Summary
Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.
Abstract
Biomarker werden immer wichtiger in der klinischen Entscheidungsfindung, sowie Grundlagenforschung. Diagnose Myokardinfarkt (MI) wird weitgehend durch Erfassen herz-spezifische Proteine in Patienten Serum oder Plasma als Indikator einer Myokard-Schädigung zurückzuführen. Nachdem vor kurzem gezeigt, dass Herzmyosin Protein-C (cMyBP-C) im Serum nach MI erkennbar, haben wir es als möglicher Biomarker MI vorgeschlagen. Biomarker sind in der Regel mit herkömmlichen Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assays nachgewiesen. Allerdings erfordert diese Technik eine große Probenvolumen hat einen kleinen dynamischen Bereich und kann nur ein Protein zu einem Zeitpunkt zu messen.
Hier zeigen wir, ein Multiplex-Immunoassay, bei dem drei kardialen Proteine gleichzeitig mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Messen cMyBP-C in Uniplex oder zusammen mit Creatin-Kinase MB und Troponin I zeigten eine vergleichbare Empfindlichkeit. Diese Technik nutzt die Meso-Skala Entdeckung(MSD) Verfahren zum Multiplexen in einer 96-Well-Platte mit Elektrochemilumineszenz zur Detektion kombiniert. Während nur geringe Probenvolumina benötigt werden, sind eine hohe Empfindlichkeit und einen großen dynamischen Bereich erreicht. Mit dieser Technik, maßen wir cMyBP-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I-Spiegel im Serum von 16 Patienten mit MI und verglichen die Ergebnisse mit 16 Kontrollpersonen. Wir konnten alle drei Marker in diesen Proben erkennen und fand alle drei Biomarker nach MI erhöht werden. Diese Technik ist daher geeignet für den empfindlichen Nachweis von kardialen Biomarkern im Serum.
Introduction
Die Messung von geringen Mengen an Protein in komplexen biologischen Proben, wie Serum, ist von wachsender Bedeutung für die klinische Behandlung der Patienten sowie der Grundlagenforschung. So ist ein Anstieg der Serumspiegel von kardialen Biomarkern wie Troponin I, in einer klinischen Umgebung, die mit akutem Myokardinfarkt (MI) 1. Um Proteine im Serum zu erkennen, ist Standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) die am häufigsten verwendete Technik, da sie hohe Empfindlichkeit aufweist und ermöglicht eine absolute Quantifizierung des Analyten. Jedoch erfordern herkömmliche ELISAs eine relativ große Menge der Probe (in der Regel 100 ul), haben einen hohen Hintergrundsignal in einigen biologischen Flüssigkeiten, und sind mit der Messung nur eines Analyten per ELISA 2 beschränkt.
Kürzlich wurde ein neues Immunoassay-Technik vorgestellt, umgeht viele dieser Nachteile. Diese modifizierte Assay entwickelt von MSD verwendet electrochemiluminescausübt (ECL) zur Signalerfassung, die für einen sehr niedrigen Hintergrund und eine erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht, so dass die Verwendung von kleinen Probenvolumina. Elektrochemilumineszenz ist der Reporter-Molekül Ruthenium (II) trisbipyridal, die den Nachweis-Antikörper gebunden basiert. Das Reportermolekül emittiert Licht bei 620 nm auf die elektrische Stimulation der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen, die Kohlenstoff-Elektrode in ihnen 3 integriert ist. Auch durch die Verwendung Spotlackierung können mehrere Einfang-Antikörper in einer Vertiefung (bis 10 auf einer 96-Well-Platte) beschichtet, um für die gleichzeitige Quantifizierung von verschiedenen Proteinen in einer einzigen Probe 4. Diese Technik wurde kürzlich verwendet, um proinflammatorische Zytokin Profile im Serum 5,6 messen. Die Multiplex-Platten von MSD positiv auf andere Multiplex Assay-Plattformen 7 zu vergleichen.
