Summary
복잡한 생물학적 시료의 측정 생체 점점 의사 결정 임상 지침입니다. 우리는 동시에 심장 미오신 결합 단백 C, 크레아틴 키나제 MB, 심근 경색 및 건강한 대조군과 과목에서 혈청 샘플에서 심장 트로포 닌 I를 측정하는 매우 민감한 방법을 설명합니다.
Abstract
바이오 마커뿐만 아니라 기초 과학, 의사 결정 임상에서 점점 더 중요 해지고 있습니다. 진단 심근 경색 (MI)는 주로 심근 손상의 지표로 환자의 혈청 또는 혈장 내 심장 특정 단백질을 감지하여 구동된다. 최근 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C)은 MI 후 혈청에서 감지 할 수 있다는 것을 보여 한, 우리는 MI에 대한 잠재적 인 바이오 마커로 제안했다. 바이오 마커는 일반적으로 전통적인 샌드위치 효소 결합 면역 분석에 의해 감지됩니다. 그러나,이 기술은 큰 샘플 볼륨을 필요로하는 작은 동적 범위를 가지고 있으며, 한 번에 하나의 단백질을 측정 할 수 있습니다.
여기에서 우리는 3 개의 심장 단백질은 높은 감도를 동시에 측정 할 수있는 멀티 플렉스 면역을 보여줍니다. 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌과 uniplex 또는 함께 cMyBP-C를 측정하는 나는 비교 감도를 보여 주었다. 이 기술은 메조 스케일 검색을 사용하여검출 electrochemiluminescence과 함께 96 - 웰 플레이트에 멀티플렉싱 (MSD) 메소드. 단지 작은 샘플 볼륨이 필요하지만, 높은 감도와 넓은 다이나믹 레인지를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 cMyBP-C, 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌 MI 16 과목에서 혈청 샘플에서 나는 수준을 측정하고 16 대조군과 결과를 비교 하였다. 우리는이 샘플에서 세 마커를 감지 할 수 있었고, MI 후 증가 할 세 가지 바이오 마커를 발견했다. 이 기술은 따라서 혈청 샘플에서 심장 생체의 과민 한 탐지에 적합합니다.
Introduction
같은 혈청과 같은 복잡한 생물 학적 샘플, 단백질의 낮은 양의 측정은 환자의 관리뿐만 아니라 기초 과학에 대한 성장 임상 중요하다. 예를 들어, 임상 환경에서 이러한 트로포 닌 I와 같은 심장 바이오 마커의 혈청 수준에있는 증가는 급성 심근 경색 (MI) 1과 일치한다. 그것은 높은 감도를 가지고 있으며, 분석의 절대 정량을 허용으로 혈청에있는 단백질을 검출하는 표준 효소 결합 면역 분석 (ELISA)는 가장 자주 사용되는 기술이다. 그러나 전통적인 ELISAs는 샘플 상대적으로 많은 양의 (일반적으로 100 μL) 필요로하는 일부 생물학적 체액에서 높은 배경 신호를 가지고 있고, ELISA 2 당 하나의 분석의 측정으로 제한됩니다.
최근 새로운 면역 기술은 이러한 단점을 많이 우회하는 도입되었습니다. 이 수정 된 분석은, MSD에 의해 개발, electrochemiluminesc를 사용작은 샘플 볼륨의 사용을 가능하게 매우 낮은 배경과 감도를 증가 수 있습니다 신호 검출을위한 레퍼런스 (ECL). Electrochemiluminescence이 검출 항체에 부착 기자 분자 루테늄 (II) trisbipyridal을 기반으로하고 있습니다. 이 기자 분자들을 3에 통합 된 탄소 전극을 가지고 96 - 웰 플레이트의 바닥의 전기 자극에 620 nm의 빛을 방출한다. 또한, 현장 코팅을 사용하여 여러 개의 캡처 항체는 하나의 견본에 다른 단백질의 동시 정량 있도록 잘 하나 (최대 10 96 - 웰 플레이트에)으로 코팅 할 수 있습니다. 이 기술은 최근 혈청 5,6에서 염증성 사이토 카인 프로파일을 측정하는 데 사용되었습니다. MSD에서 멀티 플레이트는 호의적 다른 멀티 플렉스 분석 플랫폼 7 비교합니다.
