Summary
Biomarqueurs de mesure dans des échantillons biologiques complexes est de plus en plus guident prise de décision clinique. Nous décrivons une méthode très sensible pour mesurer simultanément la myosine cardiaque protéine de liaison-C, la créatine kinase MB et la troponine I cardiaque dans le sérum de sujets atteints d'infarctus du myocarde et de sujets témoins en bonne santé.
Abstract
Les biomarqueurs sont de plus en plus en plus important dans la prise de décision clinique, ainsi que la science fondamentale. Diagnostic de l'infarctus du myocarde (IM) est en grande partie entraînée par la détection de protéines spécifiquement cardiaque dans le sérum ou le plasma de patients comme indicateur de la lésion du myocarde. Ayant récemment montré que la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C) est détectable dans le sérum après un IM, nous avons proposé comme un biomarqueur potentiel de MI. Les biomarqueurs sont généralement détectés par alternance enzyme-linked tests immuno traditionnels. Toutefois, cette technique nécessite un grand volume de l'échantillon, a une faible plage dynamique, et permet de mesurer une seule protéine à la fois.
Ici, nous montrons un test immunologique multiplex dans lequel trois protéines cardiaques peuvent être mesurés simultanément avec une grande sensibilité. Mesure cMyBP-C dans Uniplex ou avec de créatine kinase MB et la troponine I cardiaque ont montré une sensibilité comparable. Cette technique utilise la méso échelle Discovery(MSD) méthode de multiplexage dans une plaque de 96 puits combiné avec électrochimiluminescence pour la détection. Bien que de petites quantités d'échantillons sont nécessaires, une grande sensibilité et une grande plage dynamique sont atteints. Grâce à cette technique, nous avons mesuré cMyBP-C, la créatine kinase MB et la troponine cardiaque niveaux I dans des échantillons de sérum de 16 sujets atteints d'IM et comparé les résultats avec 16 sujets témoins. Nous avons pu détecter tous les trois marqueurs dans ces échantillons et découvert les trois biomarqueurs être augmentée après MI. Cette technique est donc adapté à la détection sensible des biomarqueurs cardiaques dans des échantillons de sérum.
Introduction
La mesure de faibles quantités de protéines dans des échantillons biologiques complexes comme le sérum, est d'une importance croissante pour la gestion clinique des patients, ainsi que la science fondamentale. Par exemple, une augmentation des taux sériques de biomarqueurs cardiaques, tels que la troponine I, dans un contexte clinique est compatible avec infarctus aigu du myocarde (MI) 1. Pour détecter les protéines dans des échantillons de sérum, le dosage immuno-enzymatique standard (ELISA) est la technique la plus souvent utilisée car elle a une sensibilité élevée et permet une quantification absolue de l'analyte. Toutefois, les tests ELISA traditionnelles exigent une quantité relativement importante de l'échantillon (typiquement 100 pi), avoir un signal de fond élevé dans certains liquides biologiques, et sont limités à la mesure d'un seul analyte par ELISA 2.
Récemment, une nouvelle technique de dosage immunologique a été introduit qui contourne la plupart de ces inconvénients. Ce test modifié, développé par MSD, utilise electrochemiluminescrence (ECL) pour la détection des signaux, ce qui permet pour un fond très faible et d'une sensibilité accrue, ce qui permet l'utilisation de petits volumes d'échantillons. Électrochimioluminescence est basé sur la molécule rapporteur du ruthénium (II) trisbipyridal, qui est fixé à l'anticorps de détection. Cette molécule rapporteur émet de la lumière à 620 nm lors de la stimulation électrique du bas de la plaque à 96 puits, qui comporte des électrodes de carbone intégrées dans les trois. En outre, en utilisant un revêtement par points, plusieurs anticorps de capture peuvent être enrobés dans un puits (jusqu'à 10 sur une plaque 96 puits), ce qui permet, pour la quantification simultanée de plusieurs protéines dans un échantillon unique 4. Cette technique a été utilisée récemment pour mesurer les profils de cytokines pro-inflammatoires dans le sérum 5,6. Les plaques de multiplex de MSD se comparent favorablement à d'autres plates-formes de dosage multiplex 7.
