Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Published: August 8, 2013 doi: 10.3791/50786

Summary

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

Abstract

סמנים ביולוגיים הופכים להיות יותר ויותר חשובים בקבלת החלטות קלינית, כמו גם מדע בסיסי. אבחון אוטם שריר הלב (MI) הוא מונע במידה רבה על ידי גילוי לב חלבונים ספציפיים בסרום או הפלזמה של חולים כמדד לפגיעה בשריר לב. לאחר שהראה לאחרונה כי לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C) ניתן לזהות בסרום לאחר אוטם לבבי, יש לנו הצענו אותו כסמן ביולוגי פוטנציאל לאמ"ן. סמנים ביולוגיים מזוהים בדרך כלל על ידי מבחני immunosorbent אנזים צמודי כריך מסורתי. עם זאת, טכניקה זו דורשת נפח דגימה גדול, יש לו טווח דינמי קטן, ויכולה למדוד רק חלבון בכל פעם.

כאן אנו מראים immunoassay זמנית שבניתנים למדידה בשלושה חלבוני לב בו זמנית עם רגישות גבוהה. מדידת cMyBP-C יחד בuniplex או עם MB קריאטין קינאז וטרופונין לבי הראה רגישות דומה. טכניקה זו משתמשת בקנה מידת Meso דיסקברי(MSD) שיטת ריבוב בצלחת 96 היטב בשילוב עם electrochemiluminescence לצורך זיהוי. אמנם רק בנפחי מדגם קטנים נדרשים, רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול מושגות. שימוש בטכניקה זו, מדדנו I רמות בדגימות סרום מ -16 נבדקים עם MI cMyBP-C, מגה קריאטין קינאז, ולב טרופונין והשווה את התוצאות עם 16 נבדקי ביקורת. היינו מסוגל לזהות את כל שלושת הסמנים בדגימות הללו ומצאנו את כל שלושת סמנים להיות מוגבר לאחר אוטם לבבי. טכניקה זו היא, אם כן, מתאימה לגילוי של סמנים ביולוגיים רגיש לב בדגימות סרום.

Introduction

המדידה של כמויות נמוכות של חלבון בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון סרום, היא בעלת חשיבות קלינית גוברת לניהול מטופל, כמו גם מדע בסיסי. לדוגמה, עלייה ברמות בסרום של סמנים ביולוגיים לב, כמו טרופונין I, בהגדרה קלינית היא בקנה אחד עם אוטם שריר הלב (MI) 1. כדי לזהות חלבונים בדגימות סרום, assay immunosorbent אנזים צמוד הסטנדרטי (ELISA) הוא הטכניקה משמשת לרוב כיש לו רגישות גבוהה ומאפשר לכימות מוחלטת של אנליטי. עם זאת, ELISAs המסורתי דורש כמות גדולה יחסית של מדגם (בדרך כלל 100 μl), יש לי אות רקע גבוהה בחלק מהנוזלים ביולוגיים, והם מוגבלים למדידת אחת בלבד אנליטי לELISA 2.

לאחרונה, טכניקת immunoassay חדשה הוצגה שעוקפת רבים מחסרונות אלה. assay שונה זו, שפותח על ידי MSD, משתמש electrochemiluminescence (ECL) לזיהוי אות, אשר מאפשר רקע נמוך מאוד ורגישות מוגברת, מה שמאפשר שימוש בכרכי מדגם קטן. Electrochemiluminescence מבוסס על כתב מולקולת רותניום (השני) trisbipyridal, אשר מצורף לנוגדנים לזיהוי. מולקולת הכתב הזה פולט אור ב620 ננומטר על הגירוי החשמלי של החלק התחתון של צלחת 96 היטב שיש אלקטרודות פחם המשולבות בהם 3. כמו כן, על ידי שימוש בציפוי נקודה, יכולים להיות מצופים נוגדנים ללכוד מרובים לתוך אחד טוב (עד 10 על 96 גם צלחת), המאפשרים כימות בו זמני של חלבונים שונים במדגם יחיד 4. טכניקה זו לאחרונה נעשתה שימוש כדי למדוד את פרופילי ציטוקינים מעודדי דלקת בסרום 5,6. הצלחות זמנית מMSD להשוות בחיוב פלטפורמות זמנית assay אחרים 7.

