Summary
Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Biyolojik hem de temel bilim, karar verme klinik giderek daha önemli hale gelmektedir. Teşhis miyokard infarktüsü (Mİ) büyük ölçüde miyokard hasarının bir göstergesi olarak hastaların serum veya plazma kardiyak-spesifik proteinlerin tespit ile tahrik edilir. Son zamanlarda kardiyak miyosin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), MI sonrası serum içinde tespit olduğunu göstermiştir, biz MI için potansiyel bir biyolojik olarak önerilmiştir. Biyolojik genellikle geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent testleri ile tespit edilir. Ancak, bu teknik, büyük bir örnek hacmi gerektiren küçük bir dinamik aralık vardır ve bir seferde sadece bir protein ölçebilirsiniz.
Burada üç kalp proteinler yüksek hassasiyet ile eş zamanlı olarak ölçülebilir hangi çok katlı bir bağışıklık göstermektedir. Kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin ile UNIPLEX veya birlikte cMyBP-C Ölçüm ben karşılaştırılabilir duyarlılık gösterdi. Bu teknik Mezo Ölçeği Discovery kullanırTespiti için elektro ile birlikte bir 96 oyuklu plaka çoğullama (MSD) yöntemi. Sadece küçük bir örnek hacimleri gerekli iken, yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık elde edilir. Bu tekniği kullanarak, cMyBP-C, kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin MI ile 16 denekten serum örneklerinde Ben düzeyleri ölçüldü ve 16 kontrol grubu ile sonuçlar karşılaştırıldı. Biz bu örnekleri her üç işaretleri tespit başardık ve MI sonrası artmış olduğu üç biyolojik bulundu. Bu teknik, bu nedenle, serum numuneleri kalp biyolojik arasında hassas bir şekilde tespit uygundur.
Introduction
Örneğin, serum gibi karmaşık biyolojik örnekler, protein düşük miktarda ölçümü hasta yönetimi, hem de temel bilim için artan bir klinik önem taşımaktadır. Örneğin, bir klinik ortamda bu troponin I gibi kardiyak biyolojik serum, artış akut miyokard infarktüsü (Mİ) 1 ile tutarlıdır. Bu yüksek hassasiyete sahiptir ve analit ölçümü için mutlak izin verdiği serum örneklerinde proteinleri saptamak için, standart bir enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), en sık kullanılan bir tekniktir. Ancak, geleneksel ELISA, örneğin nispeten büyük miktarda (tipik olarak 100 ul) gerektiren bazı biyolojik akışkanlar içinde yüksek bir arka plan sinyali, ve ELISA 2 başına sadece bir analit ölçümü ile sınırlıdır.
Son zamanlarda, yeni bir immunoassay tekniği bu sakıncaları birçok circumvents geçilmiştir. Bu modifiye tahlil, MSD tarafından geliştirilen, electrochemiluminesc kullanırKüçük bir numune hacimlerinin kullanımını mümkün kılmak için çok düşük arka plan ve artan bir hassasiyet sağlayan sinyal tespiti için etkisiyle (ECL). Elektro algılama antikorlara bağlı raportör molekülün rutenyum (II) 'trisbipyridal esas alınmaktadır. Bu, raportör molekülün bunları 3 entegre karbon elektrot olan 96-kuyulu plakanın alt elektriksel stimülasyonu üzerine 620 nm'de ışık yayar. Ayrıca, spot kaplama kullanılarak, birden çok yakalama antikorları, tek bir örnek 4, farklı proteinlerinin aynı anda ölçümü sağlayan, iyi bir (en fazla 10, 96 oyuklu plaka) halinde kaplanabilir. Bu teknik en son serum 5,6 proinflamatuar sitokin profilleri ölçmek için kullanılmıştır. MSD gelen çok katlı levhalar olumlu diğer çok katlı testi platformlara 7 karşılaştırmak.
