèle pas de neurites qui sont complètement circulaire en section transversale 14, en fait, leur morphologie est variable. Il n'est donc pas connu si la forme non circulaire de neurites est naturel ou une préparation artefact de l'échantillon. L'épaisseur mesurée de l'axone de DRG (figure 4) ont été cultivés sur la grille de TEM, effacée et reproduite comme indiqué dans la présente étude était de 0,32 pm dans la direction z (dans la profondeur de la glace vitreuse) et une largeur moyenne de 0,53 um à le plan xy. L'épaisseur mesurée de la neurites de l'hippocampe (figure 8) cultivés sur la grille de TEM, effacée et reproduite comme indiqué dans la présente étude était de 0,50 pm dans la direction z (dans la profondeur de la glace vitreuse) et unmoyenne de 0,72 um dans le plan xy. Le processus de blot comme décrit ici peut aplatir les neurites bien qu'ils soient restés hydraté dans leur tampon d'origine pendant tout le processus de séchage et la procédure de plongée congélation.

Le léger aplatissement de neurites sur la grille observée par cryoET ne semble pas affecter la structure de ses constituants internes telles que des vésicules, comme indiqué ici, qui sont presque parfaitement circulaire et ne montrent aucun signe de déshydratation. En revanche, les processus chimiques couramment utilisés dans les préparations «traditionnelles» EM, en particulier la fixation chimique avec le glutaraldéhyde et le paraformaldéhyde suivie d'une déshydratation dans de l'éthanol, donnent lieu à un retrait de tissu incontrôlée. Le potentiel de rencontrer un tel effet préjudiciable cellulaire est éliminé dans la méthode que nous présentons pour cryoET dans notre manuscrit.

En outre, nos échantillons de neurites ont été immédiatement plonger-congelés dans de l'éthane liquide, ce qui iInstant 'intégration' en glace vitreuse. Les tissus qui sont congelés dans un état vitreux apparaissent beaucoup plus semblable à l'état physiologique que les autres techniques. Le niveau de détail ultrastructurale n'est pas le seul aspect qui rend la technique décrite dans notre protocole à être précieuse pour les chercheurs en neurosciences. La technique de plus en plus les neurones sur des grilles EM, immédiatement buvard / plongée gel les conserver dans un état vitreux pour le dépistage / imagerie par cryoET est une technique intéressante, car elle ouvre la possibilité d'examiner l'ultrastructure des neurones dans différentes génétique, chimique ou environnementale souligne sans le souci d'artefacts de déshydratation potentiels.

Les conditions buvards avant congélation, comme indiqué dans ce protocole, sont importants pour générer glace suffisamment minces pour la visualisation par cryo-ET des caractéristiques ultrastructurales, y compris les composants internes tels que les mitochondries, des vésicules et des microtubules (figures 4, 6, 7A). Mitochondries, par exemple, pourrait être identifié dans nos préparations, car ils semblent structurellement similaire à ce qui a été vu dans les cellules (les bords de fibroblastes embryonnaires de souris) via la tomographie cryo-électronique 20. Ils présentent également des crêtes, qui peut être vu dans les images couleur annotée en 3-D présents dans ce manuscrit. Les images sous-optimales peuvent résulter de glace épaisse dans laquelle l'image cryo-EM apparaît généralement opaque, ce qui empêche l'identification réussie de ces caractéristiques que les mitochondries et les microtubules au sein de la neurites. Un manque de détails suffisants pour la préparation de ces échantillons, en particulier en ce qui concerne la façon de produire de la glace de façon optimale mince, presque certainement contribué au succès limité dans la définition de l'ultrastructure des neurites 8,10,17,23.

Images sous-optimaux peuvent également résulter de placage trop de neurones sur la grille (> 50 000 cellules / ml par boîte), qui se traduit par le surpeuplement des neurites (Figures0; 7B et 7C). Les images floues peuvent être le résultat de défocalisation incorrects et doivent être ajustés; la défocalisation dans les images présentées ici a été prise avec un underfocus ciblée de 7 pm. Les images ont été recueillies à ce défocalisation pour assurer un contraste plus élevé et la visibilité des caractéristiques ultrastructurales, cependant, une défocalisation inférieure (c. 3.2 um) pourrait également être utilisée pour obtenir les informations de résolution plus élevé de ces fonctions.

