Summary
미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.
Abstract
신경 돌기, 모두 수상 돌기 및 축색 돌기는 뉴런 사이의 전기 자극의 전도를 가능하게 신경 세포 과정이다. 신경 돌기의 구조를 정의하는 것은 이러한 과정이 시냅스 통신을 지원 자료 및 신호를 이동하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 전자 현미경 (EM)는 전통적으로 신경 돌기 내의 미세 기능을 평가하는 데 사용되었습니다 있지만, 탈수 및 수지 매립시 유기 용제에 노출 구조를 왜곡 할 수 있습니다. 중요한 충족 목표는 유물의 영향을받지 구조 평가를 허용 절차의 수립이다. 여기, 우리는 성장하고 극저온 전자 단층 촬영 (크라이 ET)과의 시험 다음에 전자 현미경 그리드에 다른 차 신경의 플래시 냉동 전체의 신경 돌기에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설립했다. 이 기술은 ASSE 용이 나노 미터 분해능에서 냉동 수화 신경 돌기의 3-D 시각화를 허용자신의 형태 학적 차이 ssment. 우리의 프로토콜은 후근 신경절 (DRG) 신경 돌기, 그들의 네이티브에 가까운 상태에서 해마의 신경 돌기의 시각화의 전례가없는보기를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 방법은 정상적인 신경 세포와 신경 장애에 의해 영향을 사람들 모두의 신경 돌기에 미래 연구를위한 기초를 만들 수 있습니다.
Introduction
뉴런은 다운 스트림 신경과 의사 소통을하기위한 정보와 축삭, 종종 아주 긴을받을 모 수석을 정교화하여 중앙과 말초 신경계의 기능에 대한 복잡한 회로의 핵심을 설정합니다. 신경 돌기 가지 신경계의 비판적 기능을 지원 배아 발달과 신경 세포의 분화 및 신경 돌기의 유지 보수 동안 근본적인 역할을한다. Neuritic 과정은 신경 세포의 손상 및 재생뿐만 아니라, 신경계 장애에 비판적 있습니다. 신경 세포의 구조의 연구는 모두 정상 및 병에 걸린 뇌를 이해하는 것이 중요합니다. 다행히, 생리학 관련 신경 세포 배양 시스템은 복잡하고 이질적인 세포 구조를 요점을 되풀이 할 수있다. 고체 실험 플랫폼, 신경 세포의 형태의 정성 및 정량 분석을 가능하게 효과적인 시각화 전략의 해명에 따라 필요합니다. 특히 유용한 것나노 미터 스케일에서 신경 돌기, 축삭과 수상 돌기 모두를 시각화하기위한 일관성있는 플랫폼을 제공하는 자세한 방법합니다.
기존의 전자 현미경은 그들의 진정한 상태에서 시험편에 왜곡을 유도 할 수있는 탈수 수지 매립 중에 유기 용매의 사용을 필요로한다. 따라서 연구 결과 4,9,25의 해석을 제한 - 현재까지 나노 미터 스케일에서 가장 구조적 특성 분석은 이러한 가혹한 화학 물질에 노출되는 더 큰 세포 또는 조직을 기반으로합니다. 더욱이, 전자빔 침투, 절편은 1 내지 12 ㎛보다 큰 두께를 나타내는 생물체 또는 세포 돌기 요구된다. 마지막으로, 신경 돌기의 신장 기능의 성가신 정의하고, 개별 슬라이스 특정 데이터 세트의 컬렉션에 조직의 결과를 단면 또는 가공. 비록 극저온-EM위한 냉동 수화 시험편을 구획하는 것이 가능하는, 상기 방법은 압축 ARTIF 도입1 역할을합니다.
최근 몇 년 동안, 연구자들은 EM 그리드 및 플래시 동결 이후 크라이 ET 8,10,18,23를 사용하여 신경 돌기를 시각화하는 액체 에탄을 직접 해마의 신경 세포를 성장하는 방법을 배웠습니다. 그러나, 이러한 연구는 맞춤 장치 10,23, 또는 일상적인 시각화 (8, 18) 얇은만큼 유리 같은 얼음을 생성하는 모래 바닥 단계에 부족 세부 사항을 사용 하나. 예를 들어, 한 연구는 EM 그리드 (10)를 모래 바닥에 대한 30 ~ 40 초를 사용할 것을 권장하지만,이 값은 일반적으로 사용하지 최적화되어 있지만, 사용자 정의 - 만든 플 런지 냉동 장치에 대해 특정입니다. 플 런지 동결하는 샘플을 이전의 습도를 유지하기위한 사용자 정의 만든 장치가 아닌 시중에서 한 17를 사용하여 광범위한 재현성에 대한 장애물을 초래할 수 있습니다.
이 연구는 극저온 ET으로 신경 돌기를 시각화에 획기적인되었지만, 우리는 AP를 탐험 한 단계 더 촬영했습니다신경 세포의 표본 (해마와 후근 신경절 신경 세포)의 다양한 크라이 ET의 plicability. 또한, 우리는 최선과 차선의 결과뿐만 아니라, 하나는 시편 크라이 ET를 사용하여 발생할 수있는 잠재적 이슈를 모두 설명합니다.
네이티브에 가까운 상태로 보존하고 나노 미터 규모로 전체의 신경 돌기를 시각화에 대한 상세한 기술을 정의하는 것은 미세 구조 연구를 수행하기 위해 더 많은 연구에 대한 능력을 향상시킬 것입니다. 이를 위해, 우리는 신경 돌기를 시각화하는 정착, 흠 뉴런을 제조 시판 장비를 이용하여 효율적이고 상세한 프로토콜을 설명한다. 이것은 건강한 신경 돌기의 미세 구조를 자세히 설명하고 구조적 차이가 신경계 질병 모델에 존재하는 것을 이해하기위한 토대를 마련하기 위해 향한 중요한 첫 번째 단계입니다. CRYO-ET는 나노 미터 스케일에서 3-D에 고정되지 않은, 흠없는 신경 돌기의 기능을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 가능한 결코로하게 될 것입니다neuritic 건축 (12)를 정의하는 앞.
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Protocol
1. 도금 차 뉴런을위한 EM 그리드와 요리 준비
- 적어도 25 배의 배율로 광학 현미경을 사용하여 금 EM 그리드에 구멍 투성이의 탄소의 무결성을 검사합니다. 확인 탄소 구멍은> 98 % 그대로 유지되어 있는지 확인하십시오.