Mit MSD als primäre Assay-Plattform, wir weiterentwickelt eine maßgeschneiderte 3 komplexe Platte, dass ceine gleichzeitig auch den Grad der kardialen Myosinbindungsprotein-C (cMyBP-C), Creatin-Kinase-MB (CK-MB) und Troponin I (cTnI), und die Ergebnisse wurden mit Monoplex Detektion cMyBP-C verglichen. CK-MB und cTnI sind gut etablierte Biomarker für MI. Allerdings kann erhöht dieser Biomarker von Krankheiten außer MI verursacht werden, z. B. Myokarditis oder Nierenversagen 8. Dies spricht für die Zugabe von zusätzlichen Biomarker, um die Spezifität des MI Diagnose zu erhöhen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass cMyBP-C ist auch ein potentieller Biomarker für MI 9. cMyBP-C ist ein dickes Filament assoziierten Protein, das in das Herz, 10-12, aber nicht in Skelett-oder glatte Muskulatur exprimiert wird. Somit ist das erhöhte Niveau der cMyBP-C in das Kreislaufsystem ein spezifischer Indikator für Herzschäden 13.
In dieser Studie verglichen wir Uniplex Erkennung cMyBP-C mit der Verwendung einer benutzerdefinierten 3-Plex Assay Serumspiegel messencMyBP-C, CK-MB und cTnI im Serum von Patienten mit MI. In Zukunft könnte diese Signatur Technik verwendet, um MI bei Patienten mit Brustschmerzen in der Notaufnahme diagnostizieren.
Die Institution Review Board (IRB) der Loyola University Chicago genehmigten die Studie für den Einsatz von deidentified humanen Proben und die Verwendung des Immunoassays (LU # 20392).
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Protocol
1. Uniplex cMyBP-C Assay
- Am Tag vor dem Experiment, Mantel der 96er MSD bloßen Standard-Platte mit Capture-Antikörper. Für cMyBP-C, mit einem Volumen von 30 ul monoklonalen Maus-anti-cMyBP-C-Antikörper (Gelatine frei) in einer Konzentration von 5 g / ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Da das gut ist hydrophob, Pipette die Lösung in der unteren Ecke des Brunnens, dann tippen Sie auf die Seiten der Platte, um die Lösung über den gesamten gut verteilt.
- Die Platte wird mit Abklebefolie abgedeckt und O / N bei 4 ° C ohne Schütteln.
- Entfernen Sie die Capture-Antikörper-Lösung, indem die Lösung über einen Waschbecken und dann auf einem Stapel Papierhandtücher. Nicht-spezifische Bindung zu der Platte wird durch Zugabe von 150 ul einer 5% (w / v) Blocker-A (high-grade BSA) in PBS in jede Vertiefung blockiert.
- Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h bei RT unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute.
- Während der Sperrung Schritt, bereiten die Standards und sBeispiele. Machen Sie das Standard-Serie durch Verdünnen rekombinantes cMyBP-C-Protein-Fragment (Aminosäuren 1-271) zu einer Ausgangskonzentration von 2.000 ng / ml in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Dann seriell um den Faktor 5 verdünnt in 1% (w / v) Blocker A / PBS. Insgesamt 7 Standards + 1 Rohling (1% (w / v) Blocker A / PBS allein) wurden verwendet.
- Blocking-Lösung und waschen die Platte 3x mit 150 ul 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Jedes Mal, entfernen Sie die Waschlösung durch Umdrehen der Platte über einem Waschbecken. Nach dem dritten Waschschritt Flick energisch die Platte über ein Waschbecken und klopfen Sie die Platte mit Nachdruck auf einer Schicht von Papiertüchern, bis es vollständig trocken ist. Dies ist ein entscheidender Schritt, da Inkubationsvolumina klein sind und der verbleibende Waschlösung deutlich verdünnen die nächste Inkubation.
- Je 25 ul Standards und Proben in die Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und Inkubation bei RT unter Schütteln bei 700 rpm für 1 Stunde.
- Bereiten Sie die Detektions-Antikörper-Lösung bei 1 ug / ml in 1%-Blocker A / PBS. A custom gemacht cMyBP-C-Antikörper (Epitop Aminosäuren 2-14) mit MSD SULFO-TAG Kennzeichnung dient als Nachweis-Antikörper. Kits sind für SULFO-TAG Kennzeichnung vorhanden, so dass es ein relativ einfaches Verfahren, um jede Antikörper beschriften.
- Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben.
- In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung, versiegeln Sie die Platte, und Inkubation bei RT für 1 h auf einem Schüttler bei 700 Umdrehungen pro Minute eingestellt.
- Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software (siehe Reagenz Abschnitt) zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x Lese-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser.
- Wiederholen Sie den Waschschritt wie in Schritt 1.4 beschrieben.
- In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Achten Sie darauf, um Luftblasen (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode) zu vermeiden. Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der BrancheImager.
2. 3-Komplex cMyBP-C, CK-MB und cTnI Assay
- Ein 96-Loch-3-Komplex Platte und Verdünnungsmittel Lösungen auf RT vor Gebrauch ins Gleichgewicht. Diese Platte ist vorher mit Fänger-Antikörper für cMyBP-C, CK-MB und cTnI von MSD.
- In 25 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS in jede Vertiefung. Tippen Sie auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist.
- Verschließen Sie die Platte mit Abklebefolie, legen Sie die Platte auf einem Schüttler, und schütteln bei 700 rpm für 30 min.
- In der Zwischenzeit wird eine Verdünnungsreihe Einzelkalibrators hergestellt. Da jeder gut drei Fänger-Antikörper drei Kalibratoren müssen gemischt und seriell vor Gebrauch verdünnt. Verdünnen rekombinanten cMyBP-C, CK-MB (MSD) und cTnI (MSD) zusammen in 1% (w / v) Blocker A / PBS auf eine Probe mit 2,000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml zu erstellen CK- MB und 25 ng / ml cTnI (Probe A).
- Eine endgültige Volumen von mindestens 100 ul wird für jeden Standard vorbereitet. Umrunden das Standard-Serie, seriell verdünnt die Proben um den Faktor 5. Verwenden Sie 25 ul der Probe A in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe B. Dann erstellen Sie verwenden 25 ul Probe B in 100 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS Probe C erstellen und so weiter. Humanes Serum-Proben von 16 Patienten mit MI und 16 Kontrollpersonen wurden verwendet, um cMyBP-C, CK-MB und cTnI zu messen. Diese Proben wurden verdünnt, 2x in 1% (w / v) Blocker A / PBS.
- In 25 ul der Standards und verdünnten Proben auf die 25 ul bereits in den Vertiefungen der Platte 3-Komplex. Es ist wichtig, auch eine leere (nur Verdünnungsmittel). Um die Technik zu etablieren, werden die Proben in technischen dreifach geladen. Ansonsten sind Duplikate ausreichend.
- Verschließen Sie die Platte wieder (Abklebefolie kann wiederverwendet werden) und Inkubation auf einem Schüttler (700 rpm) bei RT für 2 Stunden.
- Kurz bevor die Inkubation abgeschlossen ist, wird der Nachweis-Antikörper-Lösung hergestellt. Das verwendete Verdünnungsmittel ist 1% (w / v) Blocker-A in PBS. Alle three Sulfo-markierten Nachweisantikörper gemeinsam in einer Endkonzentration von 1 ug / ml jeder verdünnten. Detektions-Antikörper sind in der Regel bei einer 50x stock Konzentration zur Verfügung gestellt.
- Für eine vollständige 96-Well-Platte, ist 2.700 ul gesamten verdünnten Lösung benötigt (mit Pipettieren Fehler enthalten). In 54 ul jeder Detektionsantikörper zu 2.538 ul 1% (w / v) Blocker A / PBS.
- Nach 2 Stunden, entfernen Lösungen durch kräftiges Ausklopfen der Platte über einem Waschbecken. Waschen Sie die Wells 3x mit 150 ul von 0,05% Tween-20 in PBS. In 25 ul Detektions-Antikörper-Lösung in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette, und die Seiten der Platte abgegriffen werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Lösung gut bedeckt ist.
- Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 h unter Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute.