D'autres facteurs peuvent contribuer à des images sous-optimales. Par exemple, bien qu'il puisse être tentant d'utiliser d'autres fonctions de la machine de vitrification, en particulier la fonction buvard semi-automatique, plutôt que manuel blot décrit ici, ce qui a donné des résultats indésirables. Double-face blot a été initialement tenté d'utiliser cette fonction semi-automatique, dans lequel la machine de vitrification (plutôt que de l'utilisateur) efface l'échantillon en utilisant directement des paramètres tels que le temps et le nombre de taches buvard comme spécifié par l'utilisateur. Toutefois, afimagerie ter ces échantillons, il a été constaté que tous les neurones ont lysées ouverte, déversant leur contenu (corps multivésiculaires, etc.) Par conséquent, la machine de vitrification est préférable d'utiliser dans ce cas pour sa chambre humide à température réglable, dans lequel l'échantillon est effacé avant de plonger-gel. Le maintien de l'échantillon dans un tel état ​​(avec l'humidité est réglée proche de 100%) minimise la perte d'eau lors de la préparation et aide à assurer glace vitreuse optimale post-congélation 3,7.

Idéalement, pour minimiser l'exposition des neurones à des perturbations externes, ils doivent être cultivées dans un incubateur à CO 2 (température réglée à 37 ° C) à proximité de la salle avec la machine de vitrification, et la température de cet appareil doit être mis à 37 ° C avant surgélation les neurones sur les grilles EM. Il faut éviter d'exposer les neurones à de grandes fluctuations de température avant buvard. Dans ce rapport, la température a été réglée à 32 ° Cà des fins buvard; neurones ont été cultivées dans un autre bâtiment et un laps de temps d'environ 10 min ont eu lieu entre les plaques portant des neurones d'une pièce à l'autre. On a pris soin de protéger les échantillons dans un récipient semi-isolant résistant à l'eau pendant le processus de transport. Un changement similaire dans la température et la concentration de CO 2 (vécue par les neurones avant blot / plongée gel) produit des neurones tous les ~ 2 jours lorsque les neurones sont sortis de la chambre d'incubation pour les médias à être modifiés en vertu de la prévention des risques biotechnologiques capot, comme se fait habituellement pour des cultures de neurones. Ce n'est pas vu d'avoir des effets toxiques pour la cellule.

En ce qui concerne la présence de ce qui semble être des granules dans les mitochondries des neurites denses aux électrons, plusieurs rapports contradictoires existent. Ces granules sont présents dans une variété de différents tissus, de cellules non neuronales spécifiquement. Ils sont perçus comme un évier de cations qui régulent l'ionique interne ennement de la mitochondrie. Ils apparaissent également pour créer des sites de contact entre les membranes mitochondriales interne et externe dans laquelle des enzymes peuvent fonctionner efficacement 16.

Des études expérimentales indiquent que le calcium et d'autres cations divalents s'accumulent dans les mitochondries où ces ions sont présents dans le bain liquide, soit mitochondries isolées ou des cellules intactes. Il semble probable que les ions sont liés organiquement aux granules intra-mitochondriaux préexistantes. Il est donc suggéré que ces granules sont liés à la réglementation de l'environnement ionique interne de la mitochondrie 31.

En outre, les neurones dans notre préparation ont été cultivées sur des grilles EM pendant 14 jours, le temps de ce qui est typique pour les besoins de la croissance des neurites 15,36, avant l'imagerie par cryoEM / ET. Il a été rapporté qu'il y ait une forte augmentation de la concentration en calcium intracellulaire dans les neurones âgés par rapport à youn g neurones 32. Par conséquent, il est plausible que les mitochondries dans les axones de ces neurones seraient âgés afficher granules mitochondriaux pas nécessairement comme un signe de stress, mais plutôt parce qu'ils possèdent une plus grande présence de calcium intracellulaire.