שימוש MSD כפלטפורמה העיקרית assay, אנחנו עוד פיתחה מנהג עשה צלחת 3-Plex שגבו זמנית לכמת את הרמה של לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C), MB קריאטין קינאז-(CK-MB), ולב טרופונין I (cTnI), והתוצאות הושוו עם זיהוי monoplex של cMyBP-C. CK-MB וcTnI הם סמנים ביולוגיים מבוססים היטב לאמ"ן. עם זאת, יכולים להיגרם עליות של סמנים ביולוגיים אלה על ידי פתולוגיות אחרות מאשר אוטם לבבי, כגון דלקת שריר הלב או אי ספיקת כליות 8. זה טוען לתוספת של סמנים ביולוגיים נוספים כדי להגדיל את הספציפיות של אבחון אמ"ן. הראנו לאחרונה כי cMyBP-C היא גם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לMI 9. cMyBP-C הוא חלבון קשור חוט עבה שבא לידי ביטוי בלב, 10-12 אך לא בשלד או חלקה שרירים. לפיכך, הרמה המוגברת של cMyBP-C במערכת הדם היא אינדיקטור מסוים לנזק בלב 13.

במחקר זה, השווינו איתור uniplex של cMyBP-C עם שימוש assay 3-Plex מותאם אישית כדי למדוד את רמות סרום שלcMyBP-C, CK-MB, וcTnI בסרום של חולים עם אוטם לבבי. בעתיד, טכניקת חתימה זו עשויה לשמש כדי לאבחן MI בחולים עם הצגת כאבים בחזה בחדר המיון.

מוסד ביקורת הלוח (IRB) של האוניברסיטה לויולה שיקגו אישרה את המחקר לשימוש בדגימות אדם deidentified ושימוש בimmunoassay (LU # 20392).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Assay cMyBP-C Uniplex