Utilisation de MSD en tant que plateforme d'analyse primaire, nous avons encore développé une coutume fait plaque 3-plex qui cune quantifier simultanément le niveau de la myosine cardiaque protéine de liaison-C (cMyBP-C), la créatine kinase MB (CK-MB) et la troponine I cardiaque (cTnI), et les résultats ont été comparés avec détection monoplex de cMyBP-C. CK-MB et troponine Ic sont des biomarqueurs bien établies pour MI. Cependant, les augmentations de ces biomarqueurs peuvent être causés par des pathologies autres que MI, par exemple, une myocardite ou une insuffisance rénale 8. Ceci plaide pour l'ajout de biomarqueurs supplémentaires pour augmenter la spécificité du diagnostic MI. Nous avons récemment montré que cMyBP-C est également un biomarqueur potentiel de MI 9. cMyBP-C est une protéine associée à filament épais qui est exprimé dans le cœur, 10-12, mais pas dans les muscles squelettiques ou lisse. Ainsi, l'augmentation du niveau de cMyBP-C dans le système circulatoire est un indicateur spécifique de lésions cardiaques 13.
Dans cette étude, nous avons comparé la détection Uniplex de cMyBP-C avec l'utilisation d'un test 3-plex coutume de mesurer les taux sériques decMyBP-C, CK-MB et troponine Ic dans le sérum des patients atteints d'infarctus du myocarde. Dans l'avenir, cette technique de signature peut être utilisée pour diagnostiquer IM chez les patients présentant des douleurs à la poitrine dans la salle d'urgence.
La commission d'examen institution (IRB) de l'Université Loyola de Chicago a approuvé l'étude pour l'utilisation des échantillons humains rendues anonymes et l'utilisation de l'immuno-essai (LU # 20392).
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Protocol
1. Uniplex cMyBP-C Assay
- La veille de l'expérience, manteau de la plaque standard nu 96 puits MSD avec l'anticorps de capture. Pour cMyBP-C, utiliser un volume 30 ul d'anticorps anti-cMyBP-C monoclonal de souris (sans gélatine) à une concentration de 5 ug / ml dilué dans un tampon phosphate salin (PBS).
- Comme le puits est hydrophobe, une pipette de la solution dans le coin inférieur du puits; puis sur les côtés de la plaque pour propager la solution sur l'ensemble de puits.
- La plaque est recouverte d'un agent de scellement de la plaque et on incube O / N à 4 ° C sans agitation.
- Retirer la solution d'anticorps de capture en appuyant sur la solution au-dessus d'un évier, puis sur une pile de serviettes en papier. La liaison non-spécifique de la plaque est bloquée par addition de 150 pi de 5% (p / v) bloquant une solution (BSA haute qualité) dans du PBS dans chaque puits.
- Sceller la plaque et incuber pendant 1 heure à température ambiante tout en agitant à 700 rpm.
- Au cours de l'étape de blocage, préparer les normes et sexemples. Faire la série standard en diluant fragment de protéine recombinante cMyBP-C (acides aminés 1 à 271) à une concentration initiale de 2,000 ng / ml dans 1% (p / v) Un bloqueur / PBS. Puis diluer en série par un facteur de 5 à 1% (p / v) Un bloqueur / PBS. Nombre de normes 7 + une ébauche (1% (p / v) Un bloqueur / PBS seul) ont été utilisées.
- Retirer la solution de blocage et laver la plaque 3x avec 150 pi 0,05% Tween-20/PBS (v / v). Chaque fois, retirez la solution de lavage par inversion de la plaque au-dessus d'un évier. Après la troisième étape de lavage, faites glisser vigoureusement la plaque dessus d'un évier et tapotez la plaque vigoureusement sur une couche de serviettes en papier jusqu'à ce qu'il soit complètement sec. Il s'agit d'une étape cruciale, les volumes d'incubation sont de petite taille, et toute solution de lavage résiduelle va diluer considérablement la prochaine incubation.
