Summary
Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.
Abstract
Biomarcatori stanno diventando sempre più importante nel processo decisionale clinico, così come la scienza di base. Diagnosi di infarto del miocardio (MI) è in gran parte determinata rilevando proteine cardiaco-specifici nel siero o nel plasma dei pazienti come indicatore di danno miocardico. Avendo recentemente dimostrato che miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C) è rilevabile nel siero dopo MI, abbiamo proposto come potenziale biomarker per MI. Biomarcatori sono in genere rilevati dai tradizionali panino saggi immunoenzimatica. Tuttavia, questa tecnica richiede un volume di campione grande, ha una piccola gamma dinamica, e può misurare solo una proteina alla volta.
Qui vi mostriamo un test immunologico multiplex in cui tre proteine cardiache possono essere misurate simultaneamente con alta sensibilità. Misurare cMyBP-C in Uniplex o insieme a creatina chinasi MB e troponina cardiaca ho mostrato sensibilità paragonabile. Questa tecnica utilizza il Meso Scale Discovery(MSD) metodo di multiplazione in una piastra a 96 pozzetti combinato con ElettroChemiLuminescenza per il rilevamento. Mentre sono necessari solo piccoli volumi di campione, alta sensibilità e una grande gamma dinamica si ottengono. Utilizzando questa tecnica, abbiamo misurato cMyBP-C, creatina chinasi MB e troponina cardiaca I livelli in campioni di siero di 16 soggetti con infarto miocardico e confrontato i risultati con 16 soggetti di controllo. Siamo stati in grado di rilevare tutti i tre marcatori in questi campioni e ho trovato tutti e tre i biomarcatori per essere aumentati dopo il MI. Questa tecnica è quindi adatto per la rivelazione sensibile dei marcatori cardiaci in campioni di siero.
Introduction
La misura di basse quantità di proteine in campioni biologici complessi, quali siero, è di crescente importanza clinica per la gestione del paziente, così come la scienza di base. Per esempio, un aumento dei livelli sierici di marcatori cardiaci, quali troponina I, in un ambiente clinico è coerente con infarto acuto del miocardio (MI) 1. Per rilevare le proteine in campioni di siero, saggio immunoenzimatico standard (ELISA) è la tecnica più utilizzata come ha alta sensibilità e consente la quantificazione assoluta dell'analita. Tuttavia, ELISA tradizionali richiedono una quantità relativamente grande di campione (tipicamente 100 pl), hanno alta segnale di fondo in alcuni fluidi biologici, e sono limitati alla misurazione di un solo analita per ELISA 2.
Recentemente, una nuova tecnica di immunodosaggio è stata introdotta che aggira molti di questi inconvenienti. Questo test modificato, sviluppato da MSD, utilizza electrochemiluminescrenza (ECL) per la rilevazione del segnale, che consente un background molto bassa e una maggiore sensibilità, consentendo l'uso di piccoli volumi di campione. ElettroChemiLuminescenza è basato sulla molecola reporter rutenio (II) trisbipyridal, che è attaccato agli anticorpi di rivelazione. Questa molecola reporter emette luce a 620 nm sulla stimolazione elettrica del fondo della piastra a 96 pozzetti dotato di elettrodi di carbonio in essi integrati 3. Inoltre, utilizzando rivestimento macchia, anticorpi di cattura multipli possono essere rivestiti in un pozzetto (fino a 10 su una piastra a 96 pozzetti), consentendo la quantificazione simultanea di proteine differenti in un singolo campione 4. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per misurare profili di citochine proinfiammatorie nel siero 5,6. Le piastre multiplex da MSD reggono bene il confronto con altre piattaforme di test multiplex 7.
Utilizzando MSD come la piattaforma di riferimento primario, abbiamo ulteriormente sviluppato un custom made piatto 3-plex che cdi quantificare simultaneamente il livello di miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C), creatina-chinasi MB (CK-MB) e troponina I cardiaca (cTnI), ed i risultati sono stati confrontati con il rilevamento monoplex di cMyBP-C. CK-MB e cTnI sono biomarcatori ben consolidate per MI. Tuttavia, gli aumenti di questi marcatori possono essere causati da patologie diverse da MI, es miocardite o insufficienza renale 8. Questo sostiene l'aggiunta di biomarcatori supplementari per aumentare la specificità della diagnosi di MI. Abbiamo recentemente dimostrato che cMyBP-C è anche un potenziale biomarcatore per MI 9. cMyBP-C è un filamento spesso associata proteina che è espressa nel cuore, 10-12 ma non nei muscoli scheletrici o lisci. Così, l'aumento del livello di cMyBP-C nel sistema circolatorio è un indicatore specifico di danno cardiaco 13.