Granules denses aux électrons mitochondriaux ont également été signalés dans les fibroblastes embryonnaires de souris cultivés en culture et imagées par la même technologie (tomographie cryo-électronique) utilisé dans notre manuscrit 20. Ces cellules n'ont pas montré de modèles typiques de changement ultrastructural associés à une lésion cellulaire, tels que la perturbation du cytosquelette et une vacuolisation du cytoplasme. De même, au sein de nos neurites comme visualisé par cryoET, nous n'avons pas observé un cytosquelette perturbé qui seraient autrement associée à une toxicité cellulaire. Compte tenu des considérations qui précèdent, nous concluons que les neurones dans notre préparation n'ont pas montré granulés mitochondriales en raison du stress ou de toxicité.

contenu "> Pour stériliser la surface de la grille EM pour empêcher la contamination de neurones, et aussi à générer une surface favorable, hydrophile sur la grille de EM dans laquelle la poly-L-lysine pourrait adhérer, flamber les grilles EM avant l'étalement des neurones a été trouvé avantageux. stérilisation UV n'a pas été choisi, car il nécessite l'irradiation de la grille pour un temps plus long (par exemple 20-30 min) dans la hotte de biosécurité. Ensuite, auraient besoin d'être re-nouveau exposé à l'environnement les grilles quand étant lueur déchargées à des fins de rendre hydrophile la surface de la grille. incandes-décharge de la grille permet de s'assurer que le revêtement de poly-lysine ultérieur serait effectivement «coller» à la grille. La technique de flamber la grille est avantageux car il combine à la fois l'étape d'hydrophilisation et l'étape de stérilisation en un. neurones primaires sont connus pour être plus sensibles que les lignées de cellules tumorales en fonction et il est crucial de garder leur environnement (grille, boîte de Pétri) aussi stérile que possible.

(figures 3C et 5), qui couvre plus de la zone de réseau à des fins de sélection des neurites à l'image . Puis, 2-D images cryo-EM peuvent être prises à des intervalles et numériquement cousues ensemble dans un montage (figure 6). Cette technique peut être utile pour les caractéristiques ultrastructurales, telles que l'organisation des microtubules, sur une surface plus grande que celle d'une seule image cryo-EM.

Prenant à faible dose, des images à faible grossissement (figures 3C et 5) est également utile pour identifier des zones de la neurite et compatible en diamètre à travers le film de carbone à trous (à la fois dans les trous et à travers le carbone) et donc plus idéal pour l'imagerie et des analyses ultérieures. Agrandissement des neurites plus de trous du film de carbone est typiquement observée dans une plus grande neurites (figure 5) d'un matériau nettement plus interne de neurites plus minces (Figure 3C). Ce phénomène est supposée se produire en raison de l'absence de support physique dans les trous de la couche de carbone. Lorsque la grille EM est retiré de la cuvette, dans lequel les neurones ont été de plus en plus, et ensuite effacé de la face arrière, avec une masse neurites plus interne (figure 5) que d'autres (Figure 3C) ont tendance à se dilater et / ou de s'affaisser dans les trous. Bien que cela semble être un artefact, il a un avantage de montrer plus clairement les constituants internes de la neurites. L'utilisation d'un film de carbone continue superposée sur ce film de carbone à trous peut aider à contourner ce problème dans les études futures. Cette configuration a été initialement tenté mais a donné lieu à glace vitreuse trop épais pour l'imagerie. Les prochains essais avec différentes épaisseurs de carbone continue superposées sur la grille de EM peuvent avoir besoin d'autres enquêtes.

Une importanceavantage tante de la méthode actuelle est que l'organisation spatiale des composants de la cellule dans le neurites peut être visualisée à l'échelle du nanomètre en prenant plusieurs images 2-D d'une seule neurites à différents angles d'inclinaison, et de reconstruire cette pile d'images en tomographie. Caractéristiques structurelles individuelles peuvent ensuite être annotés manuellement pour chaque tranche 2-D de la pile 3-D dans différentes couleurs à l'aide du logiciel approprié (voir le tableau des matériaux et réactifs) comme indiqué pour un axone d'un rat E18 ganglion de racine dorsale (DRG) neurone (Figure 4) et un neurites d'un rat E18 neurones de l'hippocampe (figure 8).

