Summary
超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。
Abstract
神経突起、樹状突起と軸索の両方が、神経細胞間の電気的インパルスの伝導を可能にする神経細胞の細胞プロセスである。神経突起の構造を定義すると、これらのプロセスは、シナプスのコミュニケーションをサポートする材料や信号を移動させる方法を理解することが重要です。電子顕微鏡（EM）は、伝統的に、神経突起内の超微細構造の特徴を評価するために使用したが、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒への曝露は、構造を歪ませることができる。重要な満たされていない目標は、成果物の影響を受けていない構造的な評価を可能にする手順の製剤である。ここでは、成長していると低温電子断層撮影法（クライオ-ET）との試験に続いて、電子顕微鏡グリッド上の別の一次ニューロンのフラッシュ凍結全体の神経突起のための詳細かつ再現性のあるプロトコルを確立している。この技術は、ASSEを容易にする、ナノメートル分解能での凍結、水和した神経突起の3次元視覚化を可能にするその形態学的差異のssment。我々のプロトコルは、後根神経節（DRG）神経突起とそのネイティブに近い状態での海馬神経突起の可視化の前例のないビューが得られます。このように、これらの方法は、通常の神経細胞と神経疾患の影響を受けたものの両方の神経突起上の今後の研究のための基盤を作成します。
Introduction
ニューロンは、下流の神経細胞と通信するために、多くの場合、非常に長い、情報および軸索を受け取るために樹状突起を工夫することにより、中枢神経系および末梢神経系の機能のために複雑な回路が必要不可欠確立。神経突起伸長は、神経突起の胚発生と神経分化やメンテナンス時の基本的な役割を果たしている批判的に神経系の機能をサポートしています。神経突起は、神経の損傷と再生だけでなく、神経系疾患で批判的に備えています。神経細胞の建築の研究では、正常および疾患脳の両方を理解することが重要である。幸いなことに、生理学的に関連する神経細胞培養系は、複雑な異種の細胞構造を再現することができますが存在する。固体実験プラットフォームの解明に基づいて、ニューロン形態の定性的および定量的分析を可能にする効果的な可視化戦略が必要とされている。特に有用なのだろうナノメートルスケールでの神経突起、軸索と樹状突起の両方を可視化するための一貫性のあるプラットフォームを提供し、詳細な方法論であること。
伝統的な電子顕微鏡検査は、それらの真の状態から試験片の歪みを誘発することができ、脱水、包埋樹脂中の有機溶媒の使用を必要とする。従って、4,9,25所見の解釈を制限する-これまでに、ナノメートルスケールで最も構造的特徴付けは、このような過酷な化学物質にさらされる大きな細胞または組織に基づく。また、電子ビームの浸透のために、切片を1μm12よりも大きい厚さを示す生物または細胞の突起に必要です。最後に、神経突起の細長い特徴の面倒な定義を作り、個別のスライスのデータ·セットのコレクション、組織切片または結果を粉砕した。偶数クライオEMのために、凍結した水和試料を切片化することが可能である、本方法は、圧縮を導入ARTIF行為1。
近年では、研究者は、その後、凍結ET 8,10,18,23を使用して神経突起を可視化するために、EMグリッドとフラッシュ凍結して液体エタン中に直接海馬ニューロンを成長させる方法を学びました。しかし、このような研究は、カスタムメイドの装置10,23、または日常可視化8,18ための十分薄いガラス質氷を生成するためのブロッティング手順の欠如詳細を使用するか。例えば、ある研究では、EMグリッド10をブロッティングに30〜40秒を使用することを推奨していますが、この値は、一般的な使用のためではない最適化されたが、そのカスタムメイドプランジ凍結デバイスに固有のものです。プランジ凍結にサンプルを前に湿度を維持するためのカスタムメイドのデバイスではなく、市販の1 17を使用すると、広範囲に再現するためのハードルを提起することができます。
これらの研究は低温ETによって神経突起を視覚化する画期的なされてきたが、我々は、APを探索するためにさらに一歩撮影した神経細胞の標本（海馬および後根神経節ニューロン）の様々なクライオ-ETのplicability。さらに、当社は、最適と部分最適の結果だけでなく、1がそのような標本のためにクライオ-ETの使用中に発生する可能性のある潜在的な成果物の両方を議論する。
ネイティブに近い状態に維持し、ナノメートルスケールでの全神経突起を可視化するための詳細な方法を定義することは、超微細構造の研究を行うことがより研究者のための能力を高めるだろう。この目的のために、我々は、神経突起を可視化するために未定着、非染色ニューロンを調製するために、市販の装置を使用して効果的かつ詳細なプロトコルを記載している。これは健全な神経突起の超微細構造を詳述し、構造的な違いは、神経系の疾患モデルに存在しているかを理解するための基礎を築くために向けた重要な第一歩である。クライオETはナノメートルスケールでの3-Dで固定されていない、無染色の神経突起の機能を解決することができますので、この方法は、それが可能であることはありませんようになります神経炎アーキテクチャ12を定義するための前部。
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Protocol
