Summary
Het meten van biomarkers in complexe biologische monsters wordt in toenemende mate leidend klinische besluitvorming. We beschrijven een zeer gevoelige methode voor het gelijktijdig meten cardiale myosine bindend eiwit C, creatine kinase MB, troponine I en in serummonsters van patiënten met myocardiaal infarct en gezonde controlepersonen.
Abstract
Biomarkers worden steeds belangrijker in de klinische besluitvorming, evenals fundamentele wetenschap. Diagnose van myocardiaal infarct (MI) wordt grotendeels bepaald door het detecteren van cardiaal-specifieke eiwitten in serum of plasma van patiënten als indicator van myocardiale schade. Onlangs hebben aangetoond dat cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C) detecteerbaar is in het serum na MI, hebben we voorgesteld als potentiële biomarker voor MI. Biomarkers worden typisch gedetecteerd door traditionele sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. Deze techniek vereist een groot monstervolume, een klein dynamisch bereik, en kan slechts een eiwit meten tegelijk.
Hier laten we een multiplex immunoassay waarbij drie cardiale eiwitten gelijktijdig worden gemeten met een hoge gevoeligheid. Meten cMyBP-C in Uniplex of samen met creatine kinase MB en troponine I toonde vergelijkbare gevoeligheid. Deze techniek maakt gebruik van de Meso Scale Discovery(MSD) methode van multiplexen in een 96-wells plaat in combinatie met electrochemiluminescence voor detectie. Terwijl slechts kleine steekproef volumes nodig zijn, worden hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik gerealiseerd. Met deze techniek, hebben we gemeten cMyBP-C, creatine kinase MB, en cardiale troponine I niveau in het serum monsters van 16 patiënten met MI en vergeleken de resultaten met 16 controlepersonen. We waren in staat om alle drie de markers te detecteren in deze monsters en vond alle drie biomarkers worden verhoogd na MI. Deze techniek is daarom geschikt voor de gevoelige detectie van cardiale biomarkers in serummonsters.
Introduction
Het meten van lage hoeveelheden eiwit in complexe biologische monsters, zoals serum, wordt steeds klinisch belang voor patiëntbehandeling, alsmede fundamentele wetenschap. Bijvoorbeeld, een de serumniveaus van cardiale biomarkers, zoals troponine I, in een klinische setting is met acuut myocardiaal infarct (MI) 1. Om eiwitten in serummonsters detecteren standaard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de meest gebruikte techniek omdat het hogere gevoeligheid en maakt absolute kwantificering van de analyt. Echter, traditionele ELISA een betrekkelijk grote hoeveelheid monster (meestal 100 pl), hoge achtergrondsignaal in sommige biologische vloeistoffen, en zijn beperkt tot het meten van slechts een analyt per ELISA 2.
Onlangs werd een nieuwe immunoassay techniek leidt dat veel van deze nadelen omzeilt. Deze gemodificeerde test, ontwikkeld door MSD, gebruikt electrochemiluminesclingen (ECL) voor signaaldetectie, die zorgt voor een zeer lage achtergrond en een verhoogde gevoeligheid, waardoor het gebruik van kleine monstervolumes. Electrochemiluminescence is gebaseerd op het reportermolecuul ruthenium (II) trisbipyridal, die is bevestigd aan de detectie-antilichamen. Het reportermolecuul zendt licht bij 620 nm van de elektrische stimulatie van de bodem van de 96-well plaat die koolstof elektroden geïntegreerd in deze 3 heeft. Ook, door spot coating, verschillende capture antilichamen kunnen worden aangebracht in een putje (tot 10 op een 96-well plaat), waardoor gelijktijdige kwantificering van verschillende eiwitten in een monster 4. Deze techniek Onlangs is een pro-inflammatoire cytokine profielen 5,6 serum meten. De multiplex platen van MSD gunstig in vergelijking met andere multiplex assay platformen 7.