- Während der Inkubationszeit, laufen MSD Demo-Platte (Platte mit LED-Leuchten), um die ordnungsgemäße Funktion des Sector Imager und Software zu gewährleisten. Auch verdünnter die Lese-Puffer, die von MSD vorgesehen ist, durch Zugabe von 5 ml 4x lesen-Puffer auf 15 ml destilliertem Wasser.
- Wiederholen Sie den Waschschritt in Schritt 2.8 beschrieben.
- In 150 ul Lese-Puffer in jede Vertiefung mit einem Mehrkanal-Pipette. Luftblasen vermeiden ist entscheidend (reverse Pipettieren ist eine geeignete Methode). Nach Zugabe der Lese-Puffer, sofort scannen die Platte in der Branche Imager.
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Representative Results
Die Grundprinzipien und Workflow des 3-Komplex Assays sind in Abbildung 1 dargestellt, und die gesamte Workflow wird in Tabelle 1 beschrieben. Uniplex Assays arbeiten nach dem gleichen Prinzip der Ausnahme, dass der gesamte Boden ist gut mit einem Capture-Antikörper beschichtet. Signalerfassung durch ECL in dem ein elektrisches Signal an den Boden des Bohrlochs angelegt wird, durchgeführt. Dies wiederum löst eine lokale Erzeugung von Licht durch eine chemische Reaktion der Lese-Puffer mit Sulfonsäuregruppen TAG Etikett auf der Detektions-Antikörper. Dies führt zu niedrigen Hintergrund und hohe Empfindlichkeit des Tests. In Abbildung 2 ist der Standard-Kurve cMyBP-C in der Uniplex Assay zu der cMyBP-C in der 3-Plex Assay verglichen. Beide Assays zeigen eine sehr hohe Empfindlichkeit und einen großen Dynamikbereich. Erfassungsebenen und Quantifizierung sind in Tabelle 2 dargestellt und sind sowohl in Uniplex und 3-Plex-Assays vergleichbar. Erfassungsebenen für cTnI und CK-MB sind ALSo in Abbildung 3 und Tabelle 2 gezeigt. Inter-Operator-Variabilität wurde durch Messung identischen Proben (n = 2, 3 Wiederholungen technisch) von zwei verschiedenen Betreiber und Variabilität wurde als niedrig (CV 8,5%) ermittelt. Kreuzreaktivitäten der Nachweisantikörper mit den anderen beiden Kalibratoren wurde durch Inkubation einzelnen Standardkurven aller drei Kalibratoren mit einzelnen Nachweisantikörper (Abbildung 4) untersucht. Nur geringe Kreuzreaktivität wurde zwischen CK-MB Kalibrator und sowohl cTnI und cMyBP-C Nachweisantikörpern gesehen, während keine Kreuzreaktion zwischen den anderen Kalibrier-und Nachweis-Antikörper beobachtet wurde.
Als Beweis für die Anwendbarkeit des Assays für den Nachweis von kardialen Schädigung wurden die Serumspiegel von 16 Patienten mit MI mit einer Kontrollgruppe (n = 16) verglichen. Mit dem 3-Komplex Platte wurden die Serumspiegel von cMyBP-C, CK-MB und cTnI bestimmt. Alle drei Biomarker wurden in den MI Probanden erhöht (sieheAbbildung 5) von 3,7-fach (cMyBP-C) auf 12,2-fach (CK-MB), obwohl Variation der Serumspiegel war die niedrigste in der cMyBP-C-Gruppe.
| Prozess | Uniplex Assay | 3-Plex Assay | |
| Experiment Tag 0 | Coat Platte mit Capture-Antikörper | Über Nacht | N / A |
| Experiment 1 Tag | Blockieren Sie die Platte | 1 Stunde | 30 min |
| Bereiten Proben und Standard-Serie | |||
| Inkubation mit Proben und Standards | 1 Stunde | 2 Stunden | |
| Inkubieren mit Detektions-Antikörper | 1 Stunde | 1 Stunde | |
| In Detektionsreagens und lesenPlatte |
Tabelle 1. Workflow-Übersicht Uniplex und Multiplex-Assays.