Birincil test platformu olarak MSD kullanarak, daha fazla 3-karmaşık plaka yapılmış bir özel geliştirilen cbir anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinaz MB (CK-MB) ve kardiyak troponin I (cTnI) seviyesini ölçmek ve sonuçları cMyBP-C Monoplex tespiti ile karşılaştırıldı. CK-MB ve cTnI MI için köklü biyolojik bulunmaktadır. Ancak bu biyolojik artışlar örneğin miyokardit veya böbrek yetmezliği 8, MI dışındaki patolojiler neden olabilir. Bu MI tanı özgünlüğünü artırmak için ek biyolojik eklenmesi için savunuyor. Son zamanlarda cMyBP-C de mi 9 için potansiyel bir biyolojik olduğunu göstermiştir. cMyBP-C kalp, iskelet veya değil, düz kaslarda, 10-12 olarak ifade edilir, kalın filaman ilişkili bir proteindir. Bu nedenle, kan dolaşım sistemi içinde cMyBP-C artan seviyesi kalp hasarı 13 belirli bir göstergesidir.
Bu çalışmada, serum seviyelerinin ölçülmesi için özel bir 3-Plex tahlilin kullanımı ile cMyBP-C UNIPLEX tespiti görecMyBP-C, CK-MB ve MI hastaların serum cTnI. Gelecekte, bu imza teknik acil serviste göğüs ağrısı ile başvuran hastalarda MI teşhis etmek için kullanılabilir.
Loyola University Chicago kurumu inceleme kurulu (KİK) deidentified insan örneklerinin kullanımı ve immunoassay ve kullanımı (LU # 20392) için çalışmayı onayladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. UNIPLEX cMyBP-C Testi
- Yakalama antikor ile deney, kat 96-MSD çıplak standart plaka önceki gün. CMyBP-C, 5 mg / fosfat içinde seyreltilmiş ml 'lik bir konsantrasyonda, fare monoklonal anti-cMyBP-C antikoru (jelatin serbest) bir 30 ul hacim kullanımı salin (PBS) tamponlu.
- Iyi hidrofobik olduğu için, kuyunun dibinde köşeye çözüm pipetle, daha sonra tüm aşkın çözüm yaymak için plaka yanlarına dokunun.
- Plaka plaka örtücü ile kaplı ve sallayarak olmadan 4 ° C'de O / N inkübe edilir.
- Bir lavabonun üzerinde ve sonra kağıt havlu bir yığın çözüm dokunarak yakalama antikor çözüm çıkarın. Plakasına Spesifik olmayan bağlanma,% 5 (w / v) engelleyici her oyuğa PBS içinde bir (yüksek dereceli BSA) çözeltisi 150 ul ilave edilerek bloke edilmiştir.
- 700 rpm'de çalkalayarak, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe plakası ve Seal.
- Bloke adım sırasında, standart hazırlama ve Sdepas'lar. 1% 2.000 ng / ml (k / h) engelleyici bir PBS / bir başlangıç konsantrasyonuna - Rekombinant cMyBP-C protein parçası (271 amino asit 1) seyreltilmesi ile standart seri olun. Daha sonra seri olarak% 1 (w / v) 'engelleyici ° C'de PBS / 5 oranında seyreltilir. 7 standartları toplam + 1 boş (% 1 (w / v) 'engelleyici A / PBS) kullanılmıştır.
- Bloke etme çözeltisi uzaklaştırılır ve 150 ul% 0.05 (v / v) ile 3 kez Tween-20/PBS plaka yıkayın. Her zaman, bir lavabo üzerinde ters plaka ile yıkama solüsyonu çıkarın. Üçüncü yıkama adımdan sonra, şiddetle bir lavabonun üzerinde plaka fiske ve tamamen kuruyana kadar kağıt havlu tabakası üzerinde şiddetle plaka pat. Kuluçka hacimleri küçük gibi bu, çok önemli bir adımdır, ve kalan yıkama solüsyonu önemli ölçüde bir sonraki kuluçka sulandırmak olur.
- Kuyulara standartlar ve numuneler bir pipetle 25 ul. 1 saat boyunca 700 rpm'de çalkalayarak, oda sıcaklığında plaka ve inkübe Seal.
- % 1 engelleyici / PBS içinde 1 ug / ml 'de tespit antikor çözeltisi hazırlayın. Bir CuMSD sülfo-TAG etiketleme algılama antikoru olarak hizmet ile - zel cMyBP-C antikoru (14 epitop amino asitler 2) yapılmıştır. Kitler, herhangi bir antikor etiketlemek için nispeten basit bir işlem yapmak, sülfo-TAG etiketleme için kullanılabilir.