- 기본 뉴런 도금의 경우, EM 격자를 화염 살균 동시에 그 친수성 렌더링하는 분젠 버너를 사용합니다. 가장자리가 아닌 중앙 그리드 화 면적으로 EM 그리드를 데리러 핀셋을 사용합니다. 주의 : 자동 조명 분젠 버너를 두지 마십시오, 이러한 단계를 수행하는 동안 플라스틱 부품에 장갑이나 핀셋을 사용하지 마십시오 :
- 분젠 버너를 점화하기 전에 최소한의 개방 위치에 공기 및 가스 조정을 설정합니다.
- 스트라이커 부싯돌 또는 부탄 라이터를 사용하여 분젠 버너에 불을.
- 키도 크고, 밝은 블루 / 바이올렛 불꽃 내 작은 파란색 내부 불꽃을 달성하기 위해 공기 및 가스 조정을 수정합니다. 내부 불꽃의 끝이 불꽃의 가장 뜨거운 부분입니다. 아래의 손잡이버너의 총신이 공기가 버너 들어가는 양을 조절하기 위해 설정 될 수있는 반면 니스 버너, 가스 버너 튜브들이의 양을 조절한다. 공기 조절 시계 방향으로 돌리면 (보라색 불꽃의 결과로) 공기를 감소하고 반 시계 방향 (노란색 불꽃이 발생) 공기를 증가시킨다.
- 탄소면이 위로 향하도록 두 번 불꽃을 통해 신속하게 전달, EM 그리드를 개최 금속 핀셋 (아무 플라스틱 부품)를 사용. 탄소 측 무광택 (이하 반짝)를 표시하고, 다른 쪽보다 칙칙한 색조의 더 많은 것을 가진 것입니다.
- 즉시 분젠 버너의 10cm 이내에 배치 된 유리 바닥 접시의 중심으로 그리드 (탄소 쪽까지)를 전송합니다. 접시 당 하나의 EM 그리드 (그림 1)를 사용합니다. 만 presterilized하는 유리 바닥 요리, 즉 통해 감마 방사선을 사용합니다.
- 여전히 유리 BOTT 내부의 EM 그리드를 유지하는 동안 그리드 무결성 (탄소 구멍 그대로)을 확인하기 위해 광학 현미경을 사용하여OM 접시 (오염을 방지하기 위해). 신경과 접촉 할 그리드 또는 아무것도에 어떤 물질을 적용 할 때, 멸균 절차 및 멸균 피펫 팁을 사용합니다.
- 멸균 절차를 사용하여 조직 문화 후드에서, 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 차분히 적절한 코팅 물질의 250 μl를 적용합니다. 적절한 코팅 물질이 전체 EM 그리드를 포함해야합니다.
- 해마의 신경 세포의 경우, 이전에 19 바와 같이 제조 코팅 물질로서 폴리-L-라이신 (PLL, 1 ㎎ / ㎖)을 사용한다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. 후근 신경절 (DRG) 뉴런의 경우, 다음과 같이 준비, 코팅 물질로 (재료 및 시약의 표 참조) Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 젤라틴 단백질 혼합물을 사용합니다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다.
- 주식 병을 녹여4 ℃에서 하룻밤 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물의
- 차가운 유지 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포 및 얼음에 그들을 유지하여 즉, 솔루션을 만드는 데 사용되는 모든 구성 요소에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물.
- 얼음, 1:20 희석액을 수득 Neurobasal 배지에서 젤라틴이 단백질 혼합물을 희석하면서 (즉 Neurobasal 10 ㎖에 젤라틴 단백질 혼합물의 500 μL 희석).
- 나누기는 1 ㎖ 분량 씩에 젤라틴 단백질 혼합물을 희석하고, 즉시 -20 ℃ 여분의 분량 씩 저장
- 1.4 절에 설명 된대로, 접시 당, EM 그리드 당 250 μl를 적용합니다.
- 해마의 신경 세포의 경우, 이전에 19 바와 같이 제조 코팅 물질로서 폴리-L-라이신 (PLL, 1 ㎎ / ㎖)을 사용한다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. 후근 신경절 (DRG) 뉴런의 경우, 다음과 같이 준비, 코팅 물질로 (재료 및 시약의 표 참조) Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 젤라틴 단백질 혼합물을 사용합니다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다.
- 상단에 페트리 접시를 덮고 (해마 시편 하나 PLL과 함께, 또는 DRG 표본의 젤라틴 단백질 혼합물) 배양 조직 문화 후드에서 실온에서 1 시간 동안.
- ASPI(해마 표본에 대한) 모든 PLL 또는 요리에서 (DRG 시편) 젤라틴 단백질 혼합물을 평가. 이를 위해, 조직 배양 후드에서 진공 시스템을 사용한다. 진공 튜브에 부착 된 멸균 피펫 팁을 사용합니다. EM 그리드와의 직접적인 접촉을 피하십시오.
- 주의 깊게 EM 그리드가 완전히 PBS에 포함되도록 각 페트리 접시의 중앙 유리 지역에 EM 그리드에 멸균 PBS (인산염 완충 식염수)의 250 μl를 적용하는 조정 가능한 공기 변위 피펫을 사용합니다. 그런 다음 각 접시에서 PBS를 대기음. 3 회 반복합니다.
- EM 그리드와 함께 요리를 15 분의 조직 문화 후드에서 건조하도록 허용합니다. 그들은 조직 문화 방에있는 광학 현미경으로 검사하여 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. 반드시 그리드의 수분 기포가 없는지 확인합니다. 이 경우,주의 깊게 대기음 다음 EM 그리드에이 여분의 수분을 제거한다. 코팅 된 그리드는 신경을 도금 즉시 사용되어야한다.
2. 준비 및 PLEM 그리드에 ating 차 뉴런
- 이전 19 설명한 바와 같이, 각각의 세포에 해마 (또는 18 일 된 쥐 배아의 후근 신경절을) 해리 기본 뉴런, 첫 해부를 Trypsinize (2.5 % 트립신을 사용하여) 씹다를 판에.
- 씹다 특히 화재 연마 팁 유리 피펫을 사용하여, 각각의 세포로 세포의 해리 덩어리를 설명하는 신경 생물 학자에 의해 사용되는 일반적인 용어입니다. 결과는 조심스럽게 천천히 피펫을 (~ 30), 상하, 여러 번 세포를 그리기 및 방출에 의해 달성된다.