Met behulp van MSD als de primaire-test platform, hebben we verder een op maat gemaakte 3-plex plaat ontwikkeld dat cEen gelijktijdig kwantificeren van het niveau van cardiale myosine bindend eiwit C (cMyBP-C), creatine-kinase MB (CK-MB) en cardiaal troponine I (cTnI) en de resultaten werden vergeleken met monoplex detectie van cMyBP-C. CK-MB en troponine zijn gevestigde biomarkers voor MI. Echter, toename van deze biomarkers worden veroorzaakt door andere dan MI pathologieën, zoals myocarditis of nierfalen 8. Dit pleit voor het toevoegen van extra biomarkers om de specificiteit van de MI diagnose te verhogen. We hebben onlangs aangetoond dat cMyBP-C is ook een potentiële biomarker voor MI 9. cMyBP-C is een dikke filament geassocieerd eiwit dat tot expressie gebracht in het hart, 10-12 maar niet in skeletspieren en gladde spieren. Dus het verhoogde niveau van cMyBP-C in de bloedsomloop is een specifieke indicator van hartschade 13.
In deze studie vergeleken we Uniplex detectie van cMyBP-C met behulp van een aangepaste 3-plex assay voor serumniveaus van metencMyBP-C, CK-MB en troponine in het serum van patiënten met MI. In de toekomst zou deze handtekening techniek worden gebruikt om MI te diagnosticeren bij patiënten met pijn op de borst in de spoedafdeling.
De instelling Review Board (IRB) van de Loyola University Chicago ingestemd met de studie voor het gebruik van deidentified menselijke populaties en het gebruik van de immunoassay (LU # 20392).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uniplex cMyBP-C Assay
- De dag voor het experiment, de vacht van de 96-well MSD kale standaard plaat met invangantilichaam. Voor cMyBP-C is een 30 gl volume van muizen monoklonaal anti-cMyBP-C-antilichaam (gelatinevrije) bij een concentratie van 5 ug / ml verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Omdat het goed is hydrofoob, pipet de oplossing in de rechter benedenhoek van de put; tik op de zijkanten van de plaat aan de oplossing over de gehele goed verspreid.
- De plaat is bedekt met een plaat sealer en gedurende O / N bij 4 ° C zonder schudden.
- Verwijder de invangantilichaam oplossing door te tikken op de oplossing uit over een wastafel en vervolgens op een stapel papieren handdoeken. Niet-specifieke binding aan de plaat wordt door toevoegen van 150 pi van een 5% (w / v) blocker A (hoogwaardig BSA) oplossing in PBS aan elk putje.
- Sluit de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 rpm.
- Tijdens de blokkering stap, de voorbereiding van de normen en samples. Voeg de standaardreeks door verdunning recombinant cMyBP-C proteïne fragment (aminozuren 1-271) een beginconcentratie van 2,000 ng / ml in 1% (w / v) blocker A / PBS. Vervolgens serieel verdund met een factor 5 in 1% (w / v) blocker A / PBS. Totaal 7 normen + 1 blank (1% (w / v) blocker A / PBS alleen) gebruikt.
- Verwijder de blokkering oplossing en was de plaat 3x met 150 pi 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Elke keer, verwijder de wasoplossing door het omkeren van de plaat boven een gootsteen. Na de derde wasstap, krachtig flick de plaat over een wastafel en dep de plaat krachtig op een laag van papieren handdoeken totdat het volledig droog is. Dit is een cruciale stap, zoals volumes incubatie klein, en de overgebleven wasoplossing de volgende incubatie sterk verdunnen.
- Pipetteer 25 ul van standaarden en monsters in de putjes. Sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur onder schudden bij 700 rpm gedurende 1 uur.
- Bereid de detectieantilichaam oplossing bij 1 ug / ml in 1% blocker A / PBS. A custom gemaakt cMyBP-C-antilichaam (epitoop aminozuren 2-14) met MSD SULFO-TAG etikettering dient als de detectie antilichaam. Kits zijn beschikbaar voor SULFO-TAG etikettering, waardoor het een relatief eenvoudige procedure om het etiket elk antilichaam.
- Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 1.4.
- Voeg 25 ul van detectieantilichaam oplossing in elk putje, sluit de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een plaat schudder ingesteld op 700 rpm.
- Tijdens de incubatieperiode, draaien MSD's demo-plaat (plaat met LED-verlichting) voor een goede werking van de sector Imager en software (zie paragraaf reagens) zorgen. Ook verdunnen read-buffer, die wordt verzorgd door MSD, door toevoeging van 5 ml van 4x lees-buffer en 15 ml gedestilleerd water.
- Herhaal de wasstap zoals beschreven in stap 1.4.
- Voeg 150 ul van lees-buffer aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Zorg ervoor dat u luchtbellen (reverse pipetteren is een geschikte methode) te vermijden. Na toevoeging van de lees-buffer onmiddellijk de plaat in de sector scannenImager.
