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Biology

Electrochemiluminescence आमापन द्वारा सीरम कार्डिएक मायोसिन बाइंडिंग प्रोटीन सी के निर्धारण के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट Quantitation विधि

Published: August 8, 2013 doi: 10.3791/50786
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

Summary

जटिल जैविक नमूनों में मापने बायोमार्कर तेजी से निर्णय लेने नैदानिक ​​मार्गदर्शक है. हम एक साथ हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी, creatine kinase एमबी, और रोधगलन और स्वस्थ नियंत्रण विषयों के साथ विषयों से सीरम नमूनों में हृदय troponin मैं मापने के लिए एक बेहद संवेदनशील विधि का वर्णन है.

Abstract

बायोमार्कर के साथ ही बुनियादी विज्ञान, निर्णय लेने नैदानिक ​​में तेजी से और अधिक महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं. निदान रोधगलन (एमआई) काफी हद तक दौरे चोट का एक संकेतक के रूप में मरीजों के सीरम या प्लाज्मा में हृदय विशेष प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा संचालित है. हाल ही में हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी (cMyBP सी) एमआई के बाद सीरम में detectable है कि दिखाया गया है, तो हम एमआई के लिए एक संभावित biomarker के रूप में यह प्रस्ताव किया है. बायोमार्कर आम तौर पर पारंपरिक सैंडविच एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays के द्वारा पता चला रहे हैं. हालांकि, इस तकनीक का एक बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है एक छोटे गतिशील रेंज है, और एक समय में केवल एक प्रोटीन उपाय कर सकते हैं.

यहाँ हम तीन हृदय प्रोटीन उच्च संवेदनशीलता के साथ एक साथ मापा जा सकता है, जिसमें एक मल्टीप्लेक्स immunoassay दिखा. Creatine kinase MB और हृदय troponin साथ uniplex में या एक साथ cMyBP सी मापने मैं तुलनीय संवेदनशीलता दिखाई. इस तकनीक को मेसो स्केल डिस्कवरी का उपयोग करता हैपता लगाने के लिए electrochemiluminescence के साथ संयुक्त 96 अच्छी तरह से थाली में बहुसंकेतन की (एमएसडी) विधि. केवल छोटा सा नमूना संस्करणों की आवश्यकता होती है, वहीं उच्च संवेदनशीलता और एक बड़ी गतिशील रेंज हासिल कर रहे हैं. इस तकनीक का उपयोग करना, हम cMyBP सी, creatine kinase एमबी, और हृदय troponin एमआई के साथ 16 विषयों से सीरम नमूनों में मैं स्तर को मापा और 16 नियंत्रण विषयों के साथ परिणाम की तुलना में. हम इन नमूनों में सभी तीन मार्करों पता लगाने में सक्षम थे और एमआई के बाद बढ़ाया जा करने के लिए सभी तीन बायोमार्कर पाया. इस तकनीक, इसलिए, सीरम नमूनों में हृदय बायोमार्कर के संवेदनशील पता लगाने के लिए उपयुक्त है.

Introduction

इस तरह के सीरम के रूप में जटिल जैविक नमूने, में प्रोटीन की कम मात्रा का माप रोगी प्रबंधन, साथ ही बुनियादी विज्ञान के लिए बढ़ती नैदानिक ​​महत्व का है. उदाहरण के लिए, एक नैदानिक ​​सेटिंग में ऐसे ट्रोपोनिन मैं के रूप में कार्डियक बायोमार्कर के सीरम का स्तर,, में वृद्धि की तीव्र रोधगलन (एमआई) 1 के अनुरूप है. यह उच्च संवेदनशीलता है और analyte की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है के रूप में सीरम नमूनों में प्रोटीन का पता लगाने के लिए, मानक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) सबसे अक्सर इस्तेमाल तकनीक है. हालांकि, पारंपरिक ELISAs, नमूना के एक अपेक्षाकृत बड़ी राशि (आमतौर पर 100 μl) की आवश्यकता होती है कुछ जैविक तरल पदार्थ में उच्च पृष्ठभूमि संकेत है, और एलिसा 2 प्रति केवल एक analyte की माप के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं.