- Pipette 25 ul d'étalons et des échantillons dans les puits. Sceller la plaque et incuber à température ambiante, tout en agitant à 700 rpm pendant 1 heure.
- Préparer la solution d'anticorps de détection à 1 pg / ml dans 1% bloqueur A / PBS. A custom fait anticorps cMyBP-C (épitopes des acides aminés 2-14) avec TMS sulfo TAG étiquetage sert de l'anticorps de détection. Les kits sont disponibles pour SULFO-TAG étiquetage, ce qui en fait une procédure relativement simple pour étiqueter tout anticorps.
- Répéter l'étape de lavage comme décrit dans l'étape 1.4.
- Ajouter 25 ul de solution d'anticorps de détection à chaque puits, sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 1 heure sur un agitateur de plaque fixée à 700 rpm.
- Au cours de la période d'incubation, exécutez MSD démo-plaque (plaque avec des lumières LED) pour assurer le bon fonctionnement de l'imageur du secteur et le logiciel (voir section réactif). En outre, diluer la lecture du tampon, qui est fourni par TMS, par addition de 5 ml de tampon de lecture 4x à 15 ml d'eau distillée.
- Répéter l'étape de lavage comme décrit dans l'étape 1.4.
- Ajouter 150 pi de tampon en lecture dans chaque puits à l'aide d'une pipette multicanaux. Soyez sûr d'éviter les bulles d'air (pipetage inverse est une méthode appropriée). Après addition de la lecture tampon, numériser immédiatement la plaque dans le secteurImager.
2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB et troponine Ic Assay
- Une des solutions plaque de 96 puits 3-plex et le diluant sont s'équilibrer à la température ambiante avant de l'utiliser. Cette plaque est pré-revêtu avec des anticorps de capture pour cMyBP-C, la CK-MB, et la cTnI par MSD.
- Ajouter 25 pi de 1% (p / v) bloqueur A / PBS dans chaque puits. Appuyez sur les côtés de la plaque de s'assurer que l'ensemble du bien est couvert par la solution.
- Sceller la plaque avec un scellant pour plaques, placer la plaque sur une plaque shaker, secouez et à 700 rpm pendant 30 min.
- Dans le même temps, une série de dilutions d'étalons individuels est préparé. Parce que chacun a bien trois anticorps de capture trois étalons besoin d'être mélangé et dilué en série avant l'utilisation. Diluer cMyBP-C recombinante, CK-MB (MSD), et cTnI (MSD), ainsi que dans 1% (p / v) bloqueur A / PBS pour créer un échantillon avec 2.000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- Mo, et 25 ng / ml cTnI (échantillon A).
- Un volume final d'au moins 100 l est préparée pour chaque standard. Pourterminer la série standard, diluer en série les échantillons sont par un facteur de 5. Utilisez 25 pl de l'échantillon A dans 100 pi de 1% (p / v) bloqueur A / PBS pour créer l'échantillon B. Ensuite, utilisez 25 pl de l'échantillon B dans 100 pi de 1% (p / v) bloqueur A / PBS pour créer l'échantillon C et ainsi de suite. Échantillons de sérum humain provenant de 16 sujets atteints d'IM et 16 sujets témoins ont été utilisés pour mesurer cMyBP-C, CK-MB, et les niveaux de troponine Ic. Ces échantillons ont été dilués 2x à 1% (p / v) bloqueur A / PBS.
- Ajouter 25 pl des étalons et des échantillons dilués dans les 25 ul déjà présents dans les puits de la plaque 3-plex. Il est important d'inclure également un blanc (diluant seulement). Pour établir la technique, les échantillons sont chargés en triple techniques. Sinon, les doublons sont suffisantes.