기본 분석 플랫폼으로 MSD 사용하여, 우리는 또한 3 플렉스 플레이트를 만든 사용자 지정을 개발하는 C동시에 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C), 크레아틴 키니 아제 MB (CK-MB), 및 심장 트로포 닌 I (cTnI는)의 수준을 정량화하고, 결과는 cMyBP-C의 monoplex 감지 하였다. CK-MB 및 cTnI는 미시간 잘 확립 된 생체 있습니다. 그러나 이러한 생체의 증가는 예를 들어, 심근염이나 신장 장애 8, MI 이외의 병리에 의해 발생할 수 있습니다. 이 MI 진단의 특이도를 높이기 위해 추가로 생체의 추가를 위해 주장하고있다. 우리는 최근 cMyBP-C는 MI 9에 대한 잠재적 인 바이오 마커 것으로 나타났습니다. cMyBP-C은 심장 아니라 골격이나 부드러운 근육에 10-12로 표현 두꺼운 필라멘트 연관된 단백질이다. 따라서, 순환 시스템의 cMyBP-C의 증가 수준은 심장 손상 13의 특정 지표입니다.
본 연구에서는 혈청 수준을 측정하기 위해 사용자 지정 3 복잡한 분석의 사용과 cMyBP-C의 uniplex 검출 비교cMyBP-C, CK-MB, 및 MI 환자의 혈청 cTnI는. 미래에이 서명 기법은 응급실에서 흉통 함께 제시 환자에서 MI를 진단하는 데 사용할 수 있습니다.
Loyola 대학 시카고의 기관 심의위원회 (IRB)는 deidentified 인간의 샘플의 사용과 면역의 사용 (LU # 20392)에 대한 연구를 승인했다.
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Protocol
1. Uniplex cMyBP-C의 분석
- 캡처 항체 실험, 코트는 96 - 웰 MSD 베어 표준 플레이트 전날. cMyBP-C의 경우, 5 ㎍ / 인산에 희석 ML의 농도로 마우스 단일 클론 항 cMyBP-C 항체 (젤라틴 무료)의 30 μL 볼륨을 사용 (PBS) 염분 버퍼.
- 잘 소수성이기 때문에, 잘 하단 모서리에 솔루션을 피펫, 다음 전체도에 걸쳐 솔루션을 확산 판의 측면을 누릅니다.
- 플레이트는 플레이트 봉인으로 덮여 떨고없이 ° C 4에서 O / N을 배양한다.
- 싱크대 후 종이 수건의 스택에 해결책을 눌러 캡처 항체 솔루션을 제거합니다. 판에 비 특정 바인딩은 5 % (W / V) 차단 각각의 well에 PBS에서 A (고급 BSA) 용액 150 μl를 추가하여 차단됩니다.
- 700 rpm으로 흔들어 RT에서 1 시간 동안 접시와 부화를 밀봉하십시오.
- 차단 단계에서 표준을 준비하고의불가능한 명령어. 1 % 2,000 NG / ML (W / V) 차단 PBS /의 시작 농도 - 재조합 cMyBP-C 단백질 조각 (271 아미노산 1)을 희석하여 표준 시리즈를 확인합니다. 다음 직렬 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 5 배 희석. 7 기준 총 + 1 빈 (1 % (W / V) 차단기 A / PBS 만)을 사용 하였다.