- , Adım 1.4 'de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin.
- Her kuyucuğa algılama antikor çözeltisi 25 ul ekle çalkalayıcı 700 rpm'de bir plaka üzerine, 1 saat boyunca oda sıcaklığında ve plaka ve inkübe mühür.
- Kuluçka döneminde, Sektör Görüntüleyici ve yazılım (Reaktif bölüm bakınız) uygun çalışmasını sağlamak için MSD demo-levha (LED ışıkları ile plaka) çalıştırın. Aynı zamanda, 15 ml distile su ile 4x salt tampon 5 ml eklenerek MSD tarafından sağlanan salt tampon, seyreltin.
- , Adım 1.4 'de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun salt tampon 150 ul ekleyin. Hava kabarcıkları (ters pipetleme uygun bir yöntemdir) önlemek için emin olun. Salt tamponu ilave edildikten sonra hemen Sektördeki plaka taramaGörüntüleyici.
2. 3-karmaşık cMyBP-C, CK-MB ve cTnI Testi
- 96 oyuklu bir plaka 3-Plex ve bir seyreltici solüsyonların kullanımı daha önce oda sıcaklığına kadar denge sağlaması için izin verilmiştir. Bu plaka MSD tarafından cMyBP-C, CK-MB ve cTnI için yakalama antikorlar ile ön kaplı.
- % 1 (w / v) 'engelleyici her bir A / PBS içinde 25 ul ekle. Tüm iyi çözüm kapalı olduğundan emin olmak için plaka yanlarına dokunun.
- Bir tabak mühürleyen ile plaka mühür, bir plaka çalkalayıcı plaka yerleştirin ve 30 dakika için 700 rpm'de sallayın.
- Bu arada, bireysel kalibratörlerin bir seyreltme serisi hazırlanır. Her iyi üç yakalama antikorlar olduğu için üç kalibratör karışık olması ve seri olarak kullanılmadan önce seyreltilmiş gerekir. 2.000 ng / ml 'cMyBP-C, 100 ng / ml' si ile bir örnek oluşturmak için% 1 birlikte yeniden birleştirici cMyBP-C, CK-MB (MSD) ve cTnl (MSD) (w / v) 'engelleyici A / PBS ile seyreltilir CK- MB ve 25 ng / ml cTnI (örnek A).
- En az 100 ul son hacim, her bir standart için hazırlanmıştır. KarşıStandart seri tamamlamak, seri örneklerin 5 kat olan sulandırmak. Örnek, 25 ul kullanarak bir 100 ul% 1 (w / v) 'engelleyici örnek oluşturmak C için 100 ul% 1 (w / v)' engelleyici A / PBS içinde örnek B 25 ul kullanımı, daha sonra örnek B'yi oluşturmak için A / PBS içinde ve benzeri. MI ile 16 konu ve 16 kontrol grubu insan serum örneklerinde cMyBP-C, CK-MB ve cTnI düzeylerini ölçmek için kullanıldı. Bu örnekler,% 1 (w / v) 'engelleyici A / PBS içinde 2x seyreltilmiştir.
- 3-Plex plaka gözenekleri içinde zaten mevcut olan 25 ul standart ve seyreltilmiş numune, 25 ul ekle. Ayrıca, boş (sadece seyreltici) dahil edilmesi önemlidir. Tekniğin kurmak için, numuneler teknik üçlü olarak yüklenir. Aksi takdirde, çiftleri yeterlidir.
- Tekrar plaka Seal (plaka örtücü yeniden kullanılabilir) ve 2 saat oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı (700 rpm) üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
- Kuluçka tamamlandıktan hemen sonra, algılama antikoru çözeltisi hazırlanır. Kullanılan seyreltici, PBS içinde% 1 (w / v) 'engelleyici. Tüm thrEE sülfo-etiketli antikorlar tespit 1 ug / ml her biri bir son konsantrasyon halinde bir araya seyreltilir. Algılama antikorlar tipik bir 50x stok konsantrasyonu sağlanır.