हाल ही में, एक नए immunoassay तकनीक इन कमियों के कई circumvents कि पेश किया गया था. इस संशोधित परख, एमएसडी द्वारा विकसित, electrochemiluminesc का उपयोग करता हैछोटा सा नमूना संस्करणों के उपयोग को सक्षम करने, एक बहुत कम पृष्ठभूमि और एक वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए अनुमति देता है जो संकेत का पता लगाने के लिए खिलाडि़यों (ईसीएल). Electrochemiluminescence पता लगाने के एंटीबॉडी से जुड़ी है जो पत्रकार अणु दयाता (द्वितीय) trisbipyridal, पर आधारित है. इस संवाददाता अणु उन्हें 3 में एकीकृत कार्बन इलेक्ट्रोड है जो 96 अच्छी तरह से थाली के नीचे की बिजली की उत्तेजना पर 620 एनएम पर प्रकाश का उत्सर्जन करता है. इसके अलावा, हाजिर कोटिंग का उपयोग करके, एकाधिक कब्जा एंटीबॉडी एक भी नमूना 4 में विभिन्न प्रोटीन के एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, अच्छी तरह से एक (10 करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली पर) में लेपित किया जा सकता है. इस तकनीक को हाल ही में सीरम 5,6 में proinflammatory साइटोकाइन प्रोफाइल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एमएसडी से मल्टीप्लेक्स प्लेटें कृपापूर्वक अन्य मल्टीप्लेक्स परख प्लेटफार्मों पर 7 की तुलना करें.

प्राथमिक परख मंच के रूप में एमएसडी का उपयोग करना, हम आगे 3 परिसर थाली बना एक कस्टम विकसित की है कि गएक एक साथ हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी (cMyBP सी), क्रिएटिन-काइनेज एमबी (सी.के. MB), और हृदय troponin मैं (cTnI) के स्तर यों, और परिणाम cMyBP सी के monoplex पता लगाने के साथ तुलना की गई. सी.के. MB और cTnI एमआई के लिए अच्छी तरह से स्थापित बायोमार्कर हैं. हालांकि, इन बायोमार्कर की बढ़ जाती है जैसे मायोकार्डिटिस या गुर्दे की विफलता 8, एमआई के अलावा अन्य विकृतियों के कारण हो सकता है. यह एमआई निदान की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त बायोमार्कर के अलावा के लिए तर्क है. हमने हाल ही में cMyBP सी भी एमआई 9 के लिए एक संभावित biomarker है कि पता चला है. cMyBP सी दिल, लेकिन नहीं कंकाल या चिकनी मांसपेशियों में 10-12 में व्यक्त किया है कि एक मोटी रेशा जुड़े प्रोटीन है. इस प्रकार, संचार प्रणाली में cMyBP सी की वृद्धि हुई स्तर हृदय की क्षति 13 साल की एक विशिष्ट सूचक है.

इस अध्ययन में, हम सीरम का स्तर मापने के लिए एक कस्टम 3 plex परख के उपयोग के साथ cMyBP सी के uniplex पता लगाने की तुलनाcMyBP सी, सी.के. MB, और एमआई के साथ रोगियों के सीरम में cTnI. भविष्य में, इस हस्ताक्षर तकनीक आपातकालीन कक्ष में सीने में दर्द के साथ पेश रोगियों में एमआई का निदान किया जा सकता है.

लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो की संस्था समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) deidentified मानव नमूनों के उपयोग और immunoassay का उपयोग (लू # 20392) के लिए अध्ययन को मंजूरी दे दी.