  1. ביום שלפני הניסוי, מעיל הצלחת הסטנדרטית החשופה 96, גם MSD עם נוגדן ללכוד. לcMyBP-C, יש להשתמש בנפח של 30 μl עכבר נוגדן אנטי cMyBP-C חד שבטי (ג'לטין חינם) בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​מדולל בופר פוספט (PBS).
  2. מאז גם הוא הידרופובי, פיפטה הפתרון לפינה התחתונה של הבאר, ואז להקיש על הצדדים של הצלחת להתפשט על פני כל הפתרון טוב.
  3. הצלחת מכוסה באוטם צלחת וטופחו O / N ב 4 ° C בלי לרעוד.
  4. הסר את פתרון הנוגדן ללכוד על ידי הקשה על פני פתרון כיור ולאחר מכן על ערימה של מגבות נייר. הלא ספציפי מחייב את הצלחת חסומה על ידי הוספת 150 μl של 5% (w / v) חוסם פתרון (BSA בדרגה גבוהה) ב PBS היטב כל אחד.
  5. חותם את הצלחת ודגירה עבור שעה 1 ב RT תוך רועד ב 700 סל"ד.
  6. במהלך שלב החסימה, להכין את הסטנדרטים ויםamples. להפוך את הסדרה הסטנדרטית על ידי דילול רקומביננטי בר חלבון cMyBP-C (חומצות אמינו 1-271) לריכוז התחלתי של 2,000 ng / ml ב1% (w / v) חוסם / PBS. אז לדלל סדרתי בפקטור של 5% ב1 (w / v) חוסם / PBS. סה"כ 7 תקנים + ריקה 1 (1% (w / v) חוסם / PBS לבד) היו בשימוש.
  7. הסר את פתרון החסימה ולשטוף את צלחת 3x עם 150 0.05% (V / V) Tween-20/PBS μl. בכל פעם, להסיר את הפתרון לשטוף על ידי היפוך לצלחת מעל כיור. לאחר השלב לשטוף השלישי, במרץ קפיצי הצלחת מעל כיור וללטף את הצלחת במרץ על שכבה של מגבות נייר עד שהוא יבש לחלוטין. זהו צעד חיוני, כמו כרכי דגירה הם קטנים, וכל שנותר פתרון לשטוף באופן משמעותי יהיה לדלל את הדגירה הבאה.
  8. פיפטה μl 25 של סטנדרטים ודגימות לתוך הבארות. חותם את הצלחת ולדגור על RT, בעוד רועד בסל"ד 700 במשך שעה 1.
  9. הכן את פתרון זיהוי הנוגדן ב1 מיקרוגרם / מ"ל ​​בחוסם% 1 / PBS. מ"קstom עשה נוגדן cMyBP-C (epitope חומצות אמינו 2 - 14) עם תיוג MSD sulfo-TAG משמש כנוגדן לזיהוי. ערכות זמינות לתיוג sulfo-TAG, מה שהופך את הליך פשוט יחסית לתייג את כל נוגדנים.
  10. חזור על השלב לשטוף כמתואר בשלב 1.4.
  11. הוסף 25 μl של פתרון נוגדן איתור היטב כל אחד, לאטום את הצלחת, ולדגור על RT במשך שעה 1 בצלחת שייקר נקבעה על 700 סל"ד.
  12. במהלך תקופת הדגירה, לרוץ הדגמת הצלחת של MSD (צלחת עם נורות LED), כדי להבטיח תפקוד תקין של Imager המגזר והתוכנה (ראה סעיף מגיב). כמו כן, לדלל את הקריאה החיץ, הניתן על ידי MSD, על ידי הוספת 5 מ"ל של חיץ קריאת 4x למים מזוקקים 15 מ"ל.
  13. חזור על השלב לשטוף כמתואר בשלב 1.4.
  14. הוסף 150 μl של קריאת חיץ היטב כל אחד על ידי שימוש בפיפטה רבה. הקפד להימנע מבועות אוויר (pipetting ההפוכה היא שיטה מתאימה). לאחר תוספת של הקריאה החיץ, לסרוק את הצלחת במגזר באופן מיידיImager.