- 차단 솔루션을 제거하고 150 μL 0.05 % (v / v)의 Tween-20/PBS와 배 접시를 씻으십시오. 때마다, 싱크대 위의 반전 플레이트 세척 용액을 제거. 세 번째 세척 단계 후, 적극적으로는 싱크대 접시를 가볍게하고 완전히 건조 될 때까지 종이 타월 레이어에 적극적으로 판을 두드려. 배양 볼륨이 작아서 이것은 중요한 단계이며, 나머지 세척 솔루션은 크게 다음의 배양을 희석합니다.
- 우물에 표준 시료의 피펫 25 μL. 1 시간 동안 700 rpm으로 흔들어 동안 RT에서 접시와 부화를 밀봉하십시오.
- 1 % 차단 / PBS에 1 ㎍ / ㎖에서 검출 항체 솔루션을 준비합니다. CUMSD 설포-TAG 라벨 검출 항체의 역할에 - STOM은 cMyBP-C 항체 (14 항원 아미노산 2)를 만들었다. 키트는 어떤 항체를 레이블링하는 비교적 간단한 절차를 만들고, 설포-TAG 라벨에 사용할 수 있습니다.
- 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
- 각각의 well에 탐지 항체 용액 25 μl를 추가, 쉐이커 700 rpm으로 설정 한 접시에 1 시간 동안 RT에서 플레이트와 부화를 밀봉하십시오.
- 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어 (시약 섹션 참조)의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한, 15 ML 증류수에 배속 읽기 버퍼의 5 ML을 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석.
- 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 well에 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 기포 (역 피펫은 적절한 방법이다)을 방지해야합니다. 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야에서 접시를 스캔영상.
2. 3 복잡한 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 분석
- 96 - 웰 3 - 플렉스 플레이트와 희석제 솔루션은 사용하기 전에 RT 평형을 할 수 있습니다. 이 판은 MSD에 의해 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 대한 캡처 항체 사전 코팅.
- 1 % (w / v)의 차단 각각의 well에 A / PBS의 25 μl를 추가합니다. 전체도이 솔루션이 포함되어 있는지 확인하기 위해 접시의 측면을 누릅니다.
- 플레이트 봉인 플레이트를 밀봉 판 뿌리에 접시를 놓고 30 분간 700 rpm으로 흔들어.
- 한편, 개별 교정기의 희석 시리즈는 준비가되어 있습니다. 각 잘 개의 캡처 항체를 가지고 있기 때문에 세 교정기는 혼합 수와 직렬로 사용하기 전에 희석해야합니다. 2000 NG / ML cMyBP-C, 100 NG / ML로 하나의 샘플을 만드는 1 %에 함께 재조합 cMyBP-C, CK-MB (MSD) 및 cTnI는 (MSD) (W / V) 차단기 A / PBS에 희석 CK- MB, 25 NG / ML cTnI는 (샘플).
- 최소 100 μL의 최종 볼륨은 각 표준에 대한 준비가되어 있습니다. 에표준 시리즈를 완료 순차적으로 샘플 5 배 희석 있습니다. 시료 25 μl를 사용하여 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단제 샘플 C를 만들려면 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에서 샘플 B의 25 μl를 사용하는 다음 예제 B.를 만들 수있는 A / PBS에 , 등등. MI 16 과목과 16 명의 대조군에서 혈청 샘플은 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 수준을 측정하는 데 사용되었다. 이러한 샘플은 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 2 배 희석 하였다.
- 3 플렉스 플레이트의 우물에 이미 25 μL를 기준 희석 한 시료 25 μl를 추가합니다. 또한 빈 (전용 희석제)를 포함하는 것이 중요합니다. 방법을 설정하려면, 샘플 기술 triplicates로드됩니다. 그렇지 않으면, 중복 충분하다.
- 다시 플레이트를 밀봉 (플레이트 봉인을 재사용 할 수 있습니다) 2 시간 동안 RT에서 접시 흔드는 (700 RPM)에 품어.