2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB en troponine Assay
- Een 96-well plaat 3-plex en verdunningsmiddel oplossingen equilibreren tot kamertemperatuur vóór gebruik. Deze plaat is pre-coated met capture antilichamen voor cMyBP-C, CK-MB en troponine door MSD.
- Voeg 25 ul van 1% (w / v) blocker A / PBS aan elk putje. Tik op de zijkanten van de plaat om ervoor te zorgen dat het gehele goed wordt gedekt door oplossing.
- Seal de plaat met een plaatafdichter, plaatst u de plaat op een bord shaker en schud bij 700 rpm gedurende 30 minuten.
- Intussen wordt een verdunningsreeks van afzonderlijke bereide kalibrators. Want elk heeft ook drie invangantilichamen drie ijkpunten moeten worden gemengd en serieel verdund vóór gebruik. Verdun recombinant cMyBP-C, CK-MB (MSD) en troponine (MSD) samen in 1% (w / v) blocker A / PBS om een monster te maken met 2000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, en 25 ng / ml cTnI (monster A).
- Een eindvolume van ten minste 100 pi bereid voor elke standaard. Naarvullen de standaard serie, serieel verdunnen de monsters met een factor 5. Gebruik 25 gl monster A in 100 gl 1% (w / v) blocker A / PBS monster B. maken dan gebruik van 25 gl monster B in 100 pl 1% (w / v) blocker A / PBS om monster C creëren , enzovoort. Menselijk serum monsters van 16 patiënten met MI en 16 controlepersonen werden gebruikt om cMyBP-C, CK-MB en troponine niveaus te meten. Deze monsters werden 2x verdund in 1% (w / v) blocker A / PBS.
- Voeg 25 ul van de verdunde monsters en standaarden om de 25 ul reeds in de putjes van de 3-plex plaat. Het is belangrijk ook een blanco (alleen verdunningsmiddel) bevatten. Om de techniek vast te stellen, worden monsters geladen in technische drievoud. Anders duplicaten voldoende.
- Weer sluiten, de plaat (plaatafdichter kunnen worden hergebruikt) en incubeer op een bord shaker (700 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Vlak voor de incubatie is voltooid, wordt het detectie-antilichaam oplossing bereid. Het verdunningsmiddel is 1% (w / v) blocker A in PBS. Alle three SULFO-gemerkte detectie-antilichamen worden samen verdund tot een eindconcentratie van 1 ug / ml elk. Detectie antilichamen worden meestal verzorgd op een 50x voorraad concentratie.
- Voor een volledige 96-well plaat, is 2.700 gl totale verdunde oplossing nodig (met pipetteren fout inbegrepen). Voeg 54 ul van elke detectieantilichaam 2,538 gl 1% (w / v) blocker A / PBS.
- Na 2 uur, verwijder oplossingen door krachtig te vegen het bord boven een gootsteen. Was de putjes 3x met 150 ul 0.05% Tween-20 in PBS. Voeg 25 ul van detectieantilichaam oplossing in elk putje met een multichannel pipet en de zijkanten van de plaat worden onttrokken om aan dat de gehele put onder oplossing.
- Seal de plaat en incubeer gedurende 1 uur onder schudden bij 700 rpm.
- Tijdens de incubatieperiode, draaien MSD's demo-plaat (plaat met LED-verlichting) voor een goede werking van de sector Imager en software garanderen. Ook verdunnen de lees-buffer, die wordt verzorgd door MSD, door toevoeging van 5 ml van 4x lezenbuffer op 15 ml gedestilleerd water.
- Herhaal de wasstap in stap 2.8 beschreven.