- 마우스에 대한 더 적합한 제안 효소 (파파인, 콜라게나 / 디스 파제)를 사용하는 대신, 쥐 DRG 뉴런을 분리 (HBSS에) 0.25 % 트립신을 사용하여 메모를 복용 등의 이전에 DRG의 해부 및 세포 분리 (24)에 대해 설명한 절차에 따라 DRG 뉴런.
- (즉 혈구를 사용하여) 절연 뉴런의 수를 계산및 접시 당 50000 세포 / ml의 농도를 달성하기 위해 각 접시에 적용하는 세포의 적절한 부피를 계산하기 위해이 값을 사용한다. 적용 할 수있는 최대 볼륨이 250 μL이다. 이것은 단지 중앙 유리 영역 전체가 아니라 요리를 채우는 것에주의.
- 37 ℃의 CO 2 배양기에서 30 분 동안 접시를 품어 세포를 복구하고 준수 할 수 있습니다.
- 천천히 EM 그리드 방해가되지 않게주의하면서 각각의 요리에 가온 미디어 1.5 ML를 추가합니다. 미디어 유형은 세포 분류 (해마 또는 DRG)에 의존한다.
- 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 예열하는 해마의 신경 세포 19 또는 지느러미 루트 신경절 신경 세포 (24), 중 하나에 해당하는 매체를 준비합니다. CO 2 배양기에서 하룻밤 요리를 품어.
- 해마 신경 세포의 경우, 다음날 미디어를 변경합니다. 14 일 동안 이틀 이후 미디어의 절반을 변경합니다. 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 미디어를 따뜻하게. DRG 뉴런의 경우, 해부 / 도금 다음 날, 항 유사 분열 제 (우리 딘 5' - 플루오로-2'-데 옥시 우리 딘) 개별적으로, 각각 10 mM의 원액을 가진 매체의 신선한 재고를 준비, 최종를 사용 각각 10 μM의 농도. DRG 미디어 (875 μL)의 절반을 제거하고 항 유사 분열 제와 신선한 매체 875 μl를 추가합니다.
- DRG 뉴런를 들어, 첫 번째 주에 대한 매 2 일, 다른 항 유사 분열 미디어 및 표준 DRG 미디어 사이에 미디어를 변경. 둘째 주 들어 이틀 표준 DRG 미디어를 변경합니다.
3. EM 그리드에 신경을 유리화
- 극저온에서 금메달 EM 그리드 냉동 및 저장 장비와 모든 재료를 준비 습도 챔버 (17)와 유리화 장치, 액체 질소의 유리화 기계, 긴 평탄 점 핀셋, 듀어 (들)에 대한 좋은 점 전문 핀셋 (LN 2), Coolant 용기, EM 그리드 스토리지 박스, 칼슘 무료 필터 종이.
- 유리화 장치를 시작합니다. 32 ° C.에 100 % 및 온도에 습도를 설정 "콘솔"섹션에서 0 초로에 오점 시간을 설정합니다. 이 유리화 기계의 습도 챔버의 사이드 창을 통해 블로 팅 매뉴얼을 할 수 있습니다.
- 세 논문이 누적되는 등을 레이어드, 장갑 칼슘 무료 필터 용지를 처리 할 수 있습니다. ~ 2cm 긴 0.5 cm 폭 스트립으로 스택을 잘라. 용지 한면이 × 0.5 cm의 얼굴 (그림 2) 0.5 cm가되도록 90 ° 각도를 구부린다. 핀셋을 사용하여, 중간 종이를 제거하고 사용할 때까지 다른 칼슘 무료 필터 종이에 놓습니다.
- 유리화 챔버 내에서 버튼 홀더에 그리드 스토리지 버튼을 놓습니다. 액체 질소를 냉매 용기의 내부 챔버를 입력하고 완전한 증발 될 때까지 기다립니다. 일의 외부 챔버를 채우액체 질소와 E 냉매 용기는 다음 단계로 진행하기 위해 안정적인 온도를 달성 할 때까지. 냉각 된 챔버 내에서 액체 상태로 응축됩니다 고순도 가스 에탄과 내부 챔버를 입력합니다.
- 바로 인근에 유리화 방에 수송을위한 대형 100mm 폴리스티렌 접시에 인큐베이터에서 접시 (들) 이동하지 않을 경우. 조심스럽게 접시에서 EM 그리드를 선택하는 전문 유리화 핀셋을 사용합니다. 뉴런은 EM 그리드에 성장하는 쪽면에, 위치는 다음 단계에 문제가됩니다. 안전하게 EM 그리드에 핀셋을 잠 핀셋 블랙 슬라이딩 잠금 장치를 사용합니다.
- 유리화 기계 신경 세포가 떨어져 유리화 기계의 사이드 오픈 구멍에서 왼쪽으로 얼굴을 부착되어있는 EM 그리드 등 그 옆에 핀셋을 삽입합니다. 유리화 기계로 전문 족집게 후퇴.
- 해당 홀더에 냉각수 용기를 올려유리화 기계. 그것은 적절한 LN 2와 액체 에탄으로 가득해야합니다. 이 습도 챔버의 하부로 플러시 될 때까지 유리화 기계의 적절한 화면 명령을 이용하여, 상향 냉각제 챔버를 올린다.
- 평탄 점 핀셋, 짧은 쪽 (0.5 센티미터 × 0.5 cm 얼굴) 핀셋에 수직이되도록 필터 종이의 한쪽 끝을 잡고. 이 얼굴 (그림 2B)를 모래 바닥에 EM 그리드와 직접 접촉한다. 조심스럽게 유리화 기계의 습도 챔버의 측면 구멍 (그림 2A)에 종이 필터를 삽입합니다. 안정적으로 10 초 동안 (측면 멀리 표본에서 마주) EM 그리드에 대한 용지를 개최합니다. 이후 용지를 취소하고 즉시 유리화 기계의 자동화를 사용하여 액체 에탄의 표본을 뛰어 동결.
- 조심스럽게 하나의 슬롯 중 하나에 냉동 - 수화 EM 그리드 전송그리드 스토리지 버튼. 요리의 추가 EM 그리드에 대해이 과정을 반복합니다. 이 실험에서 사용 된 EM 그리드 저장 버튼 체류 냉동 - 수화 EM 그리드를 저장할 수있다.