2. 3-Plex cMyBP-C, CK-MB, וcTnI Assay

  1. 96 גם צלחת 3-Plex וdiluent פתרונות מותר לאזן לRT לפני השימוש. צלחת זה מראש מצופה בנוגדנים ללכידים cMyBP-C, CK-MB, וcTnI ידי MSD.
  2. הוסף 25 μl של 1% (w / v) חוסם / PBS היטב כל אחד. הקש הצדדים של הצלחת על מנת לוודא כי כולו מכוסה היטב על ידי פתרון.
  3. חותם את הצלחת עם אוטם צלחת, מניח את הצלחת על צלחת שייקר, ולנער בסל"ד 700 למשך 30 דקות.
  4. בינתיים, סדרת דילול של כייל בודדים מוכנה. כי לכל אחד יש גם שלושה נוגדנים ללכוד שלוש כייל צריכים להיות מעורב ובדילול סדרתי לפני השימוש. לדלל רקומביננטי cMyBP-C, CK-MB (MSD), וcTnI (MSD) יחד ב1% (w / v) חוסם / PBS כדי ליצור מדגם אחד עם 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml-CK מגה בייט, ו25 ng / ml cTnI (מדגם).
  5. נפח סופי של לפחות 100 μl מוכן לכל תקן. אללהשלים את הסדרה הסטנדרטית, סדרתי לדלל הדגימות הן בפקטור של 5. השתמש 25 μl של מדגם ב100 1% (w / v) חוסם μl / PBS כדי ליצור מדגם ב 'ואז להשתמש μl 25 של המדגם B ב100 1% (w / v) חוסם μl / PBS כדי ליצור מדגם C , וכן הלאה. דגימות סרום אדם מ -16 נבדקים עם MI ו -16 נבדקי ביקורת שמשו כדי למדוד את רמות cTnI cMyBP-C, CK-MB, ו. דגימות אלה היו מדוללים ב2x 1% (w / v) חוסם / PBS.
  6. הוסף 25 μl של סטנדרטים ודגימות מדוללים ל25 μl הנוכחי כבר בבארות של צלחת 3-Plex. חשוב לכלול גם ריק (diluent בלבד). כדי לבסס את הטכניקה, דגימות נטענות בtriplicates הטכני. אחרת, כפילויות מספיקות.
  7. חותם את הצלחת שוב (ניתן לעשות שימוש חוזר אוטם צלחת) ולדגור על שייקר צלחת (700 סל"ד) על RT במשך שעה 2.
  8. רגע לפני שהוא סיים דגירה, פתרון נוגדן זיהוי מוכן. Diluent משמש הוא 1% (w / v) חוסם PBS. כל thrנוגדני איתור EE sulfo-מתויגים דילול יחד לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל אחד. נוגדני איתור מסופקים בדרך כלל בריכוז מניות 50x.
  9. עבור 96 גם צלחת מלאה, יש צורך ב2,700 μl של תמיסה מדוללת כוללת (עם pipetting כללה שגיאה). הוסף 54 μl של כל נוגדן לזיהוי 2,538 1% (w / v) חוסם μl / PBS.
  10. לאחר 2 שעות, להסיר פתרונות נמרצות על ידי מצליף את הצלחת מעל כיור. לשטוף 3x הבארות עם 150 μl של 0.05% Tween-20 ב-PBS. הוסף 25 μl של פתרון נוגדן זיהוי לכל אחד גם באמצעות פיפטה רבה, ואת הצדדים של הצלחת הם טפח על מנת להבטיח שכולו מכוסים היטב על ידי פתרון.
  11. חותם את הצלחת ודגירה במשך שעה 1 בזמן רועד ב 700 סל"ד.
  12. במהלך תקופת הדגירה, לרוץ הדגמת הצלחת של MSD (צלחת עם נורות LED), כדי להבטיח תפקוד תקין של Imager המגזר והתוכנה. גם לדלל את הקריאה החיץ, הניתן על ידי MSD, על ידי הוספת 5 מ"ל של 4x לקריאהחיץ למים מזוקקים 15 מ"ל.
  13. חזור על השלב לשטוף מתוארים בשלב 2.8.
  14. הוסף 150 μl של קריאת חיץ היטב כל אחד באמצעות פיפטה רבה. הימנעות בועות אוויר היא קריטית (pipetting ההפוכה היא שיטה מתאימה). לאחר תוספת של הקריאה החיץ, לסרוק את הצלחת בImager המגזר באופן מיידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