- Voeg 150 ul van lees-buffer aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Het vermijden van luchtbellen is kritisch (omgekeerd pipetteren een geschikte werkwijze). Na toevoeging van de lees-buffer, meteen de plaat in de sector Imager scannen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De basisprincipes en workflow van de 3-plex assay worden getoond in figuur 1, en de algehele werkstroom wordt beschreven in Tabel 1. Uniplex assays werken volgens hetzelfde principe, behalve dat de gehele onderkant goed bekleed met een capture-antilichaam. Signaaldetectie uitgevoerd door ECL waarbij een elektrisch signaal wordt toegevoerd aan de bodem van de put. Dit op zijn beurt, initieert een lokale productie van licht door een chemische reactie van de lees-buffer met SULFO TAG-label op het detectieantilichaam. Dit leidt tot de lage achtergrond en een hoge gevoeligheid van de assay. In figuur 2 is de standaardcurve van cMyBP-C in de Uniplex assay vergeleken met die van cMyBP-C in de 3-plex assay. Beide testen tonen een zeer hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. Detectieniveaus en kwantificering niveaus worden weergegeven in tabel 2 en zijn vergelijkbaar in beide Uniplex en 3-plex assays. Detectie niveaus voor cTnI-en CK-MB zijn ALSo Figuur 3 en Tabel 2. Inter-operator variabiliteit werd bepaald door identieke monsters (n = 2, 3 technische replicaten) twee verschillende operators en variabiliteit bleek laag (CV 8,5%). Kruisreactiviteit van detectie antilichamen met de andere twee kalibrators werd onderzocht door incubatie afzonderlijke standaard curves van drie kalibratie met enkelvoudige detectie antilichamen (Figuur 4). Alleen lage hoeveelheid cross-reactiviteit werd gezien tussen de CK-MB kalibrator en zowel cTnI en cMyBP-C detectie antilichamen terwijl er geen kruisreactiviteit werd waargenomen tussen de andere kalibratie-en detectie-antilichamen.
Als bewijs van de toepassing van de assay voor de detectie van cardiale schade werden serumniveaus van 16 patiënten met MI vergeleken met een controlegroep (n = 16). Met behulp van de 3-plex plaat, werden serum niveaus van cMyBP-C, CK-MB en troponine bepaald. Alle drie biomarkers werden verhoogd in de MI onderwerpen (zieFiguur 5) van 3,7-voud (cMyBP-C) tot 12,2 maal (CK-MB), hoewel variatie in serum levels de laagste in de cMyBP-C-groep.
| Procede | Uniplex assay | 3-plex assay | |
| Experiment dag 0 | Jas plaat met vangantilichaam | Gedurende de nacht | N / A |
| Experiment dag 1 | Blokkeer de plaat | 1 hr | 30 min |
| Bereid monsters en standaard series | |||
| Incubeer met monsters en standaarden | 1 hr | 2 hr | |
| Incubeer met detectie antilichaam | 1 hr | 1 hr | |
| Voeg detectiereagens en lezenplaat |
Tabel 1. Workflow overzicht van Uniplex en multiplex assays.
| LLOD (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0.126 ± 0.007 | 0.567 ± 0.073 | 400 ng / ml |
| cMyBP-C (3plex) | 0.057 ± 0.022 | 0.469 ± 0.171 | 400 ng / ml |
| CK-MB (3-plex) | 0.038 ± 0.014 | 0.587 ± 0.213 | 100 ng / ml |
| cTnI (3plex) | 0.033 ± 0.011 | 0.147 ± 0.053 | 25 ng / ml |
Tabel 2. Detectielimieten van Uniplex en 3-plex calibrators. LLOD lagere detectiegrens wordt gedefinieerd als de concentratie berekend van het signaal van de blanco + 3 maal de standaarddeviatie van de blanco monsters. LLOQ, de ondergrens van kwantificering, wordt gedefinieerd als een waarde hoger dan LLOD, met een coëfficiënt van variantie (omgekeerde van signaal-ruisverhouding) lager dan 20%, en een herstel tussen 80-120%. ULOQ, bovengrens van kwantificering, wordt gedefinieerd als de hoogste gemeten concentratie die kan worden gemeten met een variatiecoëfficiënt lager dan 20% en een herstel tussen 80-120%.
Figuur 1. Schematisch overzicht van de plaat en workflow. A) 96 wells plaat wordt getoond. Elk putje is bekleed met drie verschillende capture antilichamen, dwz tegen cMyBP-C, CK-MB en troponine. De vierde batenstaat spot wordt niet gebruikt en is bekleed met BSA. B) Workflow van de 3-plex ELISA. De pre-beklede plaat (stap 1) wordt geblokkeerd en serummonsters of kalibratie worden toegevoegd aan elk putje en liet men binden (stap 2). cMyBP-C (rood ruiten), CK-MB (groene rechthoek) en troponine (oranje ovaal) binden aan hun respectieve capture antilichamen. Na de ongebonden eiwitten weg te wassen, worden de SULFO-TAG-gemerkte detectie-antilichamen toegevoegd (stap 3). Zij binden aan de cMyBP-C, CK-MB, troponine of eiwitten die zijn gebonden aan hun vangend antilichaam. Na het wegwassen van ongebonden detectieantilichaam, wordt gelezen buffer toegevoegd en de plaat wordt geanalyseerd. Een elektrisch signaal naar de onderkant van de plaat initieert een lokale chemische reactie van de SULFO-TAG met de lees buffer, leidt tot de productie van licht (stap 4). De hoeveelheid licht is rechtstreeks evenredig met de hoeveelheid SULFO-TAG gemerkt detectieantilichaam gebonden. De CCD-imager resnoeren het licht en kan de verschillende plekken binnen elk putje en dus het signaal van elke analyt (stap 5) onderscheiden.