1。メッキ初代神経細胞のためのEMグリッドの料理を準備する
- 少なくとも25倍の倍率で光学顕微鏡を用いて金のEMグリッド上に穴あきカーボンの整合性を検討する。カーボン穴が> 98％で完全な状態であることを確認してください。
- 一次ニューロンをめっきするため、EMグリッドを火炎殺菌し、同時にそれらを親水性にするブンゼンバーナーを使用しています。その縁ではなく、中央グリッド面積で、EMグリッドを拾うためにピンセットを使用してください。注意：無人点灯ブンゼンバーナーを離れることはありませんし、次の手順を実行している間プラスチック部品に手袋やピンセットを使用していない。
- ブンゼンバーナーを点灯する前に、最低限の開いた位置に空気およびガスの調整を設定します。
- ストライカー火打ち石やブタンライターを使用してブンゼンバーナーを点灯。
- 背の高い、明るい青/紫の炎内の小さな青い内炎を達成するために、空気やガスの調整を変更します。内炎の先端が炎の最も熱い部分である。下のノブバーナーは、バーナーのバレルに入る空気の量を調整するためにオンにすることができるが、バーナーは、バーナー管に入るガスの量を調整するニース。空気調整を時計回りに回すと（紫の炎を生じる）空気を減少させ、反時計回り（黄色の炎を生じる）空気を向上させます。
- カーボン面を上に直面して、二度の炎をすばやく渡すことは、EMグリッドを保持するために金属製ピンセット（NOプラスチック部品）を使用。炭素側はより多くのマット（少ない光沢のある）を表示され、他の側よりも灰色がかった色合いのよりとなります。
- すぐにブンゼンバーナーの10cm以内に置かガラスボトムディッシュの中央にグリッド（カーボン·サイドアップ）を転送。皿当たり1のEMグリッド（ 図1）を使用します。ガンマ線照射を経由して、すなわち、予め滅菌されたガラスボトムディッシュを、のみを使用しています。
- まだガラスボットの中にEMグリッドを維持しながら（完全なカーボン穴）グリッドの整合性をチェックするために光学顕微鏡を使用して、オム皿（汚染を回避するため）。神経細胞と接触するグリッドか何かで任意の物質を適用する場合は、無菌手順及び滅菌ピペットチップを使用しています。
- 無菌手順を用いて組織培養フードでは、ペトリ皿の中央ガラス面積をじっくりと適切なコーティング物質を250μlを適用します。適切なコーティング物質は、全体のEMグリッドをカバーしていることを確認してください。
- 海馬ニューロンについては、先に説明したように19を調製したコーティング物質としてポリ-L-リジン（PLL、1 mg / mlの）を使用する。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。後根神経節（DRG）ニューロンの場合は、次のように準備し、コーティング物質として（材料および試薬の表を参照）エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物を使用しています。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。
- ストックボトルを解凍4℃で一晩エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物
- 氷の上で、それらを維持することによって、すなわち、エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞、溶液を作るために使用されるすべてのコンポーネントが分泌するゼラチン状のタンパク質混合物を、寒さに保つ。
- 氷の上で、1:20希釈を生じる神経基本培地で、このゼラチン状のタンパク質混合物を希釈しながら（ すなわち神経基礎の10ミリリットルにゼラチン状のタンパク質混合物の500μLを希釈）。
- 除算は、1ミリリットルのアリコートにゼラチン状のタンパク質混合物を希釈し、すぐに-20℃で余分な分量を保存する
- 1.4節で説明したように、ディッシュ当たり、EMグリッドごとに250μLを適用します。
- 海馬ニューロンについては、先に説明したように19を調製したコーティング物質としてポリ-L-リジン（PLL、1 mg / mlの）を使用する。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。後根神経節（DRG）ニューロンの場合は、次のように準備し、コーティング物質として（材料および試薬の表を参照）エンゲルブレス-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞から分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物を使用しています。お皿ごとに、250μlのは、EMグリッドごとに必要とされていることに注意してくださいので、それに応じたバッチをスケール。
- そのトップにシャーレをカバーし、組織培養フード内で室温で1時間（どちらかのPLLに伴う海馬の試験片について、またはDRG標本用のゼラチン状のタンパク質混合物で）インキュベートする。
- ASPI（海馬の試料の場合）すべてのPLLまたは皿から（DRG標本用）ゼラチン状のタンパク質混合物を評価する。これを行うために、組織培養フード内の真空システムを使用する。真空管に取り付け、滅菌ピペットチップを使用してください。 EMグリッドとの直接の接触を避ける。