- Tam 96 oyuklu plaka için, toplam seyreltik çözeltinin 2.700 ul (hata dahil pipetleme ile) gereklidir. 2.538 ul% 1 (w / v) 'engelleyici bir PBS / her bir algılama antikoru 54 ul ekle.
- 2 saat sonra, şiddetle bir lavabo üzerinde plaka hafifçe vurarak çözümler çıkarın. PBS içinde% 0.05 Tween-20 150 ul ile kuyu 3x yıkayın. Algılama antikor çözeltisi 25 ul her bir çok kanallı bir pipet kullanarak, ve plaka iki tüm iyi çözelti ile kapalı olduğundan emin olmak için aday edilir.
- Plaka sızdırmaz ve 700 rpm'de çalkalayarak, 1 saat boyunca inkübe edilir.
- Kuluçka döneminde, Sektör Görüntüleyici ve yazılım düzgün çalışmasını sağlamak için MSD demo-levha (LED ışıkları ile plaka) çalıştırın. Ayrıca 4x oku-5 ml eklenerek MSD tarafından sağlanan salt tampon, seyreltik15 ml distile su için tampon.
- Adım 2.8 'de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin.
- De, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir salt tampon 150 ul ekleyin. Hava kabarcıkları kaçınmak önemlidir (ters pipetleme uygun bir yöntemdir). Salt tamponu ilave edildikten sonra hemen Sektör Imager plaka tarama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3-Plex tahlilinin temel ilkeler ve akışı Şekil 1 'de gösterilmektedir ve genel akışı Tablo 1' de tarif edilmektedir. UNIPLEX deneyleri tüm alt iyi bir yakalama antikor ile kaplı olması dışında aynı prensip boyunca çalışır. Sinyal algılama bir elektrik sinyali kuyunun dibine uygulandığı ECL yapılır. Bu da, algılama antikoru üzerindeki sülfo-etiketi ile salt tampon, bir kimyasal reaksiyon yoluyla bir ışık yerel üretimini başlatır. Bu, düşük arka plan ve analiz için yüksek hassasiyet yol açar. Şekil 2'de, UNIPLEX tahlilinde cMyBP-C standart eğri 3-Plex tahlilinde cMyBP-C olduğu karşılaştırılır. Her iki testleri çok yüksek hassasiyet ve yüksek dinamik aralık göstermektedir. Algılama seviyesi ve ölçüm seviyeleri, Tablo 2'de gösterilen ve UNIPLEX ve 3-Plex tahliller hem de karşılaştırılabilir vardır. CTnI ve CK-MB için algılama düzeyleri als vardıro Şekil 3 ve Tablo 2'de gösterilmiştir. Operatörler arası değişkenliği iki farklı operatörler ve değişkenliği (CV% 8.5) düşük olduğu bulunmuştur ile aynı numuneler (n = 2, 3 teknik çoğaltır) ölçülmesi ile belirlendi. Diğer iki kalibratörlerle algılama antikorların çapraz reaksiyon tek tespit antikorlar (Şekil 4) ile üç kalibratörlerin ayrı ayrı standart eğrileri kuluçka tarafından incelenmiştir. Çapraz-reaktivite diğer Kalibratörler ve tespit antikorlar arasında gözlendi çapraz reaksiyon sadece düşük miktarda CK-MB kalibratör ve cTnI ve cMyBP-C algılama antikorlar hem arasında görüldü.
Kardiyak hasar tespiti için tahlil uygulanabilirliği kanıtı olarak, MI 16 deneklerin serum seviyeleri, bir kontrol grubu (n = 16) ile karşılaştırıldı. 3-karmaşık plaka kullanarak, cMyBP-C, CK-MB ve cTnI düzeyleri belirlendi. Her üç biyolojik (bkz. MI konularda artmıştır12.2 kat (CK-MB) 3.7 kat (cMyBP-C) den Şekil 5), serum düzeylerinde varyasyon cMyBP-C grubunda en düşük olmasına rağmen.
| Süreç | UNIPLEX testi | 3-plex testi | |
| Deney gün 0 | Yakalama antikor ile kaplayın plaka | Bir gecede | Yok / A |
| Deney günü 1 | Plaka Blok | 1 saat | 30 dakika |
| Örnekleri ve standart serisi hazırlayın | |||
| Numuneler ve standartlar ile inkübe | 1 saat | 2 saat | |
| Algılama antikoru ile inkübe | 1 saat | 1 saat | |
| Algılama reaktif ekleme ve okumaplaka |
Tablo 1. UNIPLEX ve multipleks testlerin iş akışı genel bakış.
| LLOD (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (UNIPLEX) | 0.126 ± 0.007 | 0,567 ± 0,073 | 400 ng / ml ' |
| cMyBP-C (3plex) | 0.057 ± 0.022 | 0,469 ± 0,171 | 400 ng / ml ' |
| CK-MB (3 kompleks) | 0.038 ± 0.014 | 0,587 ± 0,213 | 100 ng / ml ' |
| cTnI (3plex) | 0.033 ± 0.011 | 0,147 ± 0,053 | 25 ng / ml ' |
Tablo 2'de. Algılama UNIPLEX sınırları ve 3-karmaşık kalibratörleri. LLOD, tespit alt sınırı, boş numunelerin boş + 3 kez standart sapma sinyalin hesaplanan konsantrasyon olarak tanımlanır. 120% - LLOQ, miktar tespitinin alt limiti, varyans katsayısı (gürültü oranı sinyal karşılıklı) daha düşük% 20 ve 80 arasında bir iyileşme ile, LLOD daha yüksek bir değer olarak tanımlanır. 120% - ULOQ, miktar tespitinin üst limiti, varyans katsayısı daha düşük% 20 ve 80 arasında bir iyileşme ile ölçülebilir yüksek analiz konsantrasyonu olarak tanımlanır.
Şekil 1. Plaka ve iş akışı şematik bakış. Sıra A) 96 plaka gösterilir. Her iyi üç farklı yakalama antikorlar, cMyBP-C karşı yani, CK-MB ve cTnI ile kaplanmıştır. Dördüncü boşunamümkün nokta kullanılmaz ve) BSA. B ile 3-katlı ELİSA İş Akışı kaplanmıştır. Önceden kaplanmış plaka (adım 1) bloke edildi ve daha sonra, serum örnekleri veya kalibratörler (adım 2), her bir kuyucuğa ilave edildi ve bağlanmaya izin verilir. kendi yakalama antikorlar cMyBP-C (kırmızı elmas), CK-MB (yeşil dikdörtgen) ve cTnI (turuncu oval) bağlama. Bağlanmamış proteinler uzak yıkama işleminden sonra, sülfo-TAG-etiketli antikorlar tespit (adım 3) ilave edilir. Onlar yakalama antikor bağlanmıştır cMyBP-C, CK-MB, veya cTnI'yi proteinlere bağlanırlar. İlişkisiz algılama antikoru uzak yıkama işleminden sonra, okuma tamponu ilave edilir ve plaka analiz edilir. Alt plaka bir elektrik sinyali ışık üretimi (adım 4) yol açan, okuma tamponu ile sülfo-TAG, yerel bir kimyasal reaksiyonu başlatır. Işık miktarı bağlı sülfo-TAG etiketli algılama antikoru miktarı ile doğrudan orantılıdır. CCD kamera yenidenkordonlar ışık ve iyi ve bu nedenle her birinde farklı noktalar her analit (adım 5) gelen sinyali ayırt edebilir.
Şekil 2. CMyBP-C kalibratör standart eğri aynı standart serisi UNIPLEX deneyde ölçüldü. UNIPLEX veya 3-karmaşık ölçülür, ve 3-karmaşık plaka üzerinde. Standart seri 2.000 ng / ml 'de başladı ve seri olarak 0.128 ng / ml' en düşük konsantrasyon olan 5x seyreltilmiştir. Buna ek olarak, bir seyreltici, bir boş numune olarak kullanılmıştır. Tahlilin algılama alanı gri olarak gösterilir. Alt sırası boş sinyal boş değerler ± 3 kez standart sapma hesaplanır konsantrasyonu olarak tanımlanır tespit alt sınırı (LLOD) gösterir. Tespiti için üst limit olarak T gibi tanımlanmıştıro güvenilir bir şekilde ölçülmesi standart serisi yüksek konsantrasyon. Her iki UNIPLEX ve 3-karmaşık cMyBP-C standart eğrileri karşılaştırılabilir. Algılama sınırları Tablo 2'de görüntülenir. au: keyfi birimleri.
Şekil 3. CK-MB ve cTnI standart eğrileri. 3-karmaşık plaka üzerinde cMyBP-C ile eş zamanlı olarak ölçüldü CK-MB ve cTnI Standart eğrileri,. Her iki kalibratörler yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık göstermektedir. Gri testinin algılama alanı görüntülenir. Alt sırası boş sinyal boş değerler ± 3 kez standart sapma hesaplanır konsantrasyonu olarak tanımlanır tespit alt sınırı (LLOD) gösterir. Tespiti için üst limit, standart se en yüksek konsantrasyon olarak tanımlanır Ries bu güvenilir biçimde ölçülebilmesi. Algılama sınırları Tablo 2'de görüntülenir. au: keyfi birimleri.
Şekil 4. 3-karmaşık algılama antikorların çapraz reaktivite. CMyBP-C, CK-MB, ve cTnI ayrı bir standart eğri hazırlanmış, ve 3-Plex plaka üzerinde inkübe edildi. Her bir standart eğri ayrı tespit antikorları (örneğin, cMyBP-C) ve diğer kalibratörlerin (örneğin, CK-MB ve cTnl) arasında çapraz-reaktivite miktarını değerlendirmek için, tek tek tespit antikorlarla problanmış daha fazla oldu. Çapraz reaktivite 3-karmaşık tayininde düşüktü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 5 "fo: içerik-width =" 3in "fo: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/ files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg>
Şekil 5,. MI serum ve kontrol grubunda biyolojik seviyeleri 3-karmaşık yöntemi ile ölçülen. CMyBP-C, CK-MB ve cTnI düzeyleri MI ile 16 kontrol grubu ve 16 deneklerin serum örneklerinde 3-karmaşık yöntemi ile eş zamanlı olarak ölçüldü. Veri kutusu ve bıyık araziler (bıyık 10. ve 90. yüzdelik temsil) ile gösterilir. Her üç biyolojik daha yüksek düzeyde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, MI olan hastaların serumunda gözlenmiştir. Veri bir normal dağılım (D'Agostino Pearson Omnibus tarafından test) göstermedi çünkü, parametrik olmayan Mann-Whitney istatistiksel test kontrol ve MI gruplar arasındaki farklar için test etmek için kullanılmıştır. # P <0.001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, hastalarda serum birden fazla kardiyak biyolojik tespiti için bir multipleks immunoassay uygulanabilirliğini göstermektedir. Bu teknik, geleneksel ELISA üzerinde birçok avantajı vardır. İlk olarak, test kiti ECL kolorimetrik tespit yerine kullanılır. ECL olarak, bir elektrik sinyali 14 azaltır, böylece arka plan sinyali, ikinci uyarım durumunda ayrılmasının, ölçülen özelliği (ışık) yerel üretimini uyarır. Bu durum, Tablo 2'de de görülebileceği gibi, yüksek hassasiyet sağlamaktadır.
Tahlil multiplekslemesi Şekil 2 ve Tablo 2 'de görülebileceği gibi, cMyBP-C tespiti için bir hassasiyet kaybına neden olmaz. UNIPLEX ölçülür cMyBP-C CK-MB ve cTnI 13 ile eş zamanlı olarak ölçülen cMyBP-C ile karşılaştırılabilir bir duyarlılık ve algılama aralığı gösterdi. Eşzamanlı ölçümleri önemli ölçüde ÖLÇME için gerekli örnek hacmini azaltmaknadir biyolojik örnekler, çalışma hem de süresini azaltmak zaman kritik bir faktör olabilir ts, birden UNIPLEX testleri çalışan geçirdi.
Herhangi bir bağışıklık olduğu gibi, tahlil, kullanılan antikorların kalitesi son derece bağlıdır. Yakalama ve algılama antikorların afinite, özgüllük ve avidite tahlil 15 duyarlılığı temel belirleyicisidir. Farklı antikor çiftleri en yüksek hassasiyet ve dinamik aralık verir yakalama ve algılama antikor hangi kombinasyonu görmek için denenmelidir. Çoğullama teknikleri kullanılırken, antikorlarla de nokta kaplı olması gerekir. Bu, düşük hacim, yüksek ölçüde konsantre çözelti UNIPLEX tahlilinde veya geleneksel ELISA'da kullanılan çözeltinin kaplama aksine iyi parçası (bkz. Şekil 1) üzerinde tespit olduğu anlamına gelir. Bu çözüm kaplamalı olduğu gibi yakalama antikor nokta kaplama olduğu gibi iyi bir performans sergiliyor eğer değerlendirilmelidir. Çapraz-reaktivitebaşka bir antikor çifti ile antikorlar veya kalibratör da yanlış pozitif sonuçlar 2,15 ortaya çıkmasına neden olabilir.
Bu çalışma için, özel yapılmış çok katlı plaka MSD ile işbirliği içinde tasarlanmıştır. Ön kaplı çok katlı levhalar bir dizi mevcut ise de bir roman (cMyBP-C) hedef daha önce optimize katalogu testleri (CK-MB ve cTnI) ile çoğaltılmış çünkü, bu özel yenilik testinin optimizasyonu gereklidir. Bu nedenle, bu yöntemin belirgin bir dezavantajı, özel bir plaka okuyucu ve ECL sinyali tespit etmek için elektrotlar içeren plakalar için eklenen bir gerekliliktir. Birden fazla UNIPLEX deneyleri karşı bir multipleks tahlil çalışan toplam maliyetleri azaltmak olsa da, bir plaka okuyucu ilk 2 satın alınmalıdır.
3-karmaşık immunoassay kullanarak cMyBP-C, CK-MB ve cTnI bir biyolojik serbest düzeyleri MI olan kişilerde ölçülür ve bir kontrol grubu ile karşılaştırıldı. Inci üzerinde artış kat değişiklike kontrol grubu (bkz. Şekil 4) üç biyolojik arasındaki farklılık, gibi MI grubunda değişim yaptı. Olasılıkla dolaşımda kalp protein ve sonraki bozulması serbest katkıda kan örneklemesi, infarkt, hem de diğer faktörlerin bir dizi zamanlaması gibi biyolojik seviyelerinde değişim, MI hastaların bir koleksiyon bekleniyor. Bireyin biyolojik düzeyi gibi infarkt gibi klinik parametreler, ile ilişkili olsun, garanti daha fazla çalışma.
MI algılamak için acil serviste kullanmak doğrudan bu bulgular Tercüme aşılması gereken zorluklar bir dizi gerektirir. Aralarında asal protokol bile önceden kaplı plakalar ile 3 ½ saat sürer sonuçlar, üretmek için gereken zamandır. Günümüzde kullanılan troponin deneyleri gibi, tahlil hızlı tanı sağlayan, hızlı algılama için optimize edilmelidir.
Sonuç olarak, iki bildiğiniz bir imza tahlil geliştirdikn kardiyak biyolojik ve bir potansiyel kardiyak biyolojik, cMyBP-C, aynı anda kalp protein serum titreleri kantitatif MI hastalarda miyokard hasarının varlığını tespit etmek için gösterildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İnsan vücut sıvısı içine cMyBP-C bozulması ve serbest bırakılması ile ilişkili risk faktörleri belirlemek için: Tam patent başvurusu (05/04/12. Başvuru Seri 13 No'lu / 464, 466, Birahane No US 2012 / 0.282.618 A1 ve tarihi) beklemede ve insan vücut sıvısında cMyBP-C düzeyini nicelendirmek.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri R01HL105826 ve K02HL114749 (Dr Sadayappan) ve Amerikan Kalp Derneği Midwest Arkadaş grupları tarafından finanse edildi; 11PRE7240022 (Bay Barefield) ve 13POST14720024 (Dr Govindan). Yazarlar minnetle tahlil gelişmekte olan kendi mükemmel teknik ve edebiyat destek için Dr Jimmy Page, Jill Clampit ve Dr John Hudson, MSD, yardımı kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