- Sceller la plaque à nouveau (plaque scellant peut être réutilisé) et incuber sur un agitateur plaque (700 rpm) à température ambiante pendant 2 heures.
- Juste avant l'incubation est terminée, la solution d'anticorps de détection est préparé. Le diluant utilisé est de 1% (p / v) dans du PBS Un bloqueur. Tous THRdes anticorps de détection ee sulfo marqués sont dilués ensemble dans une concentration finale de 1 ng / ml. anticorps de détection sont généralement fournis à une concentration des stocks 50x.
- Pour une plaque de 96 puits complète, 2.700 pi de solution diluée totale est nécessaire (avec erreurs de pipetage inclus). Ajouter 54 ul de chaque anticorps de détection à 2,538 pi 1% (p / v) bloqueur A / PBS.
- Après 2 heures, retirez solutions en tapotant énergiquement la plaque au-dessus d'un évier. Laver les puits 3 fois avec 150 pi de 0,05% de Tween 20 dans du PBS. Ajouter 25 pl de solution d'anticorps de détection à chaque puits à l'aide d'une pipette à canaux multiples, et les côtés de la plaque sont exploitées afin d'assurer que l'ensemble du puits est recouvert d'une solution.
- Sceller la plaque et incuber pendant 1 heure en agitant à 700 rpm.
- Au cours de la période d'incubation, exécutez MSD démo-plaque (plaque avec des lumières LED) pour assurer le bon fonctionnement de l'imageur du secteur et des logiciels. Diluer également la lecture tampon, qui est fourni par MSD, en ajoutant 5 ml de 4x lecturetampon à 15 ml d'eau distillée.
- Répéter l'étape de lavage décrite à l'étape 2.8.
- Ajouter 150 pi de tampon de lecture à chaque puits en utilisant une pipette multicanaux. Éviter les bulles d'air est critique (pipetage inverse est une méthode appropriée). Après addition de la lecture tampon, numériser immédiatement la plaque dans l'imageur du secteur.
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Representative Results
Les principes de base et le workflow de l'essai 3-plex sont présentés dans la figure 1, et le flux de travail global est décrite dans le tableau 1. Dosages Uniplex travaillent sur le même principe sauf que l'ensemble de fond de puits est recouvert d'un anticorps de capture. la détection du signal est effectuée par ECL dans lequel un signal électrique est appliqué à la partie inférieure du puits. Ceci, en retour, initie une production locale de la lumière à travers une réaction chimique de la lecture du tampon avec l'appellation de sulfo-TAG sur l'anticorps de détection. Cela conduit à l'arrière-plan basse et haute sensibilité du test. Dans la figure 2, la courbe standard de cMyBP-C dans le test Uniplex est comparée à celle de cMyBP-C dans le test 3-plex. Les deux tests montrent une très grande sensibilité et une gamme dynamique élevée. Les limites de détection et de niveaux de quantification sont présentés dans le tableau 2 et sont comparables dans les deux Uniplex et analyses 3 complexes. Les limites de détection pour cTnI et CK-MB sont also le montre la figure 3 et tableau 2. La variabilité inter-opérateur a été déterminée par la mesure d'échantillons identiques (n = 2, 3 technique reproduit) par deux opérateurs différents et variabilité a été jugée faible (CV 8,5%). Réactivité croisée des anticorps de détection avec les deux autres étalons a été étudié en incubant des courbes standards individuels de chacun des trois étalons avec des anticorps de détection simples (Figure 4). Seulement faible quantité de réactivité croisée n'a été observée entre les CK-MB calibrateur et les deux cTnI et des anticorps de détection cMyBP-C alors pas de réactivité croisée n'a été observée entre les autres étalons et des anticorps de détection.