- 부화가 완료되기 전에, 탐지 항체 솔루션이 준비되어 있습니다. 사용 희석제는 PBS에 1 % (w / v)의 차단이다. 모든 THR전자 설포 태그가 검출 항체 1 ㎍ / ㎖ 각각의 최종 농도에 함께 희석된다. 탐지 항체는 일반적으로 50X 주식 농도에 제공됩니다.
- 전체 96 - 웰 플레이트에 대해 총 희석 용액 2,700 μL를 (에러 포함 피펫과)가 필요합니다. 2,538 ㎕의 1 % (w / v)의 차단 PBS / 각 검출 항체의 54 μl를 추가합니다.
- 2 시간 후, 적극적으로 싱크대 위에 접시를 가볍게 치면 솔루션을 제거합니다. 0.05 % PBS에서 트윈-20의 150 μL와 우물 배를 씻으십시오. 에 탐지 항체 솔루션의 25 μl를 추가하는 각 잘 멀티 채널 피펫을 사용하고 접시의 측면은 전체도이 솔루션이 적용되도록 탭합니다.
- 플레이트를 밀봉하고 700 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 배양한다.
- 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한의 배속 읽기 5 mL를 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석15 ML 증류수로 버퍼입니다.
- 단계 2.8에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
- 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 공기 방울을 피하는 것이 중요하다 (역 피펫은 적절한 방법입니다.) 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야 영상의 플레이트를 검사합니다.
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Representative Results
3 복잡한 분석의 기본 원칙과 워크 플로우는 그림 1에 표시되며 전체 워크 플로우는 표 1에 설명되어 있습니다. Uniplex의 분석은 전체 바닥이 잘 한 캡처 항체로 코팅 된 것을 제외하고는 동일한 원리에 따라 작동합니다. 신호 검출 전기 신호가 잘 하단에 적용되는 ECL에 의해 이루어집니다. 이것은, 차례로, 검출 항체에 설포-TAG 레이블 읽기 버퍼의 화학 반응을 통해 빛의 현지 생산을 시작합니다. 이 낮은 배경 및 분석의 높은 감도로 연결됩니다. 그림 2에서 uniplex 분석에 cMyBP-C의 표준 곡선은 3 복잡한 분석에 cMyBP-C의 비교됩니다. 두 분석은 매우 높은 민감도와 높은 동적 범위를 보여줍니다. 탐지 수준 및 정량화 수준은 표 2와 uniplex 3 - 플렉스 분석 모두에서 비교할 수 있습니다. cTnI는 및 CK-MB에 대한 탐지 수준은 ALS 수 있습니다O는 그림 3과 표 2에 나타내었다. 운영자 간 변동성은 두 개의 서로 다른 연산자와 변동성 (CV 8.5 %) 낮은 것으로 나타났다 의해 동일한 샘플 (n = 2, 3, 기술은 복제)를 측정하여 결정 하였다. 다른 두 교정기와 검출 항체의 교차 반응성은 하나의 검출 항체 (그림 4)와 세 교정기 개별 표준 곡선을 잠복기에 의해 연구되었다. 더 교차 반응이 다른 교정기 및 탐지 항체 사이에 관찰하는 동안 교차 반응 만 낮은 금액은 CK-MB 교정기와 cTnI는 및 cMyBP-C 검출 항체 모두 사이 보였다.
심장 손상의 탐지를위한 분석의 적용의 증거로, MI 16 과목의 혈중 농도는 대조군 (n = 16)과 비교 하였다. 3 플렉스 플레이트 사용 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 혈청 수준이 결정되었다. 세 생체는 (참조 MI 과목에서 증가 하였다12.2 배 (CK-MB)의 3.7 배 (cMyBP-C)에서 그림 5), 혈중 농도의 변화가 cMyBP-C 그룹에서 가장 낮은 이었더라.