In questo studio, abbiamo confrontato rilevamento uniplex di cMyBP-C con l'uso di un saggio 3-plex personalizzato per misurare i livelli sierici dicMyBP-C, CK-MB e cTnI nel siero dei pazienti con infarto miocardico. In futuro, questa tecnica di firma può essere utilizzato per diagnosticare MI in pazienti che si presentano con dolore toracico in Pronto Soccorso.
La board review istituzione (IRB) del Loyola University di Chicago ha approvato lo studio per l'utilizzo di campioni umani deidentified e l'uso del saggio immunologico (LU # 20392).
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Protocol
1. Uniplex cMyBP-C Assay
- Il giorno prima dell'esperimento, cappotto della piastra standard nuda a 96 pozzetti MSD con anticorpo di cattura. Per cMyBP-C, utilizzare un volume 30 pl di topo monoclonale anti-cMyBP-C (gelatina libero) ad una concentrazione di 5 mg / ml diluito in tampone fosfato (PBS).
- Poiché il pozzo è idrofobo, pipettare la soluzione nel angolo inferiore del pozzo; toccare i lati della piastra di diffondere la soluzione su tutta bene.
- La piastra è rivestita con un adesivo ed incubata O / N a 4 ° C senza agitazione.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo di cattura toccando la soluzione fuori sopra un lavandino e poi su una pila di tovaglioli di carta. Legame non specifico alla piastra è bloccata con l'aggiunta di 150 pl di un 5% (w / v) Una soluzione bloccante (alta qualità BSA) in PBS ad ogni pozzetto.
- Sigillare la piastra e incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione a 700 rpm.
- Durante la fase di bloccaggio, preparare gli standard e samples. Rendere la serie standard diluendo frammento ricombinante proteina cMyBP-C (amminoacidi 1-271) ad una concentrazione iniziale di 2,000 ng / ml in 1% (w / v) bloccante A / PBS. Poi diluire serialmente di un fattore 5 in 1% (w / v) bloccante A / PBS. Totale di 7 standard + 1 blank (1% (w / v) bloccante A / solo PBS) sono stati utilizzati.
- Rimuovere la soluzione di saturazione e lavare la piastra 3 volte con 150 microlitri 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Ogni volta, rimuovere la soluzione di lavaggio invertendo la piastra sopra un lavandino. Dopo la terza fase di lavaggio, con forza flick la piastra sopra un lavandino e Pat la piastra energicamente su uno strato di asciugamani di carta fino a quando non è completamente asciutto. Questo è un punto cruciale, come volumi di incubazione sono piccole, e la soluzione di lavaggio restante sarà diluire significativamente la prossima incubazione.
- Pipettare 25 ml di standard e campioni nei pozzetti. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente, agitando a 700 rpm per 1 ora.
- Preparare la soluzione di anticorpo di rilevazione a 1 mg / ml in 1% bloccante A / PBS. A custom fatto cMyBP-C anticorpi (epitopi aminoacidi 2-14) con MSD SULFO-TAG etichettatura serve come l'anticorpo di rilevazione. I kit sono disponibili per l'etichettatura SULFO-TAG, che lo rende una procedura relativamente semplice per etichettare qualsiasi anticorpo.
- Ripetere la fase di lavaggio come descritto al punto 1.4.
- Aggiungere 25 ml di soluzione di anticorpo di rilevazione per ciascun bene, sigillare la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora su un agitatore impostato a 700 rpm.
- Durante il periodo di incubazione, eseguire MSD di demo-piastra (piastra con luci a LED) per garantire il corretto funzionamento del Imager Settore e del software (vedi sezione reagente). Inoltre, diluire la lettura del buffer, che è fornito da MSD, aggiungendo 5 ml di 4x lettura-buffer a 15 ml di acqua distillata.
- Ripetere la fase di lavaggio come descritto al punto 1.4.