4. 이미지 수집, 처리, 및 주석
- 2-D의 전자 현미경 사진 및 / 또는 저용량 조건 극저온 전자 현미경을 사용하여 신경 돌기의 3-D 틸트 시리즈 5를 수집 진행. 2-D 이미지는 3-D 틸트 시리즈 편리하게 얼음 두께 및 가능 영역의 관점에서 그리드의 품질을 평가하도록 하였다.
- 이 경우, 모든 이미지 / 12 μM 및 4.4의 샘플링 언더 포커스 대상에서 20K 현미경 배율에서 단일 경사 액체 질소 크라이 전사 홀더를 구비 한 200 kV의 전자 현미경에 부착 된 4K X 4K CCD 카메라를 사용하여 수집되었다 픽셀.
- 증분 샘플 AL 틸팅 동안 샘플의 3 차원 단층 화상을 얻기 위해서는, 투영 이미지의 시리즈를 취할투과형 전자 현미경 (TEM)의 하나의 축 옹. 틸트 각도와 다른 실험 설정을 감안할 때, 자동으로 틸트 시리즈 5를 수집 사용할 수있는 여러 가지 다른 소프트웨어가있다. 여기에 표시된 3 차원 기울기 시리즈는 ~ 60 E / 2의 누적 복용량을 가진 5 ° 씩 60 ° -60 °의 범위에서 반자동 기울기 시리즈 수집 소프트웨어 (26)를 사용하여 동일한 현미경에 수집되었다.
- 앞서 다른 샘플 5,29 대해 기재된 화상 처리 소프트웨어 (21)를 사용하여 신경 돌기의 틸트 시리즈를 재구성.
- 제 단층 화상을 분할하기 이전에 5 바와 같이 3-D 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 표면 모델을 작성하여 신경 돌기의 3-D 기능 색깔 주석.
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Representative Results
이전 크라이 ET를 통해 동결 및 이미징, 광학 현미경 이미지는 신경 세포가 성장하고있는 EM 그리드주의해야한다. 신경 돌기가 서로 상당한 중복하지 않고 명확하게 볼 수 있어야합니다. 그림 (a)에 색 상자가 확대 된에 신경 돌기가 격자의 격자에 걸쳐 확장되는 그림 (b)에서 높은 배율을 표시하는 영역을 나타냅니다. 각 그리드 사각형은 뉴런과 자신의 신경 돌기를 지원하는 구멍 투성이의 탄소 필름으로 구성되어있다. 이 구멍은 외부 프로젝트를 신경 돌기있는 비교적 큰, 어두운, 전자 밀도가 높은 물체 (그림 3C)와 같은 신경 세포의 시체를 보여줍니다 4K 배율에서 찍은 저용량 크라이 EM 이미지에 분명하다.
탄소에 구멍 위의 신경 돌기 휴식의 일부는 그림 3C에서 컬러 상자에서 선택하고, 확대 된 그림 3D의 높은 배율 (20K)에있다. 이 프로토콜에 따라 생성되는이 배율로, 미세 소관, 소포, 미토콘드리아 등의 명확한 세포 내부의 구조는 특히 최적의 얇은 얼음에 (그림 3D) 명확하게 알 수있을 것이다. 이미지의 중심 (도 3d)의 어두운 블랙 구조는 오염으로 간주되어 전형적 피해야 육각형 얼음 입자되어 있지만, 그들은 매우 희박한 및 신경 돌기 자체의 외부에있는 점을 감안 그들이 방해하지 재구성 및 분석과 해석 (그림 4)의 내부 구조의 색상 주석. 신경 돌기가 몇개 2-D 이미지를 찍은 디지털 몽타주 (도 6)를 생성하는 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 함께 스티칭 될 수있는 한 후에 위치 될 수있는 또 다른 저용량, 저배율 이미지는,도 5에 도시된다.
초기EM 그리드에 신경 낮은 도금 농도 (플레이트 50,000 세포 / ml)은 자신의 신경 돌기 (그림 3C)의 명확한 시각화를 보장하기 위해 충분히 멀리 떨어져 간격이 신경을 허용, 접시 당 (> 50,000 세포 / ml 권장 농도보다 높은 ) 세포 구성 요소 (그림 (b)와 (c))를 추적 또는 속성이 어려운 붐비는 신경 돌기의 만족스럽지 못한 이미지가 발생할 수 있습니다.
그림 1. 유리 바닥 요리를 내 EM 그리드에 신경을 성장을위한 계획. (A) 유리 바닥 요리는 부분적으로 세포 미디어 (핑크)로 가득 표시됩니다. 자세히보기는 계시로 (B) 각각의 요리는 1 골드 EM 그리드가 포함되어 있습니다. E의 (C) 코팅폴리 라이신과 M 그리드는 만화 사이드 장면 전환으로 표시됩니다. 유리 바닥 접시 원래 바닥 잘라내었다 원형 개구를 덮는 플라스틱 배양 접시의 바닥에 부착된다 정사각형 유리 커버 슬립으로 구성된다. 이러한 유리 바닥 요리는 감마 멸균 및 상업적으로 이미 만들어진 상태로 구입합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. EM의 수동 블로 팅을위한 회로도 부착 뉴런 메쉬. 핀셋 수동으로 표본을 지워 버리 삽입 할 수있는 습도 / 블로 팅 챔버에 유리화 시스템의 슬라이딩 항목 슬롯 (검은 색 화살표)의 (A) 근접. (B)칼슘 프리 여과지 (0.5 cm 0.5 cm 얼굴 X) EM 그리드를 블로 팅을 위해 유리화 기계의 습도 챔버에 평면 포인트 핀셋을 사용하여 처리하고 엔트리 슬롯을 통해 삽입되는 방법을 나타내는 만화 방식되는 뉴런 (핑크 세포 미디어의 물방울이 표시) 부착된다. EM 그리드는 습도 챔버 내부의 미세 점 전문 핀셋으로 개최됩니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 쥐의 기본 뉴런 촉진제되었습니다있는 EM 그리드의 중앙 지역의 10 배 배율 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 냉동, 수화 신경을 시각화. (A) 라이트 현미경 이미지을 2 주 동안 날개. (B) 줌 인 (A)에 도시 된 아쿠아 상자의보기,하는 신경과 자신의 신경 돌기 돌기 (분홍색 화살표) 볼 수 있습니다. 신경 세포의 본체 (빨간색 화살표)에서 바깥쪽으로 돌출 신경 돌기의 4K 배율 (C) 전자 현미경 사진. 개략적으로 (B)에 나타낸 그리드 사각형 중 하나의 거리를 이동하는 인근 지역 (빨간색 상자 즉)에 해당합니다. 