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Protocol

1. Uniplex cMyBP सी परख

  1. कब्जा एंटीबॉडी के साथ प्रयोग, कोट 96 अच्छी तरह से एमएसडी नंगे मानक थाली से पहले दिन. CMyBP-C के लिए, 5 ग्राम / फॉस्फेट में पतला एमएल के एक एकाग्रता पर माउस मोनोक्लोनल विरोधी cMyBP सी एंटीबॉडी (जिलेटिन मुक्त) की एक 30 μl मात्रा का उपयोग खारा (पीबीएस) buffered.
  2. अच्छी तरह से हाइड्रोफोबिक है, अच्छी तरह से नीचे कोने में समाधान पिपेट, तो पूरे अच्छी तरह से समाधान का प्रसार करने के लिए थाली के पक्ष नल.
  3. प्लेट एक थाली मुहर के साथ कवर और मिलाते हुए बिना डिग्री सेल्सियस 4 में ओ / एन incubated है.
  4. एक सिंक के ऊपर और फिर कागज तौलिए के एक ढेर पर हल निकालने का दोहन द्वारा कब्जा एंटीबॉडी समाधान निकालें. प्लेट के लिए गैर विशिष्ट बंधन एक 5% (w / v) अवरोधक प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस में एक (उच्च ग्रेड बीएसए) समाधान के 150 μl जोड़कर अवरुद्ध है.
  5. 700 rpm पर मिलाते हुए आरटी पर 1 घंटे के लिए थाली और सेते सील.
  6. अवरुद्ध कदम के दौरान मानकों को तैयार करने और एसamples. 1% में 2,000 एनजी / एमएल (w / वी) अवरोधक एक पीबीएस / के एक प्रारंभिक एकाग्रता के लिए - पुनः संयोजक cMyBP सी प्रोटीन टुकड़ा (271 अमीनो एसिड 1) गिराए द्वारा मानक श्रृंखला बनाओ. फिर क्रमानुसार 1% (w / v) अवरोधक ए / पीबीएस में 5 का एक पहलू से पतला. 7 मानकों के कुल 1 रिक्त (1% (w / v) अवरोधक ए / पीबीएस अकेले) का इस्तेमाल किया गया.
  7. अवरुद्ध समाधान निकालें और 150 μl 0.05% (v / v) Tween-20/PBS साथ 3x प्लेट धो लो. हर बार, एक सिंक के ऊपर inverting थाली से धोने के समाधान को हटा दें. तीसरे धोने कदम के बाद, सख्ती एक सिंक पर थाली झटका और यह पूरी तरह से सूखा है जब तक कागज तौलिए की एक परत पर सख्ती थाली थपथपाना. ऊष्मायन मात्रा में छोटे हैं, क्योंकि यह एक महत्वपूर्ण कदम है, और किसी भी शेष धोने समाधान काफी अगले ऊष्मायन कमजोर होगी.
  8. कुओं में मानकों और नमूने के पिपेट 25 μl. 1 घंटे के लिए 700 rpm पर मिलाते हुए, आरटी पर थाली और सेते सील.
  9. 1% अवरोधक ए / पीबीएस में 1 ग्राम / मिलीलीटर में पता लगाने एंटीबॉडी समाधान तैयार है. एक घनएमएसडी sulfo-टैग लेबलिंग का पता लगाने के एंटीबॉडी के रूप में कार्य करता है के साथ - stom cMyBP सी एंटीबॉडी (14 मिलान अमीनो एसिड 2) बनाया है. किट यह किसी भी एंटीबॉडी लेबल करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है, जिससे sulfo-टैग लेबलिंग के लिए उपलब्ध हैं.
  10. के रूप में 1.4 चरण में वर्णित धोने कदम दोहराएँ.
  11. प्रत्येक अच्छी तरह से पता लगाने के एंटीबॉडी समाधान के 25 μl जोड़ें, बरतन 700 rpm पर सेट एक थाली पर 1 घंटे के लिए आरटी पर थाली, और सेते सील.
  12. ऊष्मायन अवधि के दौरान, सेक्टर Imager और सॉफ्टवेयर (अभिकर्मक अनुभाग देखें) के समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए एमएसडी के डेमो प्लेट (एलईडी रोशनी के साथ थाली) चलाते हैं. इसके अलावा, 15 मिलीलीटर आसुत जल के लिए 4x पढ़ने के लिए बफर के 5 मिलीलीटर जोड़कर एमएसडी द्वारा प्रदान की जाती है जो पढ़ने के लिए बफर, पतला.
  13. के रूप में 1.4 चरण में वर्णित धोने कदम दोहराएँ.
  14. एक multichannel विंदुक का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से पढ़ने के लिए बफर के 150 μl जोड़ें. हवाई बुलबुले (रिवर्स pipetting एक उपयुक्त तरीका है) से बचने के लिए सुनिश्चित करें. पढ़ने के लिए बफर के अलावा के बाद, तुरंत सेक्टर में प्लेट स्कैनइमेजर.