את עקרונות היסוד ואת זרימת העבודה של assay 3-Plex מוצגים באיור 1, ואת זרימת העבודה הכוללת מתוארת בטבלה 1. מבחני Uniplex לעבוד יחד באותו עיקרון אלא שכל התחתית היטב מצופה בנוגדן ללכוד אחד. זיהוי אות נעשה על ידי ECL שבו אות חשמלי מוחל על תחתית הבאר. זה, בתורו, יוזם ייצור מקומי של אור באמצעות תגובה כימית של הקריאה החיץ עם תווית sulfo-TAG בנוגדנים לזיהוי. זה מוביל לרקע הנמוך ורגישות גבוהה של assay. בתרשים 2, עקומת התקן של cMyBP-C בassay uniplex היא בהשוואה לזה של cMyBP-C בassay 3-Plex. שני מבחני מראים רגישות גבוהה מאוד וטווח דינמי גבוה. רמות זיהוי וכימות רמות מוצגות בטבלה 2, והם דומים בשניהם uniplex ומבחני 3-Plex. רמות זיהוי ולcTnI CK-MB הן also שמוצגת באיור 3 וטבלה 2. שונות בין המפעיל נקבעו על ידי מדידת דגימות זהות (n = 2, 3 טכניים משכפל) על ידי שני מפעילים שונים ומשונים נמצא להיות נמוך (CV 8.5%). תגובתיות צלב של נוגדנים לזיהוי עם שני כייל האחרים נחקרה על ידי דוגרים עקומות סטנדרטיות בודדות של כל שלוש כייל נוגדנים עם זיהוי יחיד (איור 4). רק כמות נמוכה של תגובתיות הצולבת הייתה לראות בין CK-MB כיל והן נוגדני איתור cMyBP-C cTnI ובעוד אין-תגובתיות צולבת נצפתה בין כייל נוגדנים האחרים וזיהוי.

כהוכחה לתחולתו של assay לזיהוי של פגיעת לב, רמות בסרום של 16 נבדקים עם MI הושוו עם קבוצת ביקורת (n = 16). שימוש בצלחת 3-Plex, רמות בסרום של cMyBP-C, CK-MB, וcTnI נקבעו. כל שלושה סמנים היו מוגבר במקצועות MI (ראהאיור 5) משל פי 3.7 (cMyBP-C) ל -12.2 פי (CK-MB), אם כי שונה ברמות בסרום היה הנמוך ביותר בקבוצת cMyBP-C.

תהליך Uniplex assay assay 3-Plex
יום ניסוי 0 צלחת מעיל עם נוגדן ללכוד בין לילה N /
יום 1 ניסוי לחסום את הצלחת שעה 1 30 דקות
הכן את הדגימות וסדרות סטנדרטי
דגירה עם דגימות ותקנים שעה 1 2 שעות
דגירה עם נוגדן זיהוי שעה 1 שעה 1
הוסף מגיב לגילוי ולקרואצלחת

טבלת מס '1. סקירת זרימת עבודה של uniplex ומבחנים זמנית.

LLOD (ng / ml) LLOQ (ng / ml) ULOQ (ng / ml)
cMyBP-C (uniplex) ± 0.126 0.007 ± 0.567 0.073 400 ng / ml
cMyBP-C (3plex) ± 0.057 0.022 ± 0.469 0.171 400 ng / ml
CK-MB (3-Plex) ± 0.038 0.014 ± 0.587 0.213 100 ng / ml
cTnI (3plex) ± 0.033 0.011 ± 0.147 0.053 25 ng / ml

טבלת 2. גבולות זיהוי של uniplex וכייל 3-Plex. LLOD, גבול תחתון של זיהוי, מוגדר כריכוז מחושב של האות של סטיית התקן הריקה + 3 פעמים מהדגימות הריקות. LLOQ, גבול תחתון של כימות, מוגדר כערך גבוה יותר מאשר LLOD, עם מקדם של שונות (הדדי של יחס אות לרעש) נמוכה מ -20%, והתאוששות בין 80 - 120%. ULOQ, גבול העליון של כימות, מוגדר כריכוז הגבוה ביותר שנתח ניתן למדוד עם מקדם של שונות נמוכות מ -20% והתאוששות בין 80 - 120%.