신경 돌기의 내부 기능을 명확하게 20K 배율로 볼 수있는 곳 파란 상자가, (D)에 근접 볼 (녹색 화살표 미토콘드리아, 주황색 화살표 미세 소관, 소포 파란색 화살표). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 쥐 DRG 축삭 단층 촬영의 3 차원 재구성 및 주석. (A) 한 DRG 축삭의 다른 틸트 각도에서 촬영 한 이미지의 재구성 스택에서 단층 촬영 조각. (B) 같은 축삭의 3-D 주석을 해당. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 4K 배율 축삭 돌기 (빨간색 상자)와 쥐 DRG 신경 세포 (중앙 왼쪽)의 2-D 크라이 EM 이미지. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 하나의 쥐 DRG 축삭의 네 개의 2-D 크라이 EM 이미지의 몽타주. 각 이미지는 20K 배율로 촬영했다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. 신경 돌기의 2-D의 CRYO-EM 이미지. (A) 쥐 DRG 축삭 가까이 근접의 셀 소마에 몇 군데. (B, C) 오버 밀집 신경 돌기의 인해 EM 그리드에 뉴런의 높은 도금 농도의 예. 모든 신경 돌기 금 EM 그리드에 도금 후 플래시 냉동 이주했다. 모든 이미지는 20K에서 찍은;. 확대 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 8. 한 해마의 신경 돌기의 다른 틸트 각도에서 촬영 한 이미지의 재구성 스택에서 쥐의 해마 신경 돌기 단층 촬영의 3 차원 재구성 및 주석. (A) 단층 촬영 조각. (B) 같은 신경 돌기의 3-D 주석을 해당. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
우리는 쥐의 배아 신경 (척수 신경절 및 해마는) 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 성장 및 2-D cryo 종 및 3-D의 극저온을 사용하여 몇 군데되는 자신의 신경 돌기에 충분한 얇은 유리 같은 얼음에 고정 할 수 있다는 것을 보여 ET. 해마의 신경 돌기 이전 크라이 ET 8,10,18,23을 사용하여 몇 군데되었지만, 프로토콜이 부족 한 상업적으로 사용 가능한 장치를 사용하여 성공적으로 복제 충분히 상세한. 그들의 연구는 해마의 신경 돌기를 시각화 크라이 ET의 사용을 개척하고있는 동안 또한, 우리의 연구는 신경 세포의 표본 하나 이상의 유형을 알아내는-ET의 적용 가능성을 탐구한다.
여기, 우리는 EM 최적 얇은 얼음을 달성하기 위해 그들을 모래 바닥, 해마 및 후근 신경절 (DRG) 뉴런 하나와 그리드 준비에 대한 자세한 프로토콜을 설명하고 플 런지 냉동 크라이 ET으로 이미징을. 최적 블롯 시간은, 관통하는 전자 빔을 위해 너무 두꺼운 얼음을 초래하지 않는 하나이다나 유리 같은 얼음 구멍 투성이의 탄소의 가장 안쪽에 구멍 투성이의 탄소의 가장자리에서 특히 다른 그라데이션 너무 얇은 나타납니다. 또한, 유리화 기계 (17)의 사용을 통해 최적의 얇은 얼음을 달성하는 것은 각 프로젝트에 다소 차이가있을 수 및 유리화 기계를 사용하여 강력한 동결은 학습 곡선을 필요로 할 수 있습니다.
이전의 연구는 또한 우리의 연구는 여기에 탐구 해마 신경 세포에 초점을 맞추고있는 동안, 우리는 후근 신경절 (DRG)의 손상, 냉동 수화 전체 축삭의 나노 미터 스케일로 이미지를 보여주고 더 나아가 한, 사용하기 전에 몇 군데되지 않습니다 크라이을 EM 또는 크라이 ET. 그들은 (해마 뉴런 달리)이 독점적 축삭 34 야기 이후 DRG 세포를 선택 하였다. cryo-EM/cryo-ET하여 그들을 이미징 프로토콜은 감각 신경의 축삭 즉 미세 구조를 추론 관심이있는 사람들을 위해 도움이 될 수 있습니다. 우리는 또한 현재와 최적의와 차선을 모두 결과를 논의뿐만 아니라,하나는 시편 크라이 ET를 사용하여 발생할 수있는 잠재적 유물 등.
적절한 세포 농도 (접시 당 50,000 개 세포 / ml), 뉴런의 간격은 신경 돌기는 하나 또는 두 개의 뉴런 그리드 사각형 (도 3b) 당 나타나는로 (도 3a 및도 3b) 광학 및 전자 현미경을 사용하여 우수한 접속을 허용하도록 인 . 뉴런 사이에 충분한 간격을 허용하면 극저온 EM을 통해 신경 돌기의 명확한 시각화 (그림 3C 및 3D)가 필요합니다. CRYO-EM 이미지 (그림 3C 및 3D)에서 명확하게 볼 때 신경과 그 신경 돌기가 금 그리드의 구멍 투성이의 탄소 필름에서 지원됩니다. V에 일반적으로, 해마의 뉴런과 후근 신경절 (DRG) 뉴런 30,33가 극저온 EM을 사용하여 영상이 너무 두꺼운 완전히 검은 색 표시에 대한 15 ~ 50 μm의 ~ 다를 수 있습니다 신경 세포의 시체,ERY 전자 밀도가 높은 물체와 두께의 표본, 그들로부터 방사 (안 직경 1 마이크로 미터 초과) 신경 돌기의 비교적 얇은 돌기에 비해 (그림 3C 및 5).
수지 - 내장 된 3-D의 뇌 조직은 단면 (14)에 완전히 원형이다 신경 돌기를 공개하지 않으며, 사실, 그 형태는 변수입니다. 신경 돌기의 비 원형 형상은 자연 또는 견본 준비 유물 경우에 따라서 알 수 없습니다. TEM 그리드에 성장 DRG 축삭 (그림 4)의 측정 된 두께는 0.32 z 방향 μm의 (유리 같은 얼음의 깊이)와 0.53 μm의에서의 평균 폭이었다 도말이 연구에서와 같이 이미지가 xy 평면. 해마 신경 돌기의 두께를 측정 TEM 그리드에 성장 (그림 8), 도말이 연구에서와 같이 몇 군데 (유리 같은 얼음의 깊이) Z-방향으로 0.50 ㎛, 및XY 평면에서 0.72 μm의 평균. 그들은 블롯 및 플 런지 냉동 과정의 전체 과정에서 원래의 버퍼에 수화 남아 있지만, 여기에 기술 된 바와 같이 블로 팅 프로세스는 신경 돌기를 평평하게 할 수 있습니다.