2. 3 परिसर cMyBP सी, सी.के. MB, और cTnI परख

  1. एक 96 अच्छी तरह से 3 परिसर प्लेट और मंदक समाधान उपयोग करने से पहले आरटी को संतुलित करने के लिए अनुमति दी जाती है. यह प्लेट एमएसडी द्वारा cMyBP सी, सी.के. MB, और cTnI के लिए कब्जा एंटीबॉडी के साथ पूर्व में लिपटे है.
  2. 1% (w / v) अवरोधक प्रत्येक अच्छी तरह से ए / पीबीएस के 25 μl जोड़ें. पूरे अच्छी तरह समाधान के द्वारा कवर किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए थाली के पक्ष ठोकर.
  3. एक थाली मुहर के साथ थाली सील, एक थाली प्रकार के बरतन पर थाली जगह है, और 30 मिनट के लिए 700 rpm पर हिला.
  4. इस बीच, व्यक्तिगत calibrators के कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार की है. प्रत्येक अच्छी तरह से तीन कब्जा एंटीबॉडी है क्योंकि तीन calibrators मिश्रित हो और क्रमानुसार उपयोग करने से पहले पतला करने की जरूरत है. 2,000 एनजी / एमएल cMyBP सी, 100 एनजी / एमएल के साथ एक नमूना बनाने के लिए 1% में एक साथ पुनः संयोजक cMyBP सी, सी.के. MB (एमएसडी), और cTnI (एमएसडी) (w / वी) अवरोधक ए / पीबीएस पतला सी.के. एमबी, और 25 एनजी / एमएल cTnI (नमूना ए).
  5. कम से कम 100 μl के अंतिम मात्रा प्रत्येक मानक के लिए तैयार किया जाता है. सेमानक श्रृंखला को पूरा, क्रमानुसार नमूने 5 का एक पहलू से हैं पतला. नमूना के 25 μl का प्रयोग एक 100 μl 1% (w / v) अवरोधक नमूना सी बनाने के लिए 100 μl 1% (w / v) अवरोधक ए / पीबीएस में नमूना बी के 25 μl उपयोग तब नमूना बी बनाने के लिए ए / पीबीएस में , और बहुत आगे है. एमआई के साथ 16 विषयों और 16 नियंत्रण विषयों से मानव सीरम नमूनों cMyBP सी, सी.के. MB, और cTnI के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन नमूनों 1% (w / v) अवरोधक ए / पीबीएस में 2x पतला थे.
  6. 3 परिसर थाली के कुओं में पहले से ही मौजूद 25 μl के लिए मानकों और पतला नमूने के 25 μl जोड़ें. यह भी एक रिक्त (केवल मंदक) शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. तकनीक स्थापित करने के लिए, नमूने तकनीकी triplicates में लोड कर रहे हैं. अन्यथा, डुप्लिकेट के लिए पर्याप्त हैं.
  7. फिर थाली सील (थाली मुहर पुन: उपयोग किया जा सकता है) और 2 घंटे के लिए आरटी पर एक थाली प्रकार के बरतन (700 आरपीएम) पर सेते हैं.
  8. ऊष्मायन समाप्त हो गया है, बस से पहले पता लगाने एंटीबॉडी समाधान तैयार किया जाता है. इस्तेमाल किया मंदक एक पीबीएस में 1% (w / v) अवरोधक है. सभी कई sulfo टैग का पता लगाने एंटीबॉडी 1 ग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक के अंतिम एकाग्रता में एक साथ पतला कर रहे हैं. डिटेक्शन एंटीबॉडी आम तौर पर एक 50x शेयर एकाग्रता में प्रदान की जाती हैं.
  9. एक पूर्ण 96 अच्छी तरह से थाली के लिए, कुल पतला समाधान के 2,700 μl (त्रुटि शामिल pipetting साथ) की जरूरत है. 2538 μl 1% (w / v) अवरोधक एक पीबीएस / करने के लिए प्रत्येक का पता लगाने के एंटीबॉडी के 54 μl जोड़ें.
  10. 2 घंटे के बाद, सख्ती एक सिंक के ऊपर थाली flicking द्वारा समाधान निकालने के. 0.05% पीबीएस में बीच 20 से 150 μl के साथ कुओं 3x धो लें. पता लगाने के लिए एंटीबॉडी समाधान के 25 μl जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग, और थाली के किनारों पूरे अच्छी तरह से समाधान द्वारा कवर किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
  11. थाली सील और 700 rpm पर मिलाते हुए 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  12. ऊष्मायन अवधि के दौरान, सेक्टर Imager और सॉफ्टवेयर के समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए एमएसडी के डेमो प्लेट (एलईडी रोशनी के साथ थाली) चलाते हैं. इसके अलावा के 4x पढ़ने के 5 मिलीलीटर जोड़कर एमएसडी द्वारा प्रदान की जाती है जो पढ़ने के लिए बफर, पतला15 मिलीलीटर आसुत पानी के लिए बफर.
  13. कदम 2.8 में वर्णित धोने कदम दोहराएँ.
  14. अच्छी तरह से एक multichannel विंदुक का उपयोग करते हुए प्रत्येक को पढ़ने के लिए बफर के 150 μl जोड़ें. हवाई बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है (रिवर्स pipetting एक उपयुक्त तरीका है). पढ़ने के लिए बफर के अलावा के बाद, तुरंत सेक्टर Imager में प्लेट स्कैन.