| Untere Nachweisgrenze (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0,126 ± 0,007 | 0,567 ± 0,073 | 400 ng / ml |
| cMyBP-C (3plex) | 0,057 ± 0,022 | 0,469 ± 0,171 | 400 ng / ml |
| CK-MB (3-Komplex) | 0,038 ± 0,014 | 0,587 ± 0,213 | 100 ng / ml |
| cTnI (3plex) | 0,033 ± 0,011 | 0,147 ± 0,053 | 25 ng / ml |
Tabelle 2. Nachweisgrenzen von Uniplex und 3-Komplex Kalibratoren. Untere Nachweisgrenze, untere Nachweisgrenze, wird berechnet als die Konzentration des Signals des Rohlings + 3 fache Standardabweichung der Blindproben definiert. LLOQ, untere Bestimmungsgrenze, wird als ein Wert höher als untere Nachweisgrenze definiert, mit einem Koeffizienten von Varianz (Kehrwert des Signal-Rausch-Verhältnis) von weniger als 20% und einer Erholung zwischen 80-120%. 120% - ULOQ, obere Bestimmungsgrenze, gilt als die höchste Konzentration analysiert, die mit einem Koeffizienten von Varianz von weniger als 20% und einer Erholung zwischen 80 gemessen werden kann definiert.
Abbildung 1. Schematische Übersicht über die Platte und Workflow. A) 96-Well-Platte dargestellt. Jede Vertiefung wird mit drei verschiedenen Fänger-Antikörper, dh gegen cMyBP-C, CK-MB und cTnI beschichtet. Der vierte ErfolgLage vor Ort wird nicht verwendet und ist mit BSA. B beschichtet) Arbeitsablauf der 3-Komplex ELISA. Die vorbeschichteten Platte (Schritt 1) blockiert und dann Serumproben oder Kalibratoren werden in jede Vertiefung gegeben und binden gelassen (Schritt 2). cMyBP-C (Red Diamonds), CK-MB (grünes Rechteck) und cTnI (orange oval) binden an ihre jeweiligen Fänger-Antikörper. Nach Auswaschen der nicht gebundenen Proteine werden die Sulfo-TAG-markierten Nachweisantikörper hinzugefügt (Schritt 3). Sie werden auf die cMyBP-C, CK-MB, oder cTnI Proteine, die an ihre Capture-Antikörper gebunden sind, binden. Nach dem Waschen von ungebundenem Nachweisantikörper wird Lesepuffer gegeben und die Platte wird analysiert. Ein elektrisches Signal an der Unterseite der Platte initiiert eine lokale chemische Reaktion der Sulfo-Tag mit der Lese-Puffer, die zur Erzeugung von Licht (Schritt 4). Die Menge des Lichts ist direkt proportional zur Menge an Sulfogruppen TAG markierten Nachweisantikörper gebunden. Der CCD-Bildwandler reSchnüre das Licht und kann die verschiedenen Spots in jede Vertiefung und damit das Signal, das von jedem Analyten (Schritt 5) zu unterscheiden.
Abbildung 2. Standardkurve cMyBP-C Kalibrator in Uniplex oder in 3-Komplex gemessen. Das gleiche Standard-Serie in einem Uniplex Assay gemessen wurde, und auf der 3-Komplex Platte. Die Standard-Reihe bei 2.000 ng / ml gestartet und wurde seriell verdünnt 5x mit der niedrigsten Konzentration als 0.128 ng / ml. Darüber hinaus wurde Verdünnungsmittel als Blindprobe verwendet. Der Erfassungsbereich des Assays ist in grau dargestellt. Die untere Zeile zeigt die untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze), die als die berechnete Konzentration des Rohlings Signal + 3mal die Standardabweichung der Blindwerte definiert ist. Die obere Grenze der Erkennung wird als t definierter höchste Konzentration der Standard-Serie, die zuverlässig gemessen werden kann. Beide Uniplex und 3-Komplex cMyBP-C Standard Kurven sind vergleichbar. Nachweisgrenzen sind in Tabelle 2 dargestellt. au: willkürlichen Einheiten.