여기에 그림과 같이 cryoET에 의해 관찰 그리드에 신경 돌기의 약간의 평탄화는 거의 완벽하게 원형이며, 탈수의 징후를 표시하지 않는 등 소포와 같은 내부 성분의 구조에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 보통 '전통적인'EM 제제, 에탄올 탈수 하였다 글루 타르 알데히드 및 파라 포름 알데히드 특히 화학적 고정에 사용되는 화학적 과정은 조절되지 않는 조직의 수축을 초래할. 이러한 손상 세포의 효과를 발생의 가능성은 우리가 우리의 원고에 cryoET 위해 제시하는 방법으로 제거된다.
또한, 우리의 신경 돌기의 샘플은 곧바로 결과, 액체 에탄의 플 런지 동결했다nstant 유리체 얼음에 '삽입'. 유리체 상태에서 냉동 조직이 훨씬 더 유사한 생리적 인 상태로 다른 기술보다 나타납니다. 미세 세부 사항의 수준은 우리의 프로토콜에 설명 된 기술은 신경 과학 연구자들에게 도움이 될 수 있습니다 유일한 부분이 아니다. 그것은 다른에서 신경 세포의 미세 구조를 조사의 가능성을 열어 때문에 EM 그리드에 신경을 성장의 기술은 바로 모래 바닥 / 플 런지 냉동 cryoET에 의한 심사 / 이미징 유리질 상태로 유지하기 위해 그들에게 매력적인 기술이다 유전, 화학 물질 또는 환경 잠재적 인 탈수 유물의 걱정없이 강조한다.
이전 동결에 블로 팅 조건은,이 프로토콜에 설명 된대로, 같은 미토콘드리아, 소포와 미세 소관 (그림 4, 6, 내부 구성 요소를 포함하여 미세 기능의 극저온 ET로 시각화를 위해 충분히 얇은 얼음을 생성하는 것이 중요합니다 7A). 그들은 극저온 전자 단층 촬영 (20)을 통해 (마우스 배아 섬유 아 세포의 가장자리) 세포에서 볼 수있다 것과 구조적으로 유사하게 나타납니다 때문에 미토콘드리아는, 예를 들어, 우리의 준비에서 확인 할 수있다. 또한이 원고에 존재하는 3-D 칼라 - 주석 이미지에서 볼 수있는 cristae 표시. 만족스럽지 못한 이미지는 cryo 종의 이미지가 신경 돌기 내의 미토콘드리아와 미세 소관과 같은 기능을 성공적으로 식별 방지, 일반적으로 불투명 한 표시되는 두꺼운 얼음에서 발생할 수 있습니다. 특히 거의 확실 신경 돌기 8,10,17,23의 미세 구조를 정의하는 제한적인 성공에 기여하고, 최적의 얇은 얼음을 생산하는 방법에 대한 이러한 표본을 준비하기위한 충분한 정보의 부족.
차선의 이미지도 신경 돌기 (도표의 인구 과잉을 초래하는, (> 50,000 접시 당 세포 / ml) 그리드에 너무 많은 신경을 도금에서 발생할 수0; (b) 및 (c)). 흐릿한 이미지가 잘못 디 포커스의 결과 일 수 있고, 조정해야합니다, 여기에 표시된 이미지의 디 포커스 7 ㎛의 대상 언더 포커스로 촬영했다. 이미지는 높은 콘트라스트와 미세 기능의 가시성을 보장하기 위해이 디 포커스에 수집하지만, 낮은 디 포커스 (즉, 2 ~ 3 μm의)도 같은 기능의 높은 해상도의 세부 정보를 얻을 수 있습니다.
다른 요인 차선 이미지에 기여할 수있다. 이 유리화 기계, 특히 반자동 블로 팅 기능보다는 본원에 기술 설명서 블롯의 다른 기능을 사용하도록 유혹 될 수 있지만 예를 들어, 이것은 바람직하지 않은 결과를 주었다. 양면 블롯은 초기 (오히려 사용자가 아닌) 유리화 기계가 직접 사용자에 의해 지정된 시간과 말의 개수 블로 팅 등의 파라미터를 사용하여 샘플을 도말 한이 반자동 기능을 사용하여 시도 하였다. 그러나, AF터 영상 등 샘플, 모든 신경이 그 내용 (multivesicular 기관 등) 쏟아져 오픈 용해했습니다. 따라서, 유리화 기계는 유용한 샘플 동결 돌입하기 전에 도말 된 그 온도 제어 항습기이 경우에 사용된다. (100 %에 가까운 설정 습도) 이러한 상태에서 샘플을 유지하는 것은 준비하는 동안 수분 손실을 최소화하고 보장하는 데 도움이 최적의 유리체 얼음 후 냉동 3,7입니다.
이상적으로, 외부 교란에 대한 신경의 노출을 최소화하기 위해, 그들은 유리화 기계와 함께 방 부근에서 CO 2 배양기 (37 ° C로 설정 온도),이 장치의 온도에서 재배되어야한다로 설정해야합니다 37 ° C 이전에 플래시 동결하는 EM 그리드에 신경을. 하나는 이전에 블로 온도의 큰 변동에 신경을 노출하지 않도록해야합니다. 이 보고서에서, 온도는 32 ° C로 설정목적을 모래 바닥에, 뉴런은 다른 건물에서 성장했다 10 분 ~의 시간이 경과 한 방에서 다른 뉴런의 접시를 들고 사이에 발생했습니다. 케어 수송 과정 중에 내수성, 반 절연 용기에 시료를 보호하기 위해 수행 하였다. 자신의 미디어가 바이오 안전성에서 변경할 수 있도록 신경을 배양 챔버 반출 할 때 온도와 CO 2 농도의 유사한 변화는 (이전의 블로 팅 / 플 런지 동결에 신경 경험으로)마다 1 ~ 2 일 신경에 발생 후드는, 일반적으로의 연결을 문화에 대해 수행 될 때. 이것은 세포에 독성 효과를 결과로 볼 수 없습니다.