| 방법 | Uniplex 분석 | 3 복잡한 분석 | |
| 실험 0 일 | 캡처 항체 코팅 플레이트 | 밤새 | N / A |
| 실험 1 일 | 접시를 차단 | 1 시간 | 30 분 |
| 샘플 및 표준 시리즈를 준비 | |||
| 샘플 및 기준을 품다 | 1 시간 | 2 시간 | |
| 검출 항체와 배양 | 1 시간 | 1 시간 | |
| 검출 시약을 추가하고 읽기판 |
표 1. uniplex 및 다중 분석의 워크 플로우 개요.
| LLOD (NG / ML) | LLOQ (NG / ML) | ULOQ (NG / ML) | |
| cMyBP-C (uniplex) | 0.126 ± 0.007 | 0.567 ± 0.073 | 400 NG / ML |
| cMyBP-C (3plex) | 0.057 ± 0.022 | 0.469 ± 0.171 | 400 NG / ML |
| CK-MB (3 플렉스) | 0.038 ± 0.014 | 0.587 ± 0.213 | 100 NG / ML |
| cTnI는 (3plex) | 0.033 ± 0.011 | 0.147 ± 0.053 | 25 NG / ML |
표 2. 검출 uniplex의 한계와 3 플렉스 교정기. LLOD, 검출 하한치는 빈 샘플의 빈 + 3 배 표준 편차 신호의 계산 된 농도로 정의됩니다. 120 % - LLOQ, 정량 하한은 분산 계수 (잡음 대 신호 비율의 역수)보다 낮은 20 %와 80 사이의 회복, LLOD보다 높은 값으로 정의됩니다. 120 % - ULOQ, 정량 상한, 분산 계수보다 낮은 20 %와 80 사이의 복구를 측정 할 수있는 가장 높은 분석 농도로 정의됩니다.
그림 1. 플레이트 및 워크 플로우의 개략도. 잘) 96 플레이트가 표시됩니다. 각 웰은 세 가지 다른 캡처 항체 cMyBP-C에 대한 즉, CK-MB 및 cTnI는 코팅되어 있습니다. 네 번째 소용수있는 자리는 사용되지 않으며) BSA. B와 3 플렉스 ELISA의 흐름을 입힌다. 미리 코팅 된 플레이트 (1 단계)의 슈팅이 된 후 혈청 또는 교정기 (2 단계) 각 well에 추가하고 바인딩 할 수 있습니다. 해당 캡처 항체 cMyBP-C (레드 다이아몬드), CK-MB (녹색 사각형) 및 cTnI는 (주황색 타원형) 바인드 할 수 없습니다. 언 바운드 단백질을 멀리 세척 후, 설포-TAG-라벨 탐지 항체 (3 단계) 추가됩니다. 그들은 캡처 항체에 바인딩 된 cMyBP-C, CK-MB, 또는 cTnI는 단백질에 바인딩합니다. 언 바운드 탐지 항체를 멀리 세척 후 읽기 버퍼가 추가되고 플레이트가 분석됩니다. 접시의 바닥에 전기 신호를 빛의 생산 (4 단계)로 이어지는, 읽기 버퍼 설포-TAG 지역의 화학 반응을 시작합니다. 빛의 양이 바인딩 설포-TAG 레이블 검출 항체의 양에 직접 비례합니다. CCD 이미 저를 다시코드는 빛을 잘 따라서 각 내의 다른 장소 각 분석 (5 단계)에서 나오는 신호를 구분할 수 있습니다.
그림 2. cMyBP-C 교정기의 표준 곡선은 동일한 표준 시리즈는 uniplex 분석에서 측정 하였다. uniplex 또는 3 플렉스에서 측정하고 3 복잡한 접시에. 표준 시리즈는 2000 NG / ML에서 시작하고 순차적으로 0.128 NG / ML되는 낮은 농도의 5 배 희석되었다. 또한, 희석제는 빈 샘플로 사용 하였다. 분석의 감지 영역은 회색으로 표시됩니다. 하단 라인은 빈 신호 빈 값 + 3 배의 표준 편차의 계산 된 농도로 정의됩니다 검출 하한치 (LLOD)를 나타냅니다. 검출 상한 t로 정의됩니다그는 신뢰성있게 측정 할 수있는 표준 시리즈의 높은 농도. 두 uniplex 3-플렉스 cMyBP-C 표준 곡선을 비교합니다. 검출 한계는 표 2에 표시됩니다. AU : 임의의 단위.