איור 1
איור 1. סקירה סכמטי של צלחת וזרימת עבודה.) 96 גם צלחת מוצגת. גם כל אחד מצופה בשלושה נוגדנים ללכוד שונים, כלומר נגד cMyBP-C, CK-MB וcTnI. הועיל הרביעימקום מסוגל לא נעשה שימוש, והוא מצופה בBSA. ב ') זרימת עבודה של ELISA 3-Plex. הצלחת מראש המצופה (שלב 1) חסומה ולאחר מכן דגימות או כייל סרום מתווספות לזה היטב ואפשרו לאגד (שלב 2). לאגד (כתום סגלגל) cMyBP-C (יהלומים אדומים), CK-MB (ירוק מלבן), וcTnI לנוגדנים ללוכדם. לאחר שטיפה את החלבונים מאוגד, את תג כותרתו sulfo נוגדני זיהוי נוספים (שלב 3). הם נקשרים לחלבוני cTnI cMyBP-C, CK-MB, או שקשורים לנוגדני לכידתם. לאחר שטיפת נוגדן זיהוי מאוגד, חוצץ קריאה הוא הוסיף והצלחת מנותחת. אות חשמלי לתחתית הצלחת יוזם תגובה כימית מקומית של sulfo-TAG עם חוצץ הקריאה, מה שמוביל לייצור של אור (שלב 4). כמות האור היא ביחס ישר לכמות נוגדני איתור sulfo-TAG כותרתו כבולות. CCD imager מחדשמיתרי האור והוא יכול להבחין בין הנקודות השונות בתוך כל טוב, ולכן אותות המגיעים מכל אנליטי (שלב 5).

איור 2
איור 2. עקומת סטנדרט של כיול cMyBP-C נמדדה בuniplex או ב3-Plex. אותה הסדרה סטנדרטית נמדדה בassay uniplex, ועל צלחת 3-Plex. התחילה הסדרה הסטנדרטית ב 2000 ng / ml וסדרתי היה מדולל 5x עם הריכוז הנמוך ביותר להיות 0.128 ng / ml. בנוסף, diluent שימש כמדגם ריק. אזור זיהוי של assay מוצג באפור. השורה התחתונה מציינת את הגבול התחתון של זיהוי (LLOD), אשר מוגדר כריכוז המחושב של האות הריקה + 3 פעמים סטיית התקן של הערכים הריקים. הגבול העליון של גילוי מוגדר כלאהוא הריכוז הגבוה ביותר של הסדרה הסטנדרטית שניתן למדידה באופן מהימן. שתי העקומות הסטנדרטיות cMyBP-C uniplex ו3-Plex הן דומות. מגבלות זיהוי מוצגות בטבלה 2. AU: יחידות שרירותיות.

איור 3
איור 3. עקומות סטנדרטיות של CK-MB וcTnI. עקומות סטנדרטיות של CK-MB וcTnI, שנמדדו בו זמנית עם cMyBP-C על צלחת 3-Plex. שני כייל להראות רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול. באזור אפור זיהוי של assay מוצג. השורה התחתונה מציינת את הגבול התחתון של זיהוי (LLOD), אשר מוגדר כריכוז המחושב של האות הריקה + 3 פעמים סטיית התקן של הערכים הריקים. הגבול העליון של גילוי מוגדר כריכוז הגבוה ביותר של SE הסטנדרטי ריס יכול אמין למדידה באופן זה. מגבלות זיהוי מוצגות בטבלה 2. AU: יחידות שרירותיות.

איור 4
איור 4. תגובה הצולבת של נוגדנים לזיהוי 3-Plex. עקומות סטנדרטיות נפרדות של cMyBP-C, CK-MB, וcTnI הוכנו וטופחו על צלחת 3-Plex. כל עקומה סטנדרטית הייתה ממשש עם נוגדנים לזיהוי אישיים, כדי להעריך את הכמות של תגובה צולבת בין נוגדנים לגילוי בודדים (למשל cMyBP-C) וכייל האחרים (למשל CK-MB וcTnI). התגובה הצולבת הייתה נמוכה בassay 3-Plex. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5 "עבור: תוכן-width =" 3in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
איור 5. רמות סמנים ביולוגיים בסרום של MI וקבוצת בקרה שנמדדו עם assay 3-Plex. רמות של cMyBP-C, CK-MB, וcTnI נמדדו בו זמנית על ידי assay 3-Plex בדגימות סרום של 16 נבדקי ביקורת ו -16 נבדקים עם אוטם לבבי. הנתונים מוצגים על ידי חלקות תיבה ושפם (שפם מייצג ה 10 ואחוזון 90 ה). הרמות הגבוהות של כל שלושת הסמנים הביולוגיים נצפו בסרום של נבדקים עם MI בהשוואה לקבוצת הביקורת. מאחר שהנתונים לא הראו התפלגות נורמלית (נבדק על ידי ד 'אגוסטינו פירסון אומניבוס), המבחן שאינו פרמטרית מאן ויטני הסטטיסטי המשמש לבדיקת הבדלים בין קבוצות השליטה ואמ"ן. # P <0.001