Figuur 2. Standaardcurve van cMyBP-C calibrator gemeten in Uniplex of in 3-plex. Dezelfde standaard serie werd gemeten in een Uniplex assay, en op de 3-plex plaat. De standaard reeks begon bij 2000 ng / ml en werd serieel verdund 5x met de laagste concentratie die 0,128 ng / ml. Bovendien werd verdunningsmiddel gebruikt als een blanco monster. Het detectiebereik van de test wordt in het grijs weergegeven. De onderste regel geeft de detectielimiet (LLOD), gedefinieerd als de berekende concentratie van de blanco signaal + 3 maal de standaardafwijking van de blanco waarden. De bovenste detectiegrens wordt gedefinieerd als tHij hoogste concentratie van de standaard serie die betrouwbaar kan worden bepaald. Zowel Uniplex en 3-plex cMyBP-C standaard curves zijn vergelijkbaar. Detectielimieten worden weergegeven in Tabel 2. au: willekeurige eenheden.
Figuur 3. Standaard curves van CK-MB en troponine. Standaardcurven van CK-MB en troponine, die tegelijkertijd werden gemeten met cMyBP-C op de 3-plex plaat. Beide calibratoren tonen een hoge gevoeligheid en een groot dynamisch bereik. In grijze het detectiebereik van de test wordt weergegeven. De onderste regel geeft de detectielimiet (LLOD), gedefinieerd als de berekende concentratie van de blanco signaal + 3 maal de standaardafwijking van de blanco waarden. De bovenste detectiegrens wordt gedefinieerd als de hoogste concentratie van de standaard se ries die betrouwbaar kan worden vastgesteld. Detectielimieten worden weergegeven in Tabel 2. au: willekeurige eenheden.
Figuur 4. Cross-reactiviteit van 3-plex detectie antilichamen. Aparte standaard curves van cMyBP-C, CK-MB en troponine werden bereid en geïncubeerd op de 3-plex plaat. Elke standaard curve werd dan onderzocht met individuele detectie antilichamen, om het bedrag van de cross-reactiviteit te beoordelen tussen individuele detectie antilichamen (bv. cMyBP-C) en de andere calibrators (bijv. CK-MB en cTnI). Kruisreactiviteit was laag in het 3-plex assay. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5 "fo: content-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Figuur 5. Biomarker niveaus in serum van MI en controle proefpersonen gemeten met een 3-plex assay. Niveaus van cMyBP-C, CK-MB en troponine werden gelijktijdig gemeten met 3-plex assay in serummonsters van 16 controlepersonen en 16 proefpersonen met MI. Gegevens worden weergegeven door doos en whiskerdiagrammen (snorharen vertegenwoordigen 10 e en 90 e percentiel). Verhoogde niveaus van alle drie biomarkers werden waargenomen in het serum van patiënten met MI vergelijking met de controlegroep. Omdat de gegevens een normale verdeling (getest door D'Agostino Pearson Omnibus) niet vertoonden, werd de niet-parametrische Mann-Whitney statistische toets gebruikt om te testen voor verschillen tussen controle en MI groepen. # P <0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie tonen we de toepassing van een multiplex immunoassay voor de detectie van meerdere cardiale biomarkers in serum van patiënten. Deze techniek heeft vele voordelen ten opzichte van traditionele ELISA. Eerst ECL in de testkit wordt gebruikt in plaats van colorimetrische detectie. In ECL, een elektrisch signaal stimuleert de lokale productie van de gemeten eigenschap (licht), waardoor het ontkoppelen van de stimulatie gebeurtenis het signaal, waarbij die 14 vermindert. Dit maakt hoge gevoeligheid, zoals blijkt uit tabel 2.