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Representative Results

3 plex परख के बुनियादी सिद्धांतों और कार्यप्रवाह चित्र 1 में दिखाया जाता है, और समग्र कार्यप्रवाह तालिका 1 में वर्णित है. Uniplex assays के पूरे नीचे अच्छी तरह से एक पर कब्जा एंटीबॉडी के साथ लेपित है, सिवाय इसके कि एक ही सिद्धांत के साथ काम करते हैं. सिग्नल का पता लगाने के लिए एक बिजली के संकेत अच्छी तरह से नीचे के लिए लागू किया जाता है, जिसमें ईसीएल द्वारा किया जाता है. यह, बारी में, पहचान प्रतिरक्षी पर sulfo-टैग लेबल के साथ पढ़ने के लिए बफर के एक रासायनिक प्रतिक्रिया के माध्यम से प्रकाश की एक स्थानीय उत्पादन शुरू की. यह कम पृष्ठभूमि और परख की उच्च संवेदनशीलता की ओर जाता है. चित्रा 2 में, uniplex परख में cMyBP सी के मानक वक्र 3 परिसर परख में cMyBP सी की तुलना की है. दोनों assays के एक बहुत ही उच्च संवेदनशीलता और एक उच्च गतिशील रेंज दिखा. पता लगाने के स्तर और मात्रा का ठहराव के स्तर तालिका 2 में दिखाया गया है और uniplex और 3 परिसर assays के दोनों में तुलना कर रहे हैं कर रहे हैं. CTnI और सी.के. MB के लिए पता लगाने के स्तर ए एल एस रहेओ 3 चित्र और 2 तालिका में दिखाया गया है. इंटर ऑपरेटर परिवर्तनशीलता दो अलग ऑपरेटरों और परिवर्तनशीलता (सीवी 8.5%) कम होना पाया गया द्वारा समान नमूने (एन = 2, 3 तकनीकी replicates) को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था. अन्य दो calibrators साथ पता लगाने के एंटीबॉडी के पार जेट एकल पता लगाने एंटीबॉडी (चित्रा 4) के साथ सभी तीन calibrators के व्यक्तिगत मानक घटता incubating द्वारा अध्ययन किया गया था. कोई पार जेट अन्य calibrators और पता लगाने के एंटीबॉडी के बीच मनाया गया, जबकि पार जेट के केवल कम राशि सी.के. MB अंशशोधक और cTnI और cMyBP सी का पता लगाने एंटीबॉडी दोनों के बीच देखा गया था.

हृदय की चोट का पता लगाने के लिए परख की प्रयोज्यता के सबूत के रूप में, एमआई के साथ 16 विषयों के सीरम का स्तर एक नियंत्रण समूह (एन = 16) के साथ तुलना की गई. 3 परिसर प्लेट का उपयोग करना, cMyBP सी, सी.के. MB, और cTnI के सीरम का स्तर निर्धारित किया गया है. सभी तीन बायोमार्कर (देखें एमआई विषयों में बढ़ रहे थे12.2 गुना (सी.के. MB) के लिए 3.7 गुना (cMyBP सी) से चित्रा 5), सीरम स्तर में भिन्नता cMyBP सी समूह में सबसे कम था, हालांकि.

प्रक्रिया Uniplex परख 3 परिसर परख
प्रयोग के दिन 0 कब्जा एंटीबॉडी के साथ कोट प्लेट रातभर एन / ए
प्रयोग के दिन 1 थाली ब्लॉक 1 घंटा 30 मिनट
नमूने और मानक श्रृंखला तैयार
नमूने और मानकों के साथ सेते 1 घंटा 2 घंटा
पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ सेते 1 घंटा 1 घंटा
पता लगाने अभिकर्मक जोड़ें और पढ़ाथाली

तालिका 1. Uniplex और मल्टीप्लेक्स assays के कार्यप्रवाह सिंहावलोकन.

LLOD (एनजी / एमएल) LLOQ (एनजी / एमएल) ULOQ (एनजी / एमएल)
cMyBP सी (uniplex) 0.126 ± 0.007 0.567 ± 0.073 400 एनजी / एमएल
cMyBP सी (3plex) 0.057 ± 0.022 0.469 ± 0.171 400 एनजी / एमएल
सी.के. MB (3 परिसर) 0.038 ± 0.014 0.587 ± 0.213 100 एनजी / एमएल
cTnI (3plex) 0.033 ± 0.011 0.147 ± 0.053 25 एनजी / एमएल

तालिका 2. डिटेक्शन uniplex की सीमा और 3 परिसर calibrators. LLOD, पता लगाने की निचली सीमा, रिक्त नमूने के रिक्त + 3 बार मानक विचलन का संकेत की गणना की एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है. 120% - LLOQ, मात्रा का ठहराव की निचली सीमा, एक विचरण के गुणांक (शोर अनुपात करने के लिए संकेत के पारस्परिक) कम से कम 20%, और 80 के बीच एक वसूली के साथ, LLOD से अधिक मूल्य के रूप में परिभाषित किया गया है. 120% - ULOQ, मात्रा का ठहराव की ऊपरी सीमा, विचरण का एक गुणांक कम से कम 20% और 80 के बीच एक वसूली से मापा जा सकता है कि उच्चतम विश्लेषण एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. थाली और कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध सिंहावलोकन. अच्छी तरह से ए) 96 प्लेट दिखाया गया है. हर अच्छी तरह से तीन अलग कब्जा एंटीबॉडी, cMyBP सी खिलाफ यानी, सी.के. MB और cTnI साथ लेपित है. चौथे लाभसक्षम हाजिर नहीं किया जाता है और) बीएसए. बी के साथ 3 परिसर एलिसा के कार्यप्रवाह लेपित है. पूर्व लेपित प्लेट (चरण 1) अवरुद्ध है और फिर सीरम नमूनों या calibrators (चरण 2) प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा और बाध्य करने के लिए अनुमति दी जाती है. उनके संबंधित कब्जा एंटीबॉडी को cMyBP सी (लाल हीरे), सी.के. MB (हरी आयत), और cTnI (नारंगी अंडाकार) बाँध. अनबाउंड प्रोटीन दूर धोने के बाद, sulfo-टैग लेबल का पता लगाने एंटीबॉडी (चरण 3) जोड़ रहे हैं. वे अपने कब्जा एंटीबॉडी के लिए बाध्य कर रहे हैं कि cMyBP सी, सी.के. MB, या cTnI प्रोटीन के लिए बाध्य होगा. अनबाउंड पहचान प्रतिरक्षी दूर धोने के बाद, पढ़ने के लिए बफर जोड़ा जाता है और प्लेट का विश्लेषण किया जाता है. प्लेट के नीचे करने के लिए एक बिजली के संकेत प्रकाश का उत्पादन (चरण 4) के प्रमुख के लिए पढ़ने के लिए बफर के साथ sulfo-टैग की एक स्थानीय रासायनिक प्रतिक्रिया शुरू की. प्रकाश की मात्रा को बाध्य sulfo-टैग लेबल का पता लगाने एंटीबॉडी की राशि के लिए आनुपातिक है. सीसीडी इमेजर पुनःडोरियों प्रकाश और अच्छी तरह से और इसलिए प्रत्येक के भीतर विभिन्न स्थानों प्रत्येक विश्लेष्य (चरण 5) से आने के संकेत भेद कर सकते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. CMyBP सी अंशशोधक का मानक वक्र एक ही मानक श्रृंखला एक uniplex परख में मापा गया था. Uniplex में या 3 परिसर में मापा, और 3 परिसर थाली पर. मानक श्रृंखला 2,000 एनजी / मिली पर शुरू कर दिया और क्रमानुसार 0.128 एनजी / एमएल किया जा रहा सबसे कम एकाग्रता के साथ 5x पतला था. इसके अलावा, मंदक एक खाली नमूना के रूप में इस्तेमाल किया गया था. परख का पता लगाने के क्षेत्र ग्रे में प्रदर्शित किया जाता है. निचली पंक्ति रिक्त संकेत रिक्त मूल्यों के + 3 बार मानक विचलन की गणना की एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है, जो पता लगाने की निचली सीमा (LLOD), इंगित करता है. पता लगाने की ऊपरी सीमा टी के रूप में परिभाषित किया गया हैवह मज़बूती से मापा जा सकता है कि मानक श्रृंखला के सर्वोच्च एकाग्रता. दोनों uniplex और 3 परिसर cMyBP सी मानक घटता तुलना कर रहे हैं. सीमा का पता लगाने 2 तालिका में प्रदर्शित कर रहे हैं. औ: मनमाना इकाइयों.

चित्रा 3
चित्रा 3. सी.के. MB और cTnI का मानक घटता. 3 परिसर प्लेट पर cMyBP सी के साथ एक साथ मापा गया जो सी.के. MB और cTnI का मानक घटता. दोनों calibrators उच्च संवेदनशीलता और एक बड़ी गतिशील रेंज दिखा. ग्रे में परख का पता लगाने के क्षेत्र में प्रदर्शित किया जाता है. निचली पंक्ति रिक्त संकेत रिक्त मूल्यों के + 3 बार मानक विचलन की गणना की एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है, जो पता लगाने की निचली सीमा (LLOD), इंगित करता है. पता लगाने की ऊपरी सीमा मानक से की सर्वोच्च एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है शिक्षा संस्थानों कि मज़बूती से मापा जा सकता है. सीमा का पता लगाने 2 तालिका में प्रदर्शित कर रहे हैं. औ: मनमाना इकाइयों.