전자 밀도가되는 신경 돌기 '미토콘드리아 내에서 과립을 표시 무엇의 존재에 대한 몇 가지 충돌 보고서는 존재한다. 이러한 과립은 서로 다른 조직의 다양한하지 특별히 신경 세포에서 발견된다. 그들은 내부의 이온을 조절 양이온의 싱크대로 인식되어 EN미토콘드리아의 환 경. 또한 효소가 효율적으로 16 작동 할 수있는 내부 및 외부 미토콘드리아 막 사이의 접촉의 사이트를 만들 것으로 보인다.
실험 연구는 이러한 이온 액 (fluid) 격리 된 미토콘드리아 또는 손상 세포 하나에 존재하면 칼슘 및 기타 가의 양이온이 미토콘드리아에 축적 것을 나타냅니다. 은 이온이 유기적으로 기존의 내 미토콘드리아 과립에 바인딩 된 가능성이 나타납니다. 이것은 이들 과립은 미토콘드리아 (31)의 내부 이온 환경 규제에 연결되어 있는지, 따라서 제안된다.
또한, 우리의 준비에 신경이 14 일 동안 EM 그리드에 배양의 타이밍은 사전 cryoEM / ET에 의해 영상에 신경 돌기 가지 15,36의 목적을 위해 일반적입니다. 그것은 이윤에 비해 세 뉴런 세포 내 칼슘 농도의 급격한 증가가있는 것으로보고되었다 G (32) 신경. 따라서, 그들이 세포 내 칼슘의 높은 존재감을 가지고 있기 때문에 이러한 세 뉴런의 신경 돌기의 미토콘드리아가 반드시 스트레스의 표시로, 오히려 미토콘드리아 과립을 표시한다고 그럴듯.
전자 밀도가 미토콘드리아 과립도 문화 성장하고 원고 (20)에서 사용되는 동일한 기술 (크라이 전자 단층 촬영)에 의해 촬영 마우스 배아 섬유 아 세포에서보고되었다. 이 세포는 세포질의 골격 중단 및 공포 화 등의 세포 손상과 관련된 미세 구조 변화의 전형적인 패턴을 보여주지 않았다. cryoET에 의해 시각과 마찬가지로, 우리의 신경 돌기 내에서, 우리는 달리 세포 독성과 연관 될 것이다 중단 세포 골격을 준수하지 않았다. 위의 고려 사항을 감안할 때, 우리는 우리의 준비에 신경이 스트레스 또는 독성의 결과로 미토콘드리아 과립을 표시하지 않았다고 결론을 내린다.
내용 "> 신경 세포에 오염을 방지하기 위해 EM 그리드 표면을 살균하고, 또한 이전에 신경을 도금 EM 그리드 불타는, 폴리-L-라이신을 준수 할 수 할 수있는 EM 그리드에 유리한, 친수성 표면을 생성하는 것은 발견 빛이 될 때 유용 할 수 있습니다.는 바이오 안전성 후드 긴 시간 (예 : 20 ~ 30 분)에 대한 그리드의 조사를 필요로하기 때문에 UV 살균이 선택되지 않았습니다. 다음, 그리드 환경에 또 다시 노출 될 필요가있을 것이다 - 배출된다. 그리드를 글로우 방전 그리드의 표면을 친 수화의 목적 것은 친 수화 단계 및 멸균 공정을 결합 이후 후속 폴리 라이신 코팅 그리드 것 효과적으로 '스틱'. 그리드 불타는의 기술은 유익하다고 보장 한. 차 신경 종양 기반의 세포 라인보다 더 민감한 것으로 알려져 있으며, 가능한 한 무균으로 자신의 환경 (그리드, 페트리 접시)를 유지하기 위해 매우 중요합니다.(도 3C 및 5)에서, 저배율 이미지를 촬영하는 것이 바람직하다 이미지있는 신경 돌기 . 그런 다음, 2-D 크라이 EM 이미지 간격으로 수행 할 수 있으며, 디지털 (그림 6) 몽타주에 함께 물렸다. 이 기술은 하나의 CRYO-EM 이미지보다 더 큰 영역에 걸쳐, 이러한 미세 소관 기관 등의 미세 기능을 유용 할 수 있습니다.
저용량, 낮은 배율 이미지 (그림 3C 및 5) 촬영 (구멍과 탄소에 걸쳐 모두) 및 이미징 따라서 더 이상 구멍 투성이의 탄소 필름에서 직경이 일치 신경 돌기의 영역을 식별에 유용합니다 이후의 분석. 탄소 필름의 구멍을 통해 신경 돌기의 영상 확대는 일반적으로 큰 neur에서 볼 수있다ITES 얇은 신경 돌기 (그림 3C)보다 분명히 더 많은 내부 소재 (그림 5). 이러한 현상으로 인해 탄소막의 구멍 물리적 지원의 부족으로 발생하는 것으로 생각된다. EM 그리드는 신경 세포가 성장했다있는 접시에서 제거하고,이어서 뒷면에서 도말 할 때, 다른 사람보다 더 많은 내부 질량 (그림 5) (그림 3C)와 신경 돌기가 구멍으로 확장 및 / 또는 강하하는 경향이있다. 이 이슈가 될 것으로 보인다 있지만, 그것은 더 명확하게 신경 돌기의 내부 구성 요소를 표시하는 등의 이점이 있습니다. 이 구멍 투성이의 탄소 필름에 중첩 연속 탄소 필름을 사용하여 미래의 연구에서이 문제를 회피하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 설정은 처음 시도하지만 영상이 너무 두꺼운 유리 같은 얼음 귀착되었다. EM 그리드에 중첩 연속 탄소의 두께가 다른 후속 시험은 추가 조사가 필요할 수 있습니다.
impor입니다현재 메서드의 TANT 혜택은 신경 돌기 내의 세포 구성 요소의 공간 조직이 서로 다른 기울기 각도에 하나의 신경 돌기의 여러 가지 2-D 이미지를 복용하고, 단층 촬영으로 이미지의이 스택을 재구성하여 나노 미터 스케일에서 시각화 할 수 있다는 것입니다. 쥐 E18의 후근 신경절의 축삭 (DRG)에 나타낸 바와 같이 각각의 구조적 특징은 수동 (재료 및 시약의 표 참조) 적절한 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 색으로 3-D 스택의 각 2-D 슬라이스에 대한 주석이 될 수있다 신경 세포 (그림 4)와 쥐 E18 해마 신경 세포의 신경 돌기 (그림 8).