Multiplexen van de assay niet tot een verlies van gevoeligheid voor de detectie van cMyBP-C, zoals te zien in figuur 2 en tabel 2. cMyBP-C gemeten in Uniplex toonde een sensitiviteit en detectiebereik vergelijkbaar cMyBP-C gelijktijdig gemeten met de CK-MB en troponine 13. Gelijktijdige metingen van de hoeveelheid monster nodig voor METING aanzienlijke verminderingts, waarin een kritische factor zijn bij het werken met zeldzame biologische monsters, alsook minder tijd uitvoeren van meerdere Uniplex assays.
Zoals bij elke immunoassay, de test is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de gebruikte antilichamen. De affiniteit, specificiteit en aviditeit van de capture-en detectie-antilichamen is de hoofdfactor van de gevoeligheid van de assay 15. Verschillende antilichaam paren moet worden geprobeerd om te zien welke combinatie van capture en detectie-antilichamen de hoogste gevoeligheid en dynamisch bereik geeft. Bij gebruik multiplextechnieken, de invangantilichamen moeten spot laag aan de put. Dit betekent dat een laag volume, sterk geconcentreerde oplossing gespot op een deel van de put (zie figuur 1) in tegenstelling tot oplossing te bekleden in de Uniplex assay of conventionele ELISA. Er dient te worden beoordeeld of de invangantilichaam zo goed presteert met spot coating als met oplossing coating. Cross-reactiviteit vanantilichamen of kalibratie met een ander antilichaam paar kan ook aanleiding geven tot vals-positieve resultaten 2,15.
Voor deze studie werd een op maat gemaakte multiplex plaat is ontworpen in samenwerking met MSD. Hoewel een aantal pre-coated multiplex platen zijn in de handel verkrijgbaar, deze bijzondere innovatie vereist optimalisering van de assay omdat een nieuwe (cMyBP-C) doelstelling werd gemultiplext met eerder geoptimaliseerde catalogus assays (CK-MB en cTnI). Als zodanig duidelijk nadeel van deze werkwijze is het extra vereiste van een speciale plaatlezer en platen die elektroden met de ECL-signaal te detecteren. Hoewel waarop een multiplex assay versus meerdere Uniplex assays zullen de totale kosten te verlagen, moet een bord lezer aanvankelijk worden gekocht 2.
Met de 3-plex immunoassay de niveaus van biomarker afgifte van cMyBP-C, CK-MB, troponine en werd gemeten bij patiënten met MI en vergeleken met een controlegroep. De voudige verandering van de stijging ten opzichte van the controlegroep verschilde tussen de drie biomarkers (zie figuur 4), evenals de variatie in de MI-groep. Variatie op biomarkers verwacht in een verzameling MI patiënten en tijdstip van bloedafname, infarctgrootte, evenals een groot aantal andere factoren die bijdragen aan de afgifte van cardiale eiwitten en de latere afbraak in de circulatie. Of het niveau van de individuele biomarkers correleren met klinische parameters, zoals infarctgrootte vereist verdere studie.
Het vertalen van deze bevindingen direct te gebruiken in de spoedafdeling te detecteren MI vereist een aantal uitdagingen te overwinnen. Prime onder hen is de tijd die het protocol is om de resultaten, die zelfs met pre-gecoate platen duurt 3 ½ uur te produceren. Zoals bij de troponine assays die tegenwoordig moet de test worden geoptimaliseerd voor snelle detectie, die een snelle diagnose.
Concluderend hebben we een handtekening assay waarin twee weten ontwikkeldn cardiale parameters en een mogelijke cardiale biomarker, cMyBP-C, werd aangetoond dat de aanwezigheid van myocardiale verwonding bij patiënten met MI door kwantificatie van cardiale eiwitten serum titers kan diagnosticeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Een volledige octrooiaanvraag is in behandeling (met serienummer 13/464, 466, Pub No US 2012/0282618 A1 en Datum:. 05/04/12) aan de risicofactoren die samenhangen met cMyBP-C degradatie en het vrijkomen in het menselijk lichaam vocht vast en kwantificeren van het niveau van cMyBP-C in menselijke lichaamsvloeistof.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de National Institutes of Health beurzen R01HL105826 en K02HL114749 (Dr Sadayappan), en de American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr Barefield) en 13POST14720024 (Dr Govindan). De auteurs zeer erkentelijk voor de hulp van Dr Jimmy Page, Jill Clampit en Dr John Hudson, MSD, voor hun uitstekende technische en literatuur ondersteuning bij de ontwikkeling van de test.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