그림 3. CK-MB 및 cTnI는의 표준 곡선. 3 플렉스 접시에 cMyBP-C를 동시에 측정 하였다 CK-MB 및 cTnI는 표준 곡선. 두 교정기는 높은 감도와 넓은 다이나믹 레인지를 보여줍니다. 회색 분석의 감지 영역이 표시됩니다. 하단 라인은 빈 신호 빈 값 + 3 배의 표준 편차의 계산 된 농도로 정의됩니다 검출 하한치 (LLOD)를 표시합니다. 검출의 상한은 표준 자체의 높은 농도로 정의됩니다 리스는 그 신뢰성있게 측정 할 수 있습니다. 검출 한계는 표 2에 표시됩니다. AU : 임의의 단위.
그림 4. 3 복잡한 검출 항체의 교차 반응. cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 별도의 표준 곡선은 준비 3 - 플렉스 접시에 배양 하였다. 각각의 표준 곡선은 개별 탐지 항체 (예 : cMyBP-C) 및 다른 교정기 (예를 들어, CK-MB 및 cTnI는) 사이의 교차 반응성의 양을 평가하기 위해, 각각의 검출 항체 탐색보다이었다. 교차 반응성 3 복잡한 분석에서 낮았다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 5. MI의 혈청과 대조군의 바이오 마커 레벨 3 복잡한 분석으로 측정 하였다. cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는의 수준은 MI 16 제어 과목 16 과목의 혈청 샘플에서 3 복잡한 분석에 의해 동시에 측정 하였다. 데이터 상자 수염 플롯 (수염은 10 세기와 90 번째 백분위 수를 나타냅니다)으로 표시됩니다. 세 생체의 증가 수준은 대조군에 비해 심근 경색 과목의 혈청에서 관찰되었다. 데이터가 정규 분포 (D' Agostino의 피어슨 옴니버스 의해 테스트)를 표시하지 않았기 때문에 비모수 맨 - 휘트니 통계적 테스트는 제어 및 MI 그룹 간의 차이를 테스트하는 데 사용되었다. # P <0.001
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Discussion
본 연구에서는 환자의 혈청에서 여러 심장 바이오 마커의 검출을위한 다중 면역의 적용을 보여줍니다. 이 기술은 기존의 ELISA를 통해 많은 장점이 있습니다. 첫째, 분석 키트 ECL은 비색 검출 대신 사용됩니다. ECL에서 전기 신호, 따라서 배경 14 감소 신호의 자극 이벤트를 연결을 풀기, 측정 속성 (빛)의 현지 생산을 자극한다. 이 표 2에서 볼 수 있듯이, 높은 감도 수 있습니다.
분석을 다중화하여 그림 2와 표 2에서 볼 수 있듯이, cMyBP-C의 검출 감도의 손실이 발생하지 않습니다. uniplex 측정 cMyBP-C는 CK-MB 및 cTnI는 13으로 동시에 측정 cMyBP-C에 비해 감도 및 감지 범위를 보여 주었다. 동시 측정은 실질적으로 measuremen에 필요한 시료의 양을 줄일 수희귀 생물 학적 샘플 작업뿐만 아니라 시간을 단축 할 때 중요한 요소가 될 수있는 TS는 여러 uniplex 분석 실험을 진행하는 데 소요 된 시간.