Comme preuve de l'applicabilité du test pour la détection des lésions cardiaques, les taux sériques de 16 sujets atteints d'IM ont été comparés à un groupe témoin (n = 16). Utilisation de la plaque 3-plex, les taux sériques de cMyBP-C, CK-MB et troponine Ic ont été déterminés. Tous les trois biomarqueurs ont été augmentés dans les sujets MI (voirFigure 5) de 3,7 fois (cMyBP-C) à 12,2 fois (CK-MB), bien que la variation des taux sériques a été la plus faible dans le groupe cMyBP-C.
| Processus | Uniplex essai | Test 3-plex | |
| journée de l'expérience 0 | plaque de manteau avec un anticorps de capture | Du jour au lendemain | N / A |
| journée de l'expérience 1 | Bloquer la plaque | 1 heure | 30 min |
| Préparer les échantillons et les séries norme | |||
| Incuber avec des échantillons et des normes | 1 heure | 2 heures | |
| Incuber avec l'anticorps de détection | 1 heure | 1 heure | |
| Ajouter le réactif de détection et de lectureplaque |
Tableau 1. Aperçu du déroulement de Uniplex et essais multiplex.
| LLOD (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0,126 ± 0,007 | 0,567 ± 0,073 | 400 ng / ml |
| cMyBP-C (3plex) | 0,057 ± 0,022 | 0,469 ± 0,171 | 400 ng / ml |
| CK-MB (3-plex) | 0,038 ± 0,014 | 0,587 ± 0,213 | 100 ng / ml |
| cTnI (3plex) | 0,033 ± 0,011 | 0,147 ± 0,053 | 25 ng / ml |
Tableau 2. Les limites de détection de Uniplex et calibrateurs 3 complexes. LLOD, limite inférieure de détection, est défini comme la concentration calculée du signal de l'ébauche + 3 fois l'écart type des échantillons blancs. QMD, limite inférieure de quantification, est définie comme étant une valeur supérieure à LLOD, avec un coefficient de variation (réciproque du rapport signal sur bruit) inférieure à 20%, et un recouvrement entre 80-120%. ULOQ, limite supérieure de quantification, est définie comme la concentration analysée plus élevée qui peut être mesurée avec un coefficient de variation inférieur à 20% et un recouvrement entre 80-120%.
Figure 1. Vue d'ensemble schématique de la plaque et de workflow. A) plaque à 96 puits est affiché. Chaque puits est revêtue de trois anticorps de capture différentes, à savoir contre cMyBP-C, la CK-MB et de la cTnI. Le quatrième disponiblescapable tache n'est pas utilisé et est recouvert avec de la BSA. B) Flux de travail de l'ELISA 3-plex. La plaque pré-enduit (étape 1) est bloqué et ensuite des échantillons de sérum ou de calibrateurs sont ajoutés à chaque puits et a permis de lier (étape 2). cMyBP-C (losanges rouges), la CK-MB (vert rectangle), et cTnI (orange ovale) se lient à leurs anticorps de capture respectifs. Après emportant les protéines non liées, les anticorps de détection SULFO-Tag-étiquetés sont ajoutés (étape 3). Ils se lient à la cMyBP-C, CK-MB ou troponine Ic protéines qui sont liés à leur anticorps de capture. Après élimination par lavage de l'anticorps de détection non fixé, tampon de lecture est ajouté et la plaque est analysé. Un signal électrique de la partie inférieure de la plaque initie une réaction chimique locale de la sulfo-TAG avec le tampon de lecture, ce qui conduit à la production de la lumière (étape 4). La quantité de lumière est directement proportionnelle à la quantité d'anticorps de détection, le sulfo-TAG marqué lié. Le capteur CCD reles cordons de la lumière et permet de distinguer les différents points à l'intérieur de chaque puits et par conséquent le signal provenant de chaque analyte (étape 5).