- Aggiungere 150 ml di lettura del buffer di ogni bene usando una pipetta multicanale. Essere sicuri di evitare bolle d'aria (pipettaggio inverso è un metodo adeguato). Dopo l'aggiunta della lettura del buffer, eseguire la scansione immediatamente la piastra nel SettoreImager.
2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB e cTnI Assay
- A soluzioni di 96 pozzetti 3-plex e diluente sono autorizzati a stabilizzare a RT prima dell'uso. Questo piatto è pre-rivestita con anticorpi di cattura per cMyBP-C, CK-MB e cTnI da MSD.
- Aggiungere 25 ml di 1% (w / v) bloccante A / PBS ad ogni pozzetto. Toccare i lati della piastra per assicurarsi che l'intera ben è coperto da soluzione.
- Sigillare la piastra con un foglio sigillante, collocare la piastra su un agitatore, e agitare a 700 rpm per 30 min.
- Nel frattempo, viene preparata una serie di diluizioni di singoli calibratori. Poiché ogni bene ha tre anticorpi di cattura tre calibratori devono essere miscelati e diluiti serialmente prima dell'uso. Diluire ricombinante cMyBP-C, CK-MB (MSD), e cTnI (MSD) insieme in 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare un campione con 2.000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, e 25 ng / ml di cTnI (campione A).
- Un volume finale di almeno 100 microlitri viene preparato per ciascuno standard. Acompletano la serie standard, serie diluire i campioni sono di un fattore 5. Utilizzare 25 microlitri del campione A in 100 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare campione B. Quindi utilizzare 25 microlitri di campione B in 100 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare campione C e così via. Campioni di siero umano di 16 soggetti con infarto miocardico e 16 soggetti di controllo sono stati usati per misurare i livelli di cTnI cMyBP-C, CK-MB e. Questi campioni sono stati diluiti in 2x 1% (w / v) bloccante A / PBS.
- Aggiungere 25 ml di standard e di campione diluito al 25 microlitri già presente nei pozzetti della piastra 3-plex. È importante anche includere uno spazio (solo diluente). Di stabilire la tecnica, i campioni vengono caricati in triplicato tecnici. In caso contrario, i duplicati sono sufficienti.
- Sigillare nuovamente la piastra (sigillante può essere riutilizzato) e incubare su un agitatore (700 rpm) a temperatura ambiente per 2 ore.
- Appena prima l'incubazione è terminata, la soluzione di anticorpo di rivelazione è preparato. Il diluente utilizzato è 1% (w / v) Un bloccante in PBS. Tutti thranticorpi di rivelazione ee SULFO-tag vengono diluiti insieme in una concentrazione finale di 1 mg / ml ciascuno. Anticorpi di rilevamento sono di norma forniti a una concentrazione magazzino 50x.
- Per una completa piastra a 96 pozzetti, è necessaria 2,700 ml di soluzione totale diluita (con pipettaggio errore inclusa). Aggiungere 54 ml di ogni anticorpo di rilevazione 2.538 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS.
- Dopo 2 ore, togliere le soluzioni da vigorosamente sfogliando la piastra sopra un lavandino. Lavare i pozzetti 3 volte con 150 ml di 0,05% Tween-20 in PBS. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpo di rilevazione ogni pozzetto usando una pipetta multicanale, ei lati della piastra sono nastrate per assicurare che l'intera ben è coperto da soluzione.
- Sigillare la piastra e incubare per 1 ora agitando a 700 giri al minuto.
- Durante il periodo di incubazione, eseguire MSD di demo-piastra (piastra con luci a LED) per garantire il corretto funzionamento del Imager Settore e del software. Anche diluire la lettura del buffer, che è fornito da MSD, aggiungendo 5 ml di 4x letturatampone a 15 ml di acqua distillata.
- Ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 2.8.
- Aggiungere 150 ml di buffer di lettura ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Evitare bolle d'aria è fondamentale (pipettaggio inverso è un metodo adeguato). Dopo l'aggiunta della lettura del buffer, eseguire la scansione immediatamente la piastra nella Imager Settore.