En choisissant de prendre une image toutes les 5 degrés au cours de la série d'inclinaison, plutôt que de 1 ou 2 °, moins d'images sont collectées mais une dose plus élevée d'électrons peuvent être utilisés par image. Il en résulte un contraste plus élevé et moins de bruit dans les images brutes. C'est mieux pour les besoins de la reconstruction (alignement par corrélation croisée comme un st ep) et ultérieur annotation de tomographie, qui est fait par la main pour chaque image, comprenant l'empilement de tomographie dans la direction z. Le choix d'une taille d'incrément dépend également de la taille de l'échantillon; entre les différents angles d'inclinaison, de plus grands échantillons ne varieront pas autant. Dans ce cas, l'aide d'un incrément plus grand (5 °) a été pensé pour être plus approprié en raison de la taille relativement importante de l'échantillon de la neurites.

En outre, l'ajout de marqueurs d'or repères de la grille de EM aiderait pour l'alignement de l'image de fin, si désiré. Marqueurs de référence n'ont pas été utilisées parce que l'échantillon était relativement grande par rapport à d'autres échantillons cryo-EM (virus ou des protéines de façon isolée) et a montré un contraste élevé avec une variété de caractéristiques structurelles qui pourrait être utilisé pour l'alignement correct de chacune des images 2-D (comprenant la pile 3-D) par corrélation croisée. La pile de l'image résultante est bien aligné en utilisant cette approche, et utilisable pour la suite 3-D couleur annotation.

ent "> Pour les études futures, en utilisant un microscope avec un filtre d'énergie pourrait réduire le bruit causé par les électrons inélastique, mais une telle fonction peut ne pas être facilement accessibles à la plupart des installations de microscopie électronique. Notre procédure révèle ce que les images peuvent résulter d'une 200 kV microscope standard sans filtre d'énergie, qui peut être le plus souvent disponible à la communauté des neurosciences en général.

Le protocole décrit ici est optimisé pour la préparation et la visualisation de deux rats embryonnaires axones DRG et neurites hippocampe en utilisant un équipement disponible dans le commerce pour cryo-EM et cryo-ET. L'un des principaux avantages de cette technique est qu'elle donne des informations structurelles de neurites entiers, pas sectionné, blanchi ou traités par divers réactifs chimiques afin de voir leur ultrastructure. Nous avons montré comment cryo-ET est particulièrement excellente méthode pour une utilisation dans de futures analyses ultrastructurales de neurones dans un état proche de l'indigène pour examiner l'impactd'une maladie neurologique sur la structure des neurites.

Les numéros d'accès microscopie électronique à la banque de données pour les tomographies 3-D comme rapportés dans le présent document sont les suivants: Pour le rat hippocampe neurites comme le montre la figure 8 et dans la vidéo principale (à partir de 8:45-9:01), le EMDB numéro d'accès est EMD-5887. Pour le rat dorsal root ganglion neurites comme représenté sur la figure 4 et dans la vidéo principale (à partir de 09 heures 02-9h15), le numéro d'accession EMDB est EMD-5885.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par les subventions des NIH (PN2EY016525 et P41GM103832). SHS a été soutenue par une bourse du Programme du Centre interdisciplinaire de WM Keck Bioscience formation de la Côte du Golfe consortiums (NIH Grant No. T32EB009379) de formation supérieure nanobiologie interdisciplinaire.

SHS disséqué, a grandi et DRG et les cellules de l'hippocampe vitrifié; recueilli cryo-EM et données cryo-ET de DRG et les axones de l'hippocampe; reconstruit et couleur annoté de la série d'inclinaison. MRG disséqué et fourni cellules de l'hippocampe dans le laboratoire du MRN. SC assistée en série d'inclinaison annotation. SHS a été formé par CW sur la façon de disséquer et de grandir neurones. SHS, WCM et WC conçus les expériences. SHS a préparé le manuscrit avec la participation d'autres auteurs.

Cette vidéo a été filmée au Centre d'imagerie cellulaire et NanoAnalytics (C-CINA) du Biozentrum de til l'Université de Bâle. C-CINA est intégré dans le Département des biosystèmes (D-BSSE) de l'EPF de Zurich, situé à Bâle, en Suisse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample 
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Minigrid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semiautomated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine  Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
GlutaMAX Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

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References

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