오히려 1 ~ 2 °보다, 틸트 시리즈 동안 이미지마다 5도를 취할 선택하여 적은 수의 이미지를 수집하고 있지만 높은 전자 용량은 이미지 당 사용할 수 있습니다. 이것은 높은 콘트라스트와 RAW 이미지에 더 적은 소음 발생합니다. 이것은 하나의 성으로 상호 상관에 의해 재건 (정렬의 목적을 위해 더 낫다 EP) 및 Z-방향으로 단층의 스택을 각각 포함하는 이미지에 의해 직접 수행되는 후속 단층 주석. 증분 크기를 선택하는 것이 아니라 시료의 크기에 따라, 서로 다른 경사각 사이의 큰 표본은 많이 변화하지 않을 것이다. 이 경우에, 더 큰 증분 사이즈 (5 °)를 사용하여 인해 신경 돌기의 비교적 큰 표본 크기에 더 적합한 것으로 생각 하였다.
원하는 경우 또한, EM 그리드에 기준점 골드 마커를 추가하는 좋은 이미지의 정렬에 도움이됩니다. 샘플 다른 극저온-EM 샘플 (격리에서 바이러스 또는 단백질)에 비해 상대적으로 큰이었고 2-D 이미지들의 각각의 적절한 정렬을 위해 사용될 수있는 구조적인 특징의 다양한 높은 콘트라스트를 보였다 때문에 기준 마커가 사용되지 않았다 상호 - 상관에 의해 (3-D 스택을 포함). 결과 이미지 스택은 물론이 방법을 사용하여 정렬 및 이후 3-D 칼라 주석위한 유용한 하였다.
엔트 "> 미래 연구의 경우, 에너지 필터를 현미경을 사용하여 탄력적으로 흩어져 전자 있지만, 이러한 기능은 대부분의 전자 현미경 시설에서 쉽게 사용하지 못할 수도 있습니다으로 인한 소음을 줄일 수 있습니다. 우리의 절차는 이미지가 표준 200 kV의 현미경에서 발생할 수있는 것을 보여 없는 에너지 필터, 어떤 큰의 신경 과학 커뮤니티에 더 일반적으로 사용할 수 있습니다.여기에 설명 된 프로토콜을 준비하고 cryo 종 및 극저온 ET를위한 상용 장비를 사용하여 쥐의 배아 DRG 축삭과 해마의 신경 돌기를 모두 시각화에 최적화되어 있습니다. 이 기술의 주요 이점 중 하나는 절개하지 전체 신경 돌기의 구조 정보, 그 미세 구조를 확인하기 위해 분쇄 또는 각종 화학 약품에 의해 처리를 산출한다는 것이다. 우리는 크라이 ET가 미치는 영향을 조사하기위한 근접에 네이티브 상태에서 뉴런의 미래 미세 구조 분석에 사용하기에 특히 우수한 방법입니다 방법을 설명했다신경 돌기 구조에 신경 질환의.
본 논문은 다음과 같이에보고 된 3 차원 단층 촬영을위한 전자 현미경 데이터 뱅크 기탁 번호는 다음과 같습니다 쥐의 해마 신경 돌기를 들어 EMDB (8시 45분부터 9시 1분까지에서) 그림 8과 메인 비디오에 도시 된 바와 같이 기탁 번호는 EMD-5887입니다. 도 4 및 (9시 2분에서 9시 15분까지부터) 메인 영상에 도시 된 바와 같이 래트 후근 신경절 신경 돌기를 들어 EMDB의 기탁 번호가 EMD-5885이다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 (PN2EY016525 및 P41GM103832)에 의해 지원되었다. SHS는 걸프 지역 컨소시엄 (NIH 그랜트 번호 T32EB009379)의 학제 간 생명 과학 교육에 대한 WM 켁 센터에 NanoBiology 학제 간 대학원 교육 프로그램의 화목에 의해 지원되었다.
SHS는 해부 성장하고 DRG와 해마 세포를 유리화, cryo 종 및 DRG와 해마 축삭의 크라이 ET 데이터를 수집, 재구성 및 틸트 시리즈 색상 주석. MRG는 해부와 MNR의 실험실에서 해마의 세포를 제공했다. SC는 경사 시리즈 주석의 지원. SHS는 뉴런을 해부하고 성장하는 방법에 대한 CW에 의해 훈련되었다. SHS, WCM, 화장실은 실험을 고안. SHS는 다른 저자의 의견으로 원고를 준비했다.
이 비디오는 t의 Biozentrum의 세포 이미징 및 NanoAnalytics (C-CINA)를위한 센터에서 촬영되었다대학 바젤 그. C-CINA는 스위스 바젤에있는 ETH 취리히의 바이오 시스템 공학 (D-BSSE)의 부서에 통합되어 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #7 Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72803-01 | For handling EM grids |
| Glass bottom dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-10C | For growing sample |
| Electron microscopy grids | Quantifoil | Holey Carbon, Au 200, R 2/2 | For growing sample |
| Calcium-free filter paper | Whatman | 1541-055 | For blotting sample |
| Large flat point long tweezers | Excelta Corporation | E003-000590, 25-SA | For blotting sample |
| Vitrification device and tweezers | FEI | Vitrobot Mark III | For freezing sample |
| Minigrid storage boxes | Ted Pella, Inc. | 160-40 | For storing EM grids |
| Cryo transfer holder | Gatan | 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder | For imaging samples |
| Semiautomated tilt series acquisition software | SerialEM | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | For imaging samples |
| Image processing software | IMOD eTomo | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | For image processing |
| Transmission electron microscope for cryoEM | JEOL, Tokyo | 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope | For imaging samples |
| 4k x 4k CCD camera | Gatan | N/A | For imaging samples |
| 3-D annotation software | Visage Imaging GmbH | Amira/Avizo | For processing 3-D data |
| Software for digitally stitching 2-D images | Adobe | Adobe Photoshop | For processing 2-D data |
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965-118 | For hippocampal culture |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B-0252 | For hippocampal culture |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | B-9876 | For hippocampal culture |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636-500MG | For hippocampal culture |
| Filter system | Corning | 430758 | For hippocampal culture |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | For DRG culture |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | For DRG culture |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | For DRG culture |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | For DRG culture |
| Recombinant rat b-NGF | R&D Systems | 556-NG | For DRG culture |
| Uridine | Sigma | U3003-5G | For DRG culture |
| 5'-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma | F0503-100MG | For DRG culture |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | For DRG culture |
References
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