Figure 2. Courbe standard de cMyBP-C calibrateur mesurée en Uniplex ou en 3-plex. La même série standard a été mesurée dans un essai Uniplex, et sur la plaque 3-plex. La série de normes a commencé à 2,000 ng / ml et a été dilué en série 5x avec la plus faible concentration étant 0,128 ng / ml. En outre, un diluant a été utilisé comme un échantillon à blanc. La zone de détection du test est affichée en gris. La ligne inférieure indique la limite inférieure de détection (LLOD), qui est définie comme la concentration calculée du signal flan + 3 fois l'écart type des valeurs de blanc. La limite supérieure de détection est définie comme tIl concentration la plus élevée de la série standard qui peut être mesurée de façon fiable. Les deux courbes standard Uniplex et 3-plex cMyBP-C sont comparables. Les limites de détection sont présentés au tableau 2. au: unités arbitraires.
Figure 3. Des courbes standard de la CK-MB et troponine Ic. Les courbes d'étalonnage de la CK-MB et troponine Ic, qui ont été mesurées simultanément avec cMyBP-C sur la plaque 3-plex. Les deux étalons montrent une grande sensibilité et une grande plage dynamique. En gris de la zone de détection du test est affiché. La ligne inférieure indique la limite inférieure de détection (LLOD), qui est définie comme la concentration calculée du signal flan + 3 fois l'écart type des valeurs de blanc. La limite supérieure de détection est définie comme la concentration la plus élevée de la norme SE ries qui ne peut être mesurée de façon fiable. Les limites de détection sont présentés au tableau 2. au: unités arbitraires.
Figure 4. La réactivité croisée des anticorps de détection 3 complexes. Courbes standard distincts de cMyBP-C, CK-MB et troponine Ic ont été préparés et incubés sur la plaque 3-plex. Chaque courbe standard était que sondé avec des anticorps de détection individuels, afin d'évaluer la quantité de réactivité croisée entre les anticorps de détection individuels (par exemple cMyBP-C) et les autres calibrateurs (par exemple, CK-MB et troponine Ic). La réactivité croisée a été faible dans le test 3-plex. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5 "fo: content-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Figure 5. niveaux de biomarqueurs dans le sérum des MI et des sujets témoins mesurés par dosage 3-plex. Niveaux de cMyBP-C, CK-MB et troponine Ic ont été mesurées simultanément par dosage 3-plex dans des échantillons de sérum de 16 sujets témoins et 16 sujets atteints d'IM. Les données sont affichées par boîte à moustaches (moustaches représentent 10 e et 90 e percentile). Des niveaux accrus de trois biomarqueurs ont été observés dans le sérum des sujets atteints d'IM par rapport au groupe de contrôle. Comme les données ne montrent pas une distribution normale (testé par D'Agostino Pearson Omnibus), le test statistique Mann-Whitney non paramétrique a été utilisée pour tester les différences entre les groupes de contrôle et de MI. # P <0,001
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Discussion
Dans cette étude, nous montrons l'applicabilité d'un test immunologique multiplex pour la détection de multiples biomarqueurs cardiaques dans le sérum de patients. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport ELISA classique. Tout d'abord, ECL dans le kit de dosage est utilisé à la place de la détection colorimétrique. En ECL, un signal électrique stimule la production locale de la propriété mesurée (lumière), ainsi découpler l'événement de stimulation du signal, ce qui réduit fond 14. Cela permet une grande sensibilité, comme on peut le voir dans le tableau 2.
Multiplexage le test n'aboutit pas à une perte de sensibilité pour la détection de cMyBP-C, comme on peut le voir sur la figure 2 et le tableau 2. cMyBP-C mesuré dans Uniplex montré une plage de sensibilité et de détection comparable à cMyBP-C mesurés simultanément avec CK-MB et troponine Ic 13. Des mesures simultanées de réduire considérablement le volume d'échantillon nécessaire pour mesureursts, qui peut être un facteur déterminant lorsque l'on travaille avec des échantillons biologiques rares, ainsi que de réduire le temps passé à l'exécution de plusieurs dosages de Uniplex.