3. Standardkurven von CK-MB und cTnI. Standard-Kurven von CK-MB und cTnI, die gleichzeitig mit cMyBP-C wurden gemessen am 3-Komplex Platte. Beide Standards zeigen eine hohe Empfindlichkeit und einen großen Dynamikbereich. In grauen der Erfassungsbereich des Tests angezeigt. Die untere Zeile zeigt die untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze), die als die berechnete Konzentration des Rohlings Signal + 3mal die Standardabweichung der Blindwerte definiert ist. Der obere Grenzwert der Erkennung ist als die höchste Konzentration des Standards definiert se Ries, die verlässlich bewertet werden können. Nachweisgrenzen sind in Tabelle 2 dargestellt. au: willkürlichen Einheiten.
Abbildung 4. Kreuzreaktivität von 3 komplexen Nachweis-Antikörper. Separate Standard Kurven cMyBP-C, CK-MB und cTnI wurden hergestellt und inkubiert auf den 3-Komplex Platte. Jeder Standard-Kurve war als sondiert mit einzelnen Detektions-Antikörper, um die Menge der Kreuzreaktivität zwischen einzelnen Detektions-Antikörper (zB cMyBP-C) und den anderen Standards (zB CK-MB und cTnI) zu beurteilen. Kreuzreaktivität gering war in der 3-Plex Assay. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 5 "fo: content-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Abbildung 5. Biomarker im Serum von MI und Kontrollpersonen mit 3-Plex Assay gemessen. Levels von cMyBP-C, CK-MB und cTnI gleichzeitig wurden durch 3-Plex Assay im Serum von 16 Kontrollpersonen und 16 Patienten mit MI gemessen. Die Daten werden durch die Box und Whisker-Plots (Schnurrhaare darstellen 10. und 90. Perzentil) angezeigt. Erhöhte Konzentrationen aller drei Biomarker wurden im Serum von Patienten mit MI im Vergleich mit der Kontrollgruppe beobachtet. Da die Daten nicht zeigte eine Normalverteilung (geprüft durch D'Agostino Pearson Omnibus) wurde die nicht-parametrischen Mann-Whitney statistischer Test verwendet, um Unterschiede zwischen Kontroll-und MI-Gruppen testen. # P <0,001
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Discussion
In dieser Studie zeigen wir die Anwendbarkeit eines Multiplex-Immunoassay zum Nachweis von mehreren kardialen Biomarkern im Serum von Patienten. Dieses Verfahren hat zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA. Zuerst wird in der ECL-Assay-Kit statt kolorimetrischen Nachweis verwendet. In ECL, stimuliert ein elektrisches Signal die lokale Produktion der gemessenen Eigenschaft (Licht), damit Entkopplung der Stimulation Ereignis aus dem Signal, das Hintergrund 14 reduziert. Dies ermöglicht eine hohe Empfindlichkeit, wie aus Tabelle 2 ersichtlich.
Multiplexen der Assay nicht zu einem Verlust der Sensitivität für den Nachweis von cMyBP-C führen, wie in Fig. 2 und Tabelle 2 zu entnehmen. cMyBP-C in Uniplex gemessen zeigte eine Empfindlichkeit und Reichweite vergleichbar cMyBP-C gleichzeitig mit CK-MB und cTnI 13 gemessen. Gleichzeitige Messungen erheblich reduzieren das Volumen der Probe für measuremen benötigtts, die ein entscheidender Faktor sein kann, wenn die Arbeit mit seltenen biologischen Proben, sowie die Verringerung der Zeit verbrachte das Ausführen mehrerer Uniplex Assays.
Wie bei jedem Immunoassay ist der Assay stark abhängig von der Qualität der eingesetzten Antikörper. Die Affinität, Spezifität und Avidität der Erfassung und Nachweis-Antikörper ist die wichtigste Determinante der Sensitivität des Tests 15. Verschiedene Antikörperpaare sollte versucht zu sehen, welche Kombination von Capture-und Nachweis-Antikörper gibt die höchste Empfindlichkeit und Dynamik werden. Bei der Verwendung von Multiplex-Techniken, müssen die Fänger-Antikörper zu spot-beschichtet auf dem gut. Dies bedeutet, dass ein geringes Volumen, hochkonzentrierte Lösung auf einen Teil des Schachts (siehe Abbildung 1) im Gegensatz zu Lösung Beschichtung im Uniplex Assay oder in herkömmlicher ELISA verwendet wird gesichtet. Es sollte bewertet werden, wenn der Capture-Antikörper führt sowie mit Spotlack, wie es mit der Lösung Beschichtung macht werden. KreuzreaktivitätAntikörper oder Kalibratoren mit anderen Antikörper-Paar kann auch zu falsch-positiven Ergebnissen 2,15.
Für diese Studie wurde eine maßgeschneiderte Multiplex Platte in Zusammenarbeit mit MSD entwickelt. Obwohl eine Reihe von Pre-beschichtete Multiplex-Platten im Handel erhältlich sind, diese besondere Innovation Optimierung des Assays erforderlich, weil a novel (cMyBP-C) Ziel mit zuvor optimierten Katalog Assays (CK-MB und cTnI) Multiplex wurde. Als solches ist ein offensichtlicher Nachteil dieses Verfahrens ist der zusätzliche Anforderung für einen spezialisierten Gerätes und Platten, die Elektroden, um die ECL-Signal zu detektieren. Obwohl läuft ein Multiplex-Assays im Vergleich zu mehreren Uniplex Assays Gesamtkosten reduzieren, muss eine Platte Leser zunächst erworben werden 2.
Mit dem 3-Plex Immunoassay die Höhe der Biomarker Freisetzung von cMyBP-C, CK-MB und cTnI wurde bei Patienten mit MI gemessen und im Vergleich zu einer Kontrollgruppe. Die Falte Änderung der Anstieg über the Kontrollgruppe unterschieden sich zwischen den drei Biomarker (siehe Abbildung 4), ebenso wie die Veränderung in der MI-Gruppe. Variation in der Biomarker-Ebenen ist in einer Sammlung von MI-Patienten zu erwarten, da Timing der Blutentnahme, Infarktgröße, sowie eine Vielzahl von anderen Faktoren, die die Freisetzung von kardialen Proteine und ihre spätere Verschlechterung der Durchblutung beitragen. Ob der Ebene der einzelnen Biomarker mit klinischen Parametern, wie Infarktgröße korrelieren, weiter untersucht.
Übersetzt man diese Erkenntnisse direkt in die Notaufnahme zu verwenden, um MI erkennen erfordert eine Reihe von Herausforderungen zu überwinden. Prime unter ihnen ist die Zeit, das Protokoll führt zu den Ergebnissen, die auch mit Pre-beschichteten Platten dauert 3 ½ Stunden zu produzieren. Wie bei den Troponin-Assays verwendet heute, sollte der Test für die schnelle Erkennung optimiert werden, so dass eine schnelle Diagnose.
Zusammenfassend haben wir ein Signatur-Test, bei dem zwei wissen entwickeltn kardiale Biomarker und ein möglicher kardialer Biomarker, cMyBP-C, die nachweislich die gleichzeitig das Vorhandensein von Myokardverletzung bei Patienten mit MI durch Quantifizierung der kardialen Protein Serum-Titer.
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Disclosures
Eine vollständige Patentanmeldung anhängig ist (mit der Seriennummer 13/464, 466, Pub Nr. US 2012/0282618 A1 und Datum:. 05.04.12), um die Risikofaktoren, die mit cMyBP-C Abbau und Freisetzung in die menschliche Körperflüssigkeit verbunden zu bestimmen und Quantifizieren des Niveaus von cMyBP-C in einer humanen Körperflüssigkeit.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse R01HL105826 und K02HL114749 (Dr. Sadayappan) und American Heart Association Midwest Stipendien finanziert werden; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) und 13POST14720024 (Dr. Govindan). Die Autoren danken der Unterstützung von Dr. Jimmy Page, Jill Clampit und Dr. John Hudson, MSD, für ihre ausgezeichnete technische und Literatur Unterstützung bei der Entwicklung des Assays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
- Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
- Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
- Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
- Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
- Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
- Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
- Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
- Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
- Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
- Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
- Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
- Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
- Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
- Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
- Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).