모든 면역과 마찬가지로, 분석은 사용 된 항체의 품질에 크게 의존합니다. 캡처 및 탐지 항체의 친화력, 특이하고, 욕망은 분석 15의 감도의 주요 결정 요인이다. 다른 항체 쌍은 높은 감도와 동적 범위를 제공합니다 캡처 및 탐지 항체의 조합을보고 시도해야한다. 다중화 기술을 사용하면 캡처 항체는 잘에 자리 코팅해야합니다. 이 낮은 볼륨이 고농도 용액 uniplex 분석 또는 기존의 ELISA에 사용되는 용액 코팅과 달리 잘 부분 (그림 1 참조) 발견을 의미합니다. 이 용액 코팅 마찬가지로 캡처 항체 반점 코팅뿐만 아니라 수행하는 경우이 평가되어야한다. 의 교차 반응다른 항체 쌍 항체 나 교정기는 거짓 긍정적 인 결과 2,15 상승을 줄 수 있습니다.
이 연구를 위해 맞춤 제작 한 멀티 플렉스 플레이트는 MSD와 공동으로 설계되었습니다. 사전 코팅 멀티 플렉스 플레이트의 범위를 상업적으로 사용할 수 있지만 소설 (cMyBP-C) 대상이 이전에 최적화 된 카탈로그 분석 (CK-MB 및 cTnI는)와 멀티 플렉스 되었기 때문에이 특정 혁신은 분석의 최적화를 요구했다. 따라서,이 방법의 명백한 단점은 특수 플레이트 리더와 ECL 신호를 감지하는 전극을 포함하는 플레이트에 대한 추가 요구 사항입니다. 여러 uniplex의 분석 대 한 멀티 플렉스 분석을 실행하는 전체 비용을 줄일 수 있지만, 플레이트 리더는 처음 2를 구입해야합니다.
3 플렉스 면역을 사용하여 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는의 바이오 마커 방출의 수준은 MI과 과목에서 측정하고 대조군과 비교 하였다. 일에 증가 접이식 변화전자 대조군 (그림 4 참조) 세 가지 바이오 마커 사이의 차이와 같은 MI 그룹의 변화를했다. 가능성이 순환 심장 단백질과 그 이후 저하의 방출에 기여하는 혈액 샘플링, 경색의 크기뿐만 아니라 다른 요인의 호스트 타이밍으로 바이오 마커 수치의 변화는 MI 환자의 컬렉션 예상된다. 개인 생체의 수준이 같은 경색 크기 임상 매개 변수와 상관 관계 여부 영장 추가 연구.
MI를 감지하는 응급실에서 사용하는 바로 이러한 연구 결과를 번역하는 것은 극복 할 도전의 번호를 필요로합니다. 그 중 소수는 프로토콜도 사전 코팅 플레이트로 3 ½ 시간이 걸립니다 결과를 생성하는 데 걸리는 시간입니다. 오늘날 사용되는 트로포 닌 분석과 마찬가지로, 분석은 신속한 진단을 가능하게 빠른 탐지를 위해 최적화되어야한다.
결론적으로, 우리는 두 가지가 알고있는 서명 분석을 개발 한N 심장 바이오 마커와 하나의 잠재적 인 심장 바이오 마커, cMyBP-C는 동시에 심장 단백질의 혈청 역가의 정량, 미시간 환자에서 심근 손상의 존재를 감지하는 입증되었다.
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Disclosures
인간의 체액에 cMyBP-C 저하 및 배출과 관련된 위험 요인을 결정하는 : 전체 특허 출원 (05/04/12. 응용 프로그램 일련 번호 464분의 13, 466, 펍 번호 미국 2012 / 0282618 A1) 및 Date (날짜) 보류 인간의 체액에 cMyBP-C의 수준을 정량.
Acknowledgments
이 연구는 건강 보조금 국립 연구소 R01HL105826 및 K02HL114749 (박사 Sadayappan)와 미국 심장 협회 중서부 장학금에 의해 투자되었다; 11PRE7240022 (씨 Barefield)와 13POST14720024 (박사 Govindan). 저자는 기꺼이 분석을 개발하고 그들의 우수한 기술과 문학 지원을위한 박사 지미 페이지, 질 Clampit 박사 존 허드슨, MSD의 도움을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
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