Comme pour tout test immunologique, le dosage est très dépendante de la qualité des anticorps utilisés. L'affinité, la spécificité et l'avidité des anticorps de capture et de détection est le principal déterminant de la sensibilité de l'essai 15. Différentes paires d'anticorps devraient être jugés pour voir quelle combinaison d'anticorps de capture et de détection donne la meilleure sensibilité et une gamme dynamique. Lors de l'utilisation des techniques de multiplexage, les anticorps de capture ont besoin d'être revêtu de tache sur le puits. Cela signifie qu'un faible volume, solution hautement concentrée est repéré sur une partie du bien (voir Figure 1) contrairement au revêtement de la solution utilisée dans le dosage Uniplex ou ELISA classique. Il devrait être évalué si l'anticorps de capture fonctionne aussi bien avec un revêtement en place comme il le fait avec un revêtement de solution. Réactivité croisée d'des anticorps ou des étalons avec une autre paire d'anticorps peuvent également donner lieu à des résultats faussement positifs 2,15.
Pour cette étude, une plaque de multiplex faite sur mesure a été conçu en collaboration avec MSD. Bien que toute une gamme de plaques de multiplex pré-enduits sont disponibles dans le commerce, cette innovation particulière nécessaire optimisation du dosage en raison d'un roman (cMyBP-C) cible a été multiplexées avec les essais du catalogue préalablement optimisées (CK-MB et troponine Ic). En tant que tel, un inconvénient évident de cette méthode est l'exigence supplémentaire pour un lecteur de plaque spécialisés et des plaques contenant des électrodes pour détecter le signal ECL. Bien que l'exécution d'un test multiplex par rapport à plusieurs tests de Uniplex permettra de réduire les coûts globaux, un lecteur de plaque doit être initialement acheté 2.
Utilisation de l'immuno-3-plex les niveaux de libération de biomarqueurs de cMyBP-C, CK-MB et troponine Ic ont été mesurées chez les sujets atteints d'IM et comparés à un groupe témoin. Le facteur de variation d'augmentation sur egroupe témoin e différait entre les trois biomarqueurs (voir Figure 4), tout comme la variation dans le groupe MI. Variation des niveaux de biomarqueurs est prévu dans une collection de patients MI, que le calendrier de prélèvement sanguin, taille de l'infarctus, ainsi que d'une foule d'autres facteurs susceptibles de contribuer à la libération de protéines cardiaques et sa dégradation ultérieure de la circulation. Que ce soit au niveau des biomarqueurs individuels en corrélation avec les paramètres cliniques, tels que taille de l'infarctus, justifie une étude plus approfondie.
La traduction de ces résultats directement à utiliser dans la salle d'urgence pour détecter MI nécessite un certain nombre de défis à relever. Premier d'entre eux est le temps le protocole nécessaire pour produire des résultats qui, même avec des plaques pré-enduites prend 3 ½ h. Comme pour les dosages de troponine utilisés aujourd'hui, le dosage doit être optimisé pour la détection rapide, permettant un diagnostic rapide.
En conclusion, nous avons mis au point un test de signature dans laquelle deux saventn biomarqueurs cardiaques et d'un biomarqueur potentiel cardiaque, cMyBP-C, ont été démontrées pour détecter simultanément la présence d'une lésion du myocarde chez les patients atteints d'IM par la quantification des titres sériques des protéines cardiaques.
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Disclosures
Une demande de brevet est en instance complète (Application de série n ° 13/464, 466, Pub No. US 2012/0282618 A1 et Date:. 05/04/12) afin de déterminer les facteurs de risque associés à la dégradation cMyBP-C et la libération dans le liquide du corps humain et quantifier le niveau de cMyBP-C dans un fluide corporel humain.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le National Institutes of Health des subventions R01HL105826 et K02HL114749 (Dr. Sadayappan) et américaines Bourses Midwest Heart Association; 11PRE7240022 (M. Barefield) et 13POST14720024 (Dr. Govindan). Les auteurs remercient l'aide du Dr. Jimmy Page, Jill Clampit et le Dr John Hudson, MSD, pour leur excellent soutien technique et de la littérature dans le développement du dosage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
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