चित्रा 4
4 चित्रा. 3 परिसर का पता लगाने के एंटीबॉडी के पार जेट. CMyBP सी, सी.के. MB, और cTnI के अलग मानक घटता तैयार है और 3 परिसर प्लेट पर incubated रहे थे. प्रत्येक मानक वक्र व्यक्ति का पता लगाने एंटीबॉडी (जैसे cMyBP सी) और अन्य calibrators (जैसे सी.के. MB और cTnI) के बीच पार जेट की राशि का आकलन करने के लिए, व्यक्ति का पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ जांच की तुलना में था. पार जेट 3 परिसर परख में कम था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 5. एमआई के सीरम और नियंत्रण विषयों में biomarker के स्तर 3 परिसर परख से मापा. CMyBP सी, सी.के. MB, और cTnI के स्तर एमआई के साथ 16 नियंत्रण विषयों और 16 विषयों के सीरम नमूनों में 3 परिसर परख से एक साथ मापा गया. डेटा बॉक्स और गलमुच्छा भूखंडों (मूंछ 10 वें और 90 वें प्रतिशतक का प्रतिनिधित्व करते हैं) द्वारा प्रदर्शित किया जाता है. सभी तीन बायोमार्कर का स्तर बढ़ा हुआ नियंत्रण समूह के साथ तुलना में एमआई के साथ विषयों के सीरम में मनाया गया. डेटा एक सामान्य वितरण (डी 'Agostino पियर्सन सर्वग्राही द्वारा परीक्षण) नहीं दिखा था, क्योंकि गैर पैरामीट्रिक मान व्हिटनी सांख्यिकीय परीक्षण नियंत्रण और एमआई समूहों के बीच मतभेद के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. # पी <0.001

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Disclosures

मानव शरीर के तरल पदार्थ में cMyBP सी गिरावट और रिलीज के साथ जुड़े जोखिम कारकों का निर्धारण करने के लिए: एक पूर्ण पेटेंट आवेदन (05/04/12. आवेदन सीरियल नंबर 13/464, 466, पब सं अमेरिका 2012/0282618 A1 और तिथि) लंबित है और मानव शरीर के तरल पदार्थ में cMyBP सी का स्तर quantitate.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant Meso Scale Discovery R92TC-2  
Tween-20 Acros 9005-64-5  
MSD Blocker A Meso Scale Discovery R93BA-1  
Phosphate buffered saline, 10X Fisher BioReagents BP399-4 Filter before use
Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free Santa Cruz SC-137180L For coating, antibody has to be gelatin free
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard plate Meso Scale Discovery L15XA-3  
A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB Meso Scale Discovery N452A-1  
ThermaSeal Sealing Film Life Science Products Inc. ST-3098  
MSD SECTOR Imager 2400A Meso Scale Discovery  
MTS 2/4 digital microtiter shaker IKA 3208001  

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 78 सेलुलर जीव विज्ञान जैव रसायन जेनेटिक्स बायोमेडिकल इंजीनियरिंग मेडिसिन कार्डियोलॉजी हृदय रोग myocardial ischemia रोधगलन हृदय रोग हृदय रोग immunoassay हृदय मायोसिन बाध्यकारी प्रोटीन सी हृदय troponin मैं creatine kinase एमबी electrochemiluminescence मल्टीप्लेक्स बायोमार्कर एलिसा परख
Electrochemiluminescence आमापन द्वारा सीरम कार्डिएक मायोसिन बाइंडिंग प्रोटीन सी के निर्धारण के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट Quantitation विधि
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Kuster, D. W. D., Barefield, D., Govindan, S., Sadayappan, S. A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay. J. Vis. Exp. (78), e50786, doi:10.3791/50786 (2013).

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