- 注意深くEMグリッドが完全にPBSによって覆われるように、各ペトリ皿の中央のガラス領域内にEMグリッドに滅菌PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を250μlを適用するために調整可能な空気変位ピペットを使用する。次に、各皿からPBSを吸引除去する。 3回繰り返します。
- EMグリッドと料理は15分間組織培養フードの下で乾燥させます。彼らは組織培養室内の光学顕微鏡でチェックすることで、完全に乾燥していることを確認してください。水分の泡がグリッドに存在しないことを確認してください。もしそうであれば、慎重に吸引次のEMグリッドにこの余分な水分を除去する。コーティングされたグリッドは、ニューロンをメッキするため、すぐに使用する必要があります。
2。準備およびP1EMグリッド上に一次ニューロンをating
- 以前に19を説明したように、個々の細胞に海馬（または18日齢のラット胚の後根神経節）を解離させるために一次ニューロンは、まず解剖、トリプシン処理（2.5％トリプシンを使用して）粉砕物をめっきする。
- 粉末化し、特に火仕上げ先端をガラスピペットを使用することにより、個々の細胞に細胞の解離塊を記述するために神経生物学者によって使用される一般的な用語です。結果は慎重にゆっくりとピペットを介して（〜30）、上下に、複数回のセルを描画し解放することによって達成される。
- マウスに適していますが示唆酵素（パパイン、コラゲナーゼ/ディスパーゼ）を使用するのではなく、ラットDRGニューロンを隔離する（HBSS中）0.25％トリプシンを使用するようにノートを取って、以前にDRGの切開および細胞単離24に記載された手順に従ってくださいDRGニューロン。
- （ つまり、血球計数器を用いて）単離された神経細胞の数を計算するそしてディッシュあたり50,000個の細胞/ mlの濃度を達成するために、各皿の細胞に適用する適切な体積を計算するためにこの値を使用する。適用する最大音量は250μLです。これが唯一のセントラル硝子エリア全体ではなく、お皿を埋めることに注意してください。
- 37℃のCO 2インキュベーターで30分間インキュベート皿細胞が回復して接着させる。
- ゆっくりと、EMグリッドを乱さないように注意しながら、各皿に温めメディアの1.5ミリリットルを追加。メディアの種類は、細胞型（海馬もしくはDRG）に依存する。
- 海馬ニューロン19又は使用前に37℃の水浴中で加温することにある後根神経節ニューロン24のいずれかのための適切なメディアを準備する。 CO 2インキュベーター内で一晩の料理をインキュベートする。
- 海馬ニューロンの場合は、翌日のメディアを変更してください。 14日間、2日毎以降のメディアの半分を変更します。使用前に37℃ の水浴中で媒体を温める。 DRGニューロン、解剖/メッキ、翌日、別々に、それぞれの10mMストック溶液を作製抗有糸分裂剤（ウリジン5'-フルオロ-2'-デオキシウリジン）とメディアの新鮮なストックを調製するために、最終的に使用それぞれについて、10μMの濃度。 DRGメディア（875μL）の半分を取り外し、抗有糸分裂薬との新鮮な培地875μlを加える。
- DRGニューロンでは、第一週を2日おきには、別の抗有糸分裂メディアと標準のDRGのメディア間でメディアを変更する。二週間、2日ごとに標準のDRGメディアを変更。
3。 EMグリッド上に神経細胞をガラス化
- 湿度室17とガラス化装置のガラス化マシンのファインポイント特殊なピンセット、長いフラットポイントピンセット、液体窒素のデュワー（S）（LN：機器、極低温に金のEMグリッドを凍結保存するためのすべての材料を準備します2）あり、coolantコンテナは、EMグリッドストレージボックス、カルシウムを含まないフィルター紙。
- ガラス化デバイスを起動します。 32℃に100パーセントと温度に湿度を設定する「コンソール」セクションでは、ゼロ秒にブロット時間を設定します。これは、ガラス化マシンの湿度室の側窓から手動ブロッティングを可能にします。
- 3用紙が積層されているように、それらを重ね、手袋とカルシウムを含まない、ろ紙を処理します。 〜2cmの長さである0.5センチメートル幅のストリップにスタックをカット。紙の一辺が0.5センチメートル×0.5センチメートル面（ 図2）を有するように90°の角度で曲がり、これら。ピンセットを使用して、中紙を取り外し、使用するまで、別のカルシウムを含まない、ろ紙の上に置きます。
- ガラス化チャンバー内のボタンホルダーにグリッドストレージボタンを配置。液体窒素で冷却液の容器の内部チャンバーを記入し、完全に蒸発するまで待ちます。目の外室を埋める液体窒素でのE冷媒容器、それが次のステップに進むための安定した温度に達するまで。冷却された室内に液体状態に凝縮した高純度ガス状のエタンと内側室を埋める。
- すぐ近くの中にガラス化室への輸送のための大規模な100ミリメートルポリスチレンディッシュに培養器からディッシュ（ES）を移動、そうでない場合。慎重に皿からのEMグリッドを選択する特殊なガラス化ピンセットを使用してください。ニューロンは、EMグリッド上に成長されている側に注意してください。位置は、次のステップのために重要ではあります。しっかりとEMグリッド上ピンセットをロックするピンセットに黒いスライドロックを使用してください。
- ガラス化マシンニューロンが離れてガラス化機械の側開口穴から、左に顔を付着した上で、EMグリッドのようにサイドにピンセットを挿入します。ガラス化機械に特化したピンセットを撤回。
- 適切なホルダーに冷媒容器を置きますガラス化マシンの。それは、十分なLN 2と液体エタンで満たされるべきである。それは湿度室の底でフラッシュされるまでガラス化マシンの適切な画面のコマンドを使用して、上方向に冷媒室を上げる。
- 平坦な点ピンセットで、短辺（0.5センチメートル×0.5センチメートルの面）がピンセットに対して垂直になるように、濾紙の一端を把握する。この面では（ 図2B）をブロッティングのためのEMグリッドと直接接触することになる。慎重にガラス化マシンの湿度室（ 図2A）の側穴にフィルター紙を挿入します。安定的に10秒間（側が試料から離して向いている）、EMグリッドに対する紙を開催しています。その後、紙を破棄して、すぐにガラス化マシンの自動化を使用して液体エタン中で試料をプランジ凍結。
- 丁寧に一つのスロットのいずれかに凍結した水和のEMグリッドを転送グリッドストレージのボタン。皿で追加のEMグリッドのためのプロセスを繰り返します。これらの実験で使用したEMグリッドストレージ·ボタンは、複数の凍結水和EMグリッドを格納することができる。
4。画像収集、処理、および注釈
- 2-D型電子顕微鏡写真および/ または低用量条件下で低温電子顕微鏡を用いて神経突起の3-Dのチルト系列5を収集するように進む。 2-D画像は3-Dのチルト系列のために有用であると氷の厚さおよび可能な領域の点でグリッドの質を評価することを意図した。
- この場合、すべての画像は/ 7程度と4.4オングストロームのサンプリングのアンダーフォーカスターゲットで20K顕微鏡の倍率で、シングルチルト液体窒素クライオ転写ホルダーを装備した200 kVの電子顕微鏡に装着4K X 4K CCDカメラを用いて収集したピクセル。
- 徐々にサンプルらを傾けながら、サンプルの3D断層像を得るためには、投影画像のシリーズを取る透過型電子顕微鏡（TEM）の一つの軸オング。チルト角や他の実験的な設定を考慮すると、自動的にチルトシリーズ5を収集するために利用できる複数の異なるソフトウェアがあります。ここに示した3-Dチルト一連〜60電子/Å2の累積線量で5℃刻みで60°〜-60°の範囲にわたって半自動チルト系列取得ソフトウェア26を使用して、同じ顕微鏡で収集した。
- 以前に他のサンプル5,29について記載したように画像処理ソフトウェア21を使用して、神経突起の傾き系列を再構成する。
- 最初の断層像をセグメント化し、以前に記載のように5 3-D画像処理ソフトウェアを用いた表面モデルを作成することにより、神経突起の3-Dの機能カラー·アノテーション。
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Representative Results
クライオET経由凍結イメージング、光学顕微鏡像の前には、神経細胞が成長しているのEMグリッドの注意が必要です。神経突起は、互いにかなりの重複せずにはっきりと見えるはずです。 図3Aのカラーボックスは、ズームインされる神経突起グリッドの格子を横切って延びている図3Bのより高い倍率を表示するために領域を表す。各グリッド正方形は、神経細胞とその神経突起をサポートする穴あきカーボン膜で構成されている。これらの穴は外側に突出し神経突起、そこから比較的大きく、暗い、電子密度の高い物体（ 図3C）、などのニューロン体を示している4K倍率で撮影された低用量低温電子顕微鏡画像で明らかである。
炭素の穴の上に載って神経突起の一部は、図3Cに着色されたボックスで選択し、ズームアップ高倍率（20K）で、図3Dにされている。このプロトコルに従うことによって生成されるように、この倍率では、微小管、小胞、ミトコンドリアなどの明確な内部細胞構造は、特に最適に薄い氷で、（ 図3D）を明確に明らかなはずである。画像の中心（ 図3D）中の濃い黒の構造は汚染とみなされ、典型的には避けるべきである六角形の氷粒子であるが、それらは非常にまばらで神経突起自体の外側にあることを考えると、それらは干渉しない復興と分析と解釈のための内部構造（ 図4）の色アノテーション。神経突起は、いくつかの2-D画像を撮影してデジタルモンタージュ（ 図6）を生成する画像処理ソフトウェアを使用して一緒にステッチすることができ、その後、配置することが可能な他の低用量、低倍率画像は、 図5に示されている。
初期EMグリッド上にニューロンの低メッキ濃度は、（プレート50,000個/ ml）、その神経突起（ 図3C）の明確な可視化を確保するために十分に離れて配置されている神経細胞を可能にし、推奨値よりも濃度が高い（>プレート当たり50,000細胞/ mlの）細胞成分（ 図7B及び7C）をトレースするか、属性することは困難である混雑した神経突起の次善の画像になることがあります。
図1。ガラスボトムディッシュ内のEMグリッド上にニューロンを成長させるためのスキーム。（A）ガラスボトムディッシュの一部の細胞培地（ピンク）が充填され、示されている。拡大図は明らかのように、（B）それぞれの料理は、1金のEMグリッドが含まれています。 Eの（C）コーティングポリリジンとMグリッドは、漫画の側面切欠として示されている。ガラスボトムディッシュは、もともと底部から切り出した円形の開口部を覆うプラスチック培養皿の底部に取り付けられている正方形のカバーガラスで構成されている。これらのガラスボトムディッシュは、ガンマ滅菌し、商業的に既成のように買っています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。付着したニューロンと、EMグリッドを手動でブロッティングするための概略。（A）のガラス化マシンのスライド入口スロット（黒い矢印）のクローズアップ湿度/ピンセット、手動で試料をブロットするために挿入されるチャンバを、ブロッティング。 （B）（×0.5センチの顔0.5cmに）どのようにカルシウムを含まない、ろ紙を示す漫画のスキームは、ニューロンいるのEMグリッドをブロッティング用フラットポイントピンセットを使用して処理してガラス化機械の湿度室に入口スロットを介して挿入する必要があります（ピンク細胞培地の液滴を図示）が付着している。 EMグリッドは湿度室内部に微細な点の特殊なピンセットで保持されている。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。金型電子顕微鏡（EM）グリッド上に凍結し、水和ニューロンを可視化する。（A）光顕微鏡画像ラット初代ニューロンはグロされているその上にEMグリッドの中央領域の10X倍率で2週間の翼。 （B）中のニューロン（A）に示すようアクアボックス、を考慮して、ズームし、その神経突起の投影が見える（ピンクの矢印）である。ニューロン体（赤い矢印）から外側に突出した神経突起の4K倍率で（C）電子顕微鏡写真。模式的に、（B）に示す格子正方形の1以内の領域（赤枠IE）に対応しています。神経突起の内部の機能は明らかに20Kの倍率で表示されている場合、青色のボックスは、（D）にクローズアップしてみた（緑色の矢印ミトコンドリア、オレンジの矢印微小管、ベシクル青色の矢印）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。ラットDRG軸索断層像の3次元再構成と注釈。（A）を一度DRG軸索の異なる傾斜角で撮影された画像の再構成されたスタックからトモスライス。 （B）は 、同じ軸索の3次元注釈を対応する拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。 4K倍率で軸索投射（赤箱）とラットDRGニューロン（中央左）の2次元低温電子顕微鏡像。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図6。シングルラットDRG軸索の4 2次元低温電子顕微鏡画像のモンタージュ。各画像は、20Kの倍率で撮影された。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図7。神経突起の2次元低温電子顕微鏡像（A）ラットDRG軸索近い細胞体に近接して画像化した。オーバー混雑EMグリッド上に神経細胞の高メッキ集中による神経突起のの（B、C）の例。すべての神経突起は、金、EMグリッド上にめっき後の瞬間凍結2週間でした。すべての画像は20Kで行った;。拡大拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図8。 1海馬神経突起の異なる傾斜角で撮影された画像の再構成されたスタックからラット海馬神経突起の断層像の3次元再構成と注釈。（A）トモグラフィースライス。 （B）は 、同じ神経突起の3次元注釈を対応する拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
我々は、ラット胚性ニューロン（後根神経節および海馬）は金電子顕微鏡（EM）グリッド上に成長した2-DクライオEM及び3-Dクライオを用いて撮像されるそれらの神経突起のために十分に薄いガラス質氷中で凍結することができることを示してET。海馬の神経突起が以前に凍結ET 8,10,18,23を使用して画像化してきたが、市販の装置を使用して正常なレプリケーションのための十分な詳細なプロトコルが欠けていた。彼らの研究は、海馬の神経突起を可視化するためのクライオ-ETの使用を開拓しているが、さらに、我々の研究は、神経標本の複数のタイプにクライオ-ETの適用可能性を探る。
ここでは、EMが最適に薄い氷を達成するためにそれらを吸い取り、海馬および後根神経節（DRG）ニューロンのいずれかでグリッド準備詳細なプロトコルを記述し、プランジ凍結クライオ-ETによる撮影のためにそれらを。最適なブロッティング時間は、氷中で電子ビームが貫通するために厚すぎもたらさないものであるガラス質氷が穴あき炭素の端から穴あき炭素の最も内側に著しく異なる勾配で表示されていることも薄すぎる。さらに、ガラス化マシン17を使用してを通じて最適に薄い氷を達成することは、プロジェクトごとに若干異なる場合があり、ガラス化機を使用して堅牢な凍結は、学習曲線を要求することがあります。
これまでの研究は、海馬神経細胞に焦点を当てても、我々の研究では、ここで検討されたが、我々は低温を使用する前に画像化されたことがない、後根神経節（DRG）の完全な、凍結した水和全体軸索のナノメートルスケールで画像を表示するために、さらに行っているEMまたはクライオ-ET。彼ら（海馬ニューロンとは対照的に）が排他的に軸索34を生じさせるので、DRG細胞を選択した。 cryo-EM/cryo-ETことによって、それらを画像化するためのプロトコルは、感覚神経細胞、すなわち軸索超微細構造を推定する興味のある人のために便利である可能性があります。我々も存在し、同様に、最適かつ次善の両方の結果を議論する1は、そのような標本のためにクライオ-ETの使用中に発生する可能性のある潜在的な成果物として。