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Representative Results
I principi di base e flusso del saggio 3-plex sono riportati nella Figura 1, e il flusso di lavoro complessivo è descritto nella Tabella 1. Saggi Uniplex funzionano lungo lo stesso principio, tranne che l'intero fondo pozzo viene rivestito con un anticorpo di cattura. Rilevazione del segnale è fatto da ECL in cui un segnale elettrico viene applicato al fondo del pozzo. Questo, a sua volta, avvia una produzione locale di luce attraverso una reazione chimica del buffer di lettura con l'etichetta SULFO-TAG sul anticorpo di rilevazione. Questo porta al fondo a bassa e alta sensibilità del test. Nella figura 2, la curva standard di cMyBP-C nel saggio Uniplex è confrontata con quella di cMyBP-C nel saggio 3-plex. Entrambi i saggi mostrano una sensibilità molto elevata e un elevato range dinamico. Livelli di rilevamento ei livelli di quantificazione sono riportati nella Tabella 2 e sono paragonabili in entrambi Uniplex e saggi di 3-plex. Livelli di rilevamento per la cTnI e CK-MB sono alsO mostrato nella figura 3 e nella tabella 2. Variabilità inter-operatore è stata determinata misurando campioni identici (n = 2, 3 tecnico replica) da due diversi operatori e la variabilità è stato trovato ad essere basso (CV 8,5%). Reattività incrociata di anticorpi di rilevazione con le altre due calibratori stato studiato incubando singole curve standard di tutte e tre calibratori con anticorpi di rivelazione singoli (Figura 4). Solo bassa quantità di cross-reattività è stata osservata tra CK-MB calibratore e sia cTnI e anticorpi di rivelazione cMyBP-C mentre è stata osservata alcuna reattività crociata tra gli altri calibratori e anticorpi di rivelazione.
Come prova dell'applicabilità del test per la rilevazione di danno cardiaco, i livelli sierici di 16 soggetti con MI stati confrontati con un gruppo di controllo (n = 16). Utilizzando la piastra 3-plex, i livelli sierici di cMyBP-C, CK-MB e cTnI sono stati determinati. Tutti e tre i biomarcatori sono stati aumentati nei soggetti MI (vediFigura 5) da 3,7 volte (cMyBP-C) a 12,2 volte (CK-MB), anche se variazioni dei livelli sierici è stata la più bassa nel gruppo cMyBP-C.
| Processo | Uniplex test | Test 3-plex | |
| Esperimento giorno 0 | Piastra Cappotto con anticorpo di cattura | Per una notte | N / A |
| Esperimento 1 giorno | Bloccare la piastra | 1 ora | 30 min |
| Preparare i campioni e le serie standard | |||
| Incubare con i campioni e gli standard | 1 ora | 2 hr | |
| Incubare con anticorpo di rilevazione | 1 ora | 1 ora | |
| Aggiungere il reagente di rilevamento e di leggerepiastra |
Tabella 1. Panoramica del flusso di lavoro di Uniplex e saggi multiplex.
| LLOD (ng / ml) | LLOQ (ng / ml) | ULOQ (ng / ml) | |
| cMyBP-C (Uniplex) | 0,126 ± 0,007 | 0,567 ± 0,073 | 400 ng / ml |
| cMyBP-C (3plex) | 0,057 ± 0,022 | 0,469 ± 0,171 | 400 ng / ml |
| CK-MB (3-plex) | 0,038 ± 0,014 | 0,587 ± 0,213 | 100 ng / ml |
| cTnI (3plex) | 0,033 ± 0,011 | 0,147 ± 0,053 | 25 ng / ml |
Tabella 2. Limiti di rilevazione dei Uniplex e calibratori 3-plex. LLOD, limite inferiore di rilevamento, è definita come la concentrazione calcolata del segnale del fustellato + 3 volte la deviazione standard dei campioni bianchi. LLOQ, limite inferiore di quantificazione, è definito come un valore superiore rispetto LLOD, con un coefficiente di variazione (reciproco del rapporto segnale rumore) inferiore al 20%, ed un recupero tra 80 - 120%. ULOQ, limite superiore di quantificazione, è definito come la più alta concentrazione risultante che può essere misurata con un coefficiente di variazione inferiore al 20% e un recupero tra 80 - 120%.
Figura 1. È mostrato Schema del piatto e del flusso di lavoro. A) 96 pozzetti. Ogni pozzetto è rivestito con tre differenti anticorpi di cattura, cioè contro cMyBP-C, CK-MB e cTnI. Il quarto inutilmenteposto in grado non viene utilizzato ed è rivestita con BSA. B) Flusso di lavoro del 3-plex ELISA. La piastra di pre-rivestito (step 1) è bloccato e poi campioni di siero o dei calibratori vengono aggiunti