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים את הישימות של immunoassay זמנית לגילוי של סמנים ביולוגיים בסרום לב מרובים מחולים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני ELISA המסורתי. ראשית, ECL בערכת assay משמש במקום זיהוי colorimetric. בECL, אות חשמלי מגרה את הייצור המקומי של הנכס נמדד (אור), ובכך שחרר את סוגר אירוע הגירוי מהאות, אשר מפחיתה רקע 14. זה מאפשר רגישות גבוהה, כפי שניתן לראות בטבלה 2.

ריבוב assay אינו התוצאה של אובדן הרגישות לצורך זיהוי של cMyBP-C, כפי שניתן לראות באיור 2 וטבלה 2. cMyBP-C נמדד בuniplex הראה רגישות וזיהוי טווח דומה לcMyBP-C שנמדד בו זמנית עם CK-MB וcTnI 13. מדידות בו זמנית להפחית באופן משמעותי את היקף המדגם הנחוץ למדידות יTS, אשר יכול להיות גורם קריטי בעת, כמו גם עבודה עם דגימות ביולוגיות נדירות, צמצום משך זמן ריצת מבחני uniplex מרובים.

כמו בכל immunoassay, assay תלוי מאוד באיכות של הנוגדנים בשימוש. הזיקה הסגוליות, והלהיטות של נוגדני הלכידה וזיהוי הוא הקובע העיקרי של הרגישות של assay 15. יש זוגות ניסו נוגדנים שונים כדי לראות איזה שילוב של נוגדנים ללכוד ונותן גילוי הרגישות הגבוהה ביותר והטווח דינמי. בעת שימוש בטכניקות ריבוב, נוגדני הלכידה צריכים להיות נקודה מצופה בבאר. משמעות הדבר היא כי בנפח נמוך, פתרון מרוכז מאוד הוא הבחין בחלק של הבאר (ראה איור 1) בניגוד לציפוי פתרון בשימוש assay uniplex או בELISA הקונבנציונלי. יש לבחון אותו אם הנוגדן ללכוד מבצע, כמו גם עם ציפוי נקודה כפי שהיא עושה עם ציפוי פתרון. תגובה צולבת שלנוגדנים או כייל עם זוג נוגדן אחר גם יכולים להצמיח תוצאות חיוביות שגויות 2,15.

במחקר זה, צלחת זמנית בהתאמה אישית תוכננה בשיתוף פעולה עם MSD. למרות מגוון רחב של צלחות זמנית מראש מצופים זמינים מסחרי, חדשנות המסוימת הזה נדרשת אופטימיזציה של assay בגלל רומן יעד (cMyBP-C) היה מרובב עם מבחני קטלוג מותאמים בעבר (CK-MB וcTnI). ככזה, חסרון בולט של שיטה זו הוא דרישה נוסף לקורא צלחת מיוחד וצלחות המכילות אלקטרודות כדי לזהות את אות ECL. למרות שפועל זמנית assay אחד לעומת מבחני uniplex מרובים יפחית עלויות הכוללות, קורא צלחת חייב להיות בתחילה רכש 2.