適切な細胞濃度（ディッシュ当たり50,000個の細胞/ mlで）では、ニューロンの間隔は、神経突起が、グリッドの正方形あたりに現れる1つまたは2つのニューロン（ 図3B）の光および電子顕微鏡検査（ 図3Aおよび3B）を用いて、優れたアクセスを可能にするようなものである。ニューロン間の十分な分離を可能にすると、低温電子顕微鏡（ 図3Cおよび3D）を介して神経突起の明確な可視化のために必要である。低温電子顕微鏡像（ 図3Cおよび3D）ではっきりと見られるように、神経細胞とその神経突起は、金の格子の穴あきカーボン膜でサポートされています。 Vのための典型的なように、海馬ニューロンおよび後根神経節（DRG）ニューロン30,33の低温電子顕微鏡を用いた撮像用厚すぎると、完全に黒くするため15〜50ミクロン〜ごとに異なることができますニューロン機関、ERY電子密度の高いオブジェクトと厚い標本、神経突起の比較的薄型化予測と比較して、（直径1ミクロンを超えない）、それらから放射（ 図3Cおよび5）。
樹脂包埋した3-Dの脳組織は、断面14で完全に円形で神経突起を明らかにしない、実際には、それらの形態は可変である。神経突起の非円形形状は、天然または試料調製アーチファクトである場合、それは、このように知られていない。 TEMグリッド上に成長したDRG軸索（ 図4）の測定された厚さは、0.32のz方向の程度（ガラス質氷の深さ）および0.53μm単位の平均幅であっブロットし、この研究で示されるように結像さxy平面。海馬神経突起の測定された厚さTEMグリッド上に成長させた（ 図8）は 、ブロットし、この研究で示されるように画像形成された（ガラス質氷の深さ）は、z方向に0.50であったとXY平面内で0.72ミクロンの平均。彼らはブロッティング、プランジ凍結プロセスの全体のプロセスの間に、元のバッファに水和したままであったが、本明細書に記載されブロッティングプロセスは、神経突起を平らにできた。
cryoETによって観察されるよう、グリッド上での神経突起のわずかな平坦化はほぼ完全に円形であり、脱水の兆候を示さないようなここに示すように小胞のような、内部の構成要素の構造に影響を与えるとは思われない。対照的に、一般に「伝統的な」EM製剤、エタノール中で脱水し、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドで固定特に化学で使用される化学プロセスは、制御されない組織の収縮をもたらす。このような有害な細胞効果に遭遇する可能性は、我々の原稿にcryoETために本方法で解消される。
さらに、我々の神経突起のサンプルはすぐに私は、その結果、液体エタンに突入、凍結したnstant硝子氷の中に「埋め込む」。ガラス状態で凍結された組織は、より生理的な状態と同様、他の技術よりも表示されます。超微細構造の詳細レベルは、我々のプロトコルに記載された技術は、神経科学の研究者に貴重であることができます唯一の態様ではない。それは別の下で神経細胞の超微細構造を調べるの可能性を開くためのEMグリッド上に神経細胞を成長させる技術は、すぐにブロッティング/プランジ凍結cryoETによるスクリーニング/画像化のためにガラス状態に維持するために彼らは魅力的な手法である遺伝的、化学的または環境的潜在的な脱水アーティファクトの心配なしに強調している。
凍結前にブロッティング条件は、このプロトコルで詳述されるように、例えば、ミトコンドリア、小胞および微小管（ 図4、図6のような内部構成要素を含む超微細構造の特徴のクライオETによる可視化のために十分に薄い氷を生成するために重要である7A）。それらは低温電子断層撮影法20を介して（マウス胚線維芽細胞の縁）細胞で見られたものと構造的に類似して見えるため、ミトコンドリアは、例えば、我々の調製物中で同定することができた。それらはまた、本稿で存在する3-Dの色アノテーション付与画像で見ることができるクリステを表示する。次善の画像は、低温電子顕微鏡像が神経突起内のミトコンドリアと微小管などの機能を正常に識別を防止し、一般的に不透明な表示される厚い氷に起因することができます。特に、ほぼ確実に神経突起8,10,17,23の超微細構造を定義する上で限られた成功に貢献し、最適に薄い氷を生成する方法については、このような標本を調製するための十分な詳細がないこと。
神経突起の過密になり、次善の画像も（>皿に50,000個/ ml）をグリッド上であまりにも多くの神経細胞をプレーティングに起因し得る、（ 図0; 7Bおよび7C）。ぼやけた画像は、誤ったデフォーカスの結果である可能性が調整されている必要があり、ここで示されている画像内のフォーカスは、7μmの対象とアンダーフォーカスで撮影された。画像は、高いコントラスト及び超微細構造の特徴の視認性を確保するために、そのフォーカスを収集したが、下側デフォーカス（ すなわち、2〜3ミクロン）はまた、そのような特徴の高解像度の詳細を得るために使用することができる。
他の要因は、次善の画像に寄与することができる。それはガラス化装置の他の特徴、特に半自動ブロッティング特徴ではなく、本明細書に記載の手動ブロッティングを使用することが魅力的であり得るが、例えば、これは望ましくない結果を与えた。両面ブロッティングは、最初は（ユーザーではなく）ガラス化マシンが直接使用者によって指定された時間とブロットの数をブロッティングなどのパラメータを使用してサンプルをブロットした、この半自動化機能を使用して実行しようとしました。しかし、AFター撮像ようなサンプルは、全てのニューロンが、その内容（多小胞体など ）こぼれる、オープン溶解していることがわかった。従って、ガラス化機械は最高のサンプルは凍結を突入する前にブロットされた、その温度制御可能な湿度チャンバーこの場合に用いられる。 （100％に近い湿度に設定して）、このような状態で試料を維持することは、製造の間に水の損失を最小限に抑え、最適なガラス質氷凍結後3,7を確実にするのに役立つ。
理想的には、外部摂動に対するニューロンの曝露を最小限にするため、それらはガラス化装置のある部屋に近接してCO 2インキュベーター（37℃に設定された温度）であり、この装置用の温度で増殖されるべきではに設定する必要が37℃の前にフラッシュ凍結EMグリッド上にニューロンをする。一つは、前ブロッティングに大きな温度変動に神経細胞をさらすことは避けてください。本報告書では、温度を32℃に設定した目的をブロッティングするため、神経細胞は、さまざまな建物の中に増殖させ、約10分の時間の経過は、別の部屋からのニューロンのプレートを運ぶの間に発生した。ケア、輸送プロセスの間に耐水性、半断熱容器内のサンプルを保護するように注意した。同様の温度変化とCO 2濃度は、（前ブロッティング/プランジ凍結するニューロンが経験したように）、そのメディアはバイオセーフティでは変更するためのニューロンは、インキュベーション室から取り出されるごとに1〜2日間のニューロンに起こるフードは、通常、神経細胞培養のために行われているように。これは、細胞に毒性効果をもたらすことが見られない。
神経突起「ミトコンドリア内電子密度の高い顆粒のように見えるものの存在に関しては、いくつかの相反する報告が存在する。このような顆粒は、異なる様々な組織ではなく、具体的には神経細胞に見出される。彼らは内部のイオンを調整カチオンのシンクとして認識されているエンミトコンドリアの環境。彼らはまた、酵素が効率的に機能することができる16れる内側と外側のミトコンドリア膜間の接触部位を作り出すように見える。
実験的研究は、これらのイオンが流体入浴単離されたミトコンドリアまたは無傷細胞のいずれかに存在する場合、カルシウムと他の二価の陽イオンがミトコンドリア内に蓄積することを示す。これは、イオンが有機的に既存のミトコンドリア内顆粒にバインドされている可能性が表示されます。なお、これらの顆粒はミトコンドリア31の内部イオン環境の制御にリンクされていることを、そのため、提案されている。
我々の調製物中のニューロンを14日間EMグリッド上に培養したさらに、のタイミングが前の低温電子顕微鏡/ ETによる撮像への神経突起伸長15,36の目的のために典型的である。これは、淵と比較して高齢のニューロンにおける細胞内カルシウム濃度の劇的な増加があることが報告されている gが32ニューロン。したがって、これらの高齢者の神経細胞の神経突起におけるミトコンドリアは、ストレスの兆候として、必ずしもミトコンドリア顆粒を表示するであろうが、むしろ、彼らは細胞内カルシウムの高い存在感を持っているからだ。もっともらしいことです
電子密度の高いミトコンドリア顆粒はまた、培養で増殖させ、私たちの原稿20で用いたのと同じ技術（低温電子断層撮影法）により撮像されたマウス胚線維芽細胞で報告されている。これらの細胞は、細胞質の細胞骨格破壊および空胞形成などの細胞損傷に伴う超微細構造の変化の典型的なパターンを示さなかった。 cryoETにより可視化同様に、私たちの神経突起の中に、我々はそうでない細胞毒性と関連するであろう混乱細胞骨格を観察しなかった。上記の注意事項を考えると、我々は我々の準備のニューロンはストレスや毒性の結果としてミトコンドリア顆粒を示さなかったと結論付けている。
コンテンツ ">ニューロンへの汚染を防止するために、EMグリッド表面を殺菌するために、また、前の神経細胞をプレーティングするEMグリッドをフレーミング、ポリ-L-リジンを接着することができるためにEMグリッド上に良好な、親水性表面を生成することが見出されたそれはバイオセーフティーフード内でより長い時間（ 例えば 、20〜30分）のために、グリッドの照射を必要とするため、有利で あること。紫外線殺菌が選ばれていませんでした。グローいるときに、グリッドは、環境に再び再公開する必要があるでしょう - 排出される。グリッドをグロー放電グリッドの表面を親水化する目的のためには、それが親水化工程及び滅菌工程の両方を兼ね備えているため、その後のポリリジンコーティンググリッドにだろう効果的に 'スティック'。グリッドを燃えるの技術が有利であることが保証さ一方の初代ニューロン腫瘍系細胞株よりも感受性であることが知られており、可能な限り無菌ようにその環境（グリッド、ペトリ皿）を維持するために重要であるている。図3Cおよび図5）において低倍率の画像を撮影することが好ましい画像れる神経突起。次いで、2-Dの低温電子顕微鏡の画像の間隔で採取することができ、デジタルモンタージュ（ 図6）に縫い合わせ。この技術は、単一の低温電子顕微鏡像よりも大きい領域にわたって、例えば、微小管の超微細組織として機能するために有用であり得る。
低用量、低倍率の画像を撮影する（ 図3Cおよび5）も（ホール及び炭素の両方を横切る）穴あきカーボン膜を横切る直径が一致している神経突起の領域を同定するのに有用であり、したがって、より理想的なイメージングのためのそしてその後の分析。カーボン膜の穴の上の神経突起の拡大は、一般的に、より大きなneurに見られるITESシンナー神経突起（ 図3C）よりも明らかにそれ以上の内部材料とします（ 図5）。この現象は、カーボン膜の穴に物理的支持の欠如のために起こると考えられる。 EMグリッドがニューロンが成長された皿から除去し、続いて裏面からブロットされたとき、他の（ 図3C）よりも内部の塊（ 図5）は、神経突起の穴に展開および/ またはサグする傾向がある。これがアーチファクトであると思われるが、それはより明確に神経突起の内部構成を示しするような利点を有する。この穴あきカーボンフィルム上に重ね連続した炭素膜を使用すると、将来の研究でこの問題を回避するのに役立ち得る。この設定は、最初はしようとしましたが、イメージングのため厚すぎ硝子氷をもたらした。 EMグリッド上に重ね連続炭素の異なる厚さとのその後の試験では、さらなる調査が必要な場合があります。
重要現在の方法の重要な利点は、神経突起内の細胞成分の空間的構成は、異なる傾斜角での単一の神経突起のいくつかの2-D画像を撮影し、断層像に画像の本スタックを再構成することにより、ナノメートルスケールで可視化できることである。ラットE18後根神経節（DRG）の軸索のために示したように、個々の構造的特徴は、手動で（材料および試薬の表を参照）、適切なソフトウェアを使用して、異なる色の3次元スタックの各2次元スライスのために注釈を付けることができますニューロン（ 図4）およびラットE18海馬ニューロンの神経突起（ 図8）。
むしろ、1又は2°よりも、傾斜シリーズ中に画像ごとに5度をとるために選択することによって、より少ない画像が収集されるが、より高い電子線量は、画像ごとに使用することができる。これは、より高いコントラストと、RAW画像内のノイズが少なく、その結果。これは1、STなどの相互相関による再構成（位置合わせの目的のために優れている EP）およびz方向に断層像のスタックを含む各画像についての手によって行われる後続の断層画像アノテーション、。増分サイズを選択することも、試料のサイズに依存し、異なる傾斜角の間で、より大きな標本は、あまり変化はありません。この場合、より大きな増分サイズ（5°）を使用することにより、神経突起の比較的大きな試料サイズに対してより好適であると考えられた。
さらに、必要に応じて、EMグリッドに基準の金マーカーを追加すると、精細な画像の位置合わせのために支援するだろう。サンプルは、他の低温電子顕微鏡試料（単離中のウイルスまたはタンパク質）と比べて比較的大きく、2-D画像のそれぞれの適切な位置合わせのために使用され得る構造的特徴の様々な高いコントラストを示したので、基準マーカを使用しなかった相互相関によって、（3-Dスタックを含む）。得られた画像スタックがよく、このアプローチを使用して整列し、その後の3-Dの色アノテーションに使用可能した。
エネルギーフィルタを顕微鏡を用いて、将来の研究のためにENTは ">、非弾性散乱電子によるノイズを減らすことができるが、そのような機能は、ほとんどの電子顕微鏡施設で容易に入手できない場合があります。私たちの手順では、画像は、標準的な200 kVの顕微鏡の結果何ができるかを明らかに無エネルギーフィルタと、その大で神経科学のコミュニティへのより一般的に利用可能である。ここで説明するプロトコルは、低温電子顕微鏡と低温ET用の市販の装置を使用して両方のラット胚性DRG軸索および海馬神経突起を作製し、可視化するために最適化されています。この技術の主な利点の1つは、微粉砕またはそれらの超微細構造を表示するために、種々の化学試薬により処理し、切片化しない、全神経突起から構造情報を得ることである。私たちは、クライオETは影響を調べるための近いツー·天然状態のニューロンの将来の超微細構造の解析に使用するのに特に優れた方法であるかを証明した神経突起の構造上の神経疾患の。
本論文は以下のように報告されているように3次元断層像のための電子顕微鏡データバンクアクセッション番号は以下のとおりです。ラット海馬神経突起の場合EMDB、（8:45-9:01）から図8に、メインのビデオに示すようにアクセッション番号は、EMD-5887です。 図4および（9:02-9:15）からメインのビデオに示すように、ラットの後根神経節神経突起の場合は、EMDBの受託番号はEMD-5885です。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、NIHの助成金（PN2EY016525とP41GM103832）によって支えられてきた。 SHSは湾岸コンソーシアム（NIH認可番号T32EB009379）の学際的バイオサイエンス教育のためのWMケックセンターのナノバイオロジー学際大学院教育プログラムからの交わりによってサポートされていました。
SHSは、解剖し成長し、DRGおよび海馬細胞をガラス化し、低温電子顕微鏡およびDRGと海馬軸索の凍結ETデータを収集し、再構成され、チルトシリーズは色注釈付き。 MRGを切開し、MNRの研究室での海馬細胞を提供した。 SCは、チルトシリーズ注釈を支援。 SHSは、神経細胞を分析し、成長する方法についてのCWで訓練された。 SHS、WCMとトイレは実験を考案。 SHSは他の著者からの入力に原稿を用意しました。
このビデオは、TのBiozentrumの細胞イメージングとNanoAnalyticsセンター（C-シーナ）で撮影されました大学バーゼル彼。 C-シーナは、スイスのバーゼルに位置連邦工科大学チューリッヒのバイオシステムズ科学工学部門（D-BSSE）に統合されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
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