שימוש immunoassay 3-Plex הרמות של שחרור סמן ביולוגי של cMyBP-C, CK-MB, וcTnI נמדדו בנבדקים עם MI ובהשוואה לקבוצת ביקורת. שינוי הקיפול של עלייה מעל הקבוצת ביקורת הדואר שונה בין שלושת הסמנים הביולוגיים (ראה איור 4), כפי שעשה הווריאציה בקבוצת אמ"ן. וריאציה ברמות סמנים ביולוגיים צפויה באוסף של חולי MI, כמו עיתוי של דגימת דם, גודל אוטם, כמו גם שורה של גורמים אחרים, שעשוי לתרום לשחרורו של חלבוני לב והשפלות הבאות שלה שבמחזור. בין אם ברמה של הסמנים הביולוגיים הבודדים לתאם עם פרמטרים קליניים, כגון גודל אוטם, כתבי מחקר נוסף.

תרגום ממצאים אלה באופן ישיר לשימוש בחדר המיון כדי לזהות אמ"ן דורש מספר האתגרים שיש להתגבר עליהם. ראש ביניהם הוא זמן הפרוטוקול נדרש כדי לייצר תוצאות, אשר גם עם צלחות מראש מצופים לוקחת 3 וחצי שעות. כמו במבחני טרופונין בשימוש היום, assay צריך להיות מותאם לזיהוי מהיר, המאפשר אבחון מהיר.

לסיכום, יש לנו פיתחו assay חתימה שבו שניים יודעיםn סמנים לבביים וסמנים ביולוגיים אחד פוטנציאל לב, cMyBP-C, שהפגינו כדי לזהות הנוכחות של פגיעה בשריר לב בו זמנית בחולים עם אוטם לבבי על ידי quantitation של titers סרום חלבון לבבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

בקשת פטנט מלאה תלויה ועומדת (בקשת מס 'סידורי 13/464, 466, פאב מס' A1 ארה"ב 2012 / 0,282,618 ותאריך. 05/04/12) כדי לקבוע את גורמי הסיכון הקשורים לפירוק ושחרור cMyBP-C לתוך נוזל גוף אדם ולכמת את רמת cMyBP-C בנוזלים בגוף אנושי.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מכונים הלאומי לבריאות מענקים R01HL105826 וK02HL114749 (ד"ר Sadayappan), ומלגות לאיגוד לב אמריקאי במערב התיכון; 11PRE7240022 (מר Barefield) ו13POST14720024 (ד"ר Govindan). המחברים תודה להכיר בסיועו של ד"ר ג'ימי פייג', ג'יל Clampit וד"ר ג'ון הדסון, MSD, לתמיכה הטכנית ובספרות מצוינת שלהם בפיתוח assay.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant Meso Scale Discovery R92TC-2  
Tween-20 Acros 9005-64-5  
MSD Blocker A Meso Scale Discovery R93BA-1  
Phosphate buffered saline, 10X Fisher BioReagents BP399-4 Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free Santa Cruz SC-137180L For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate Meso Scale Discovery L15XA-3  
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB Meso Scale Discovery N452A-1  
ThermaSeal Sealing Film Life Science Products Inc. ST-3098  
MSD SECTOR Imager 2400A Meso Scale Discovery  
MTS 2/4 digital microtiter shaker IKA 3208001  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
  2. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
  3. Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
  4. Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
  5. Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
  6. Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
  7. Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
  8. Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
  9. Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
  10. Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
  11. Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
  12. Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
  13. Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
  14. Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
  15. Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 78 ביולוגיה תאית ביוכימיה גנטיקה ההנדסה ביו רפואית רפואה קרדיולוגיה מחלות לב שריר הלב אוטם שריר הלב מחלות לב וכלי דם מחלות לב וכלי דם לב immunoassay שרירן מחייב חלבון-C לב טרופונין I קריאטין קינאז מגה בייט electrochemiluminescence סמנים ביולוגיים זמנית ELISA assay
שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuster, D. W. D., Barefield, D.,More

Kuster, D. W. D., Barefield, D., Govindan, S., Sadayappan, S. A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay. J. Vis. Exp. (78), e50786, doi:10.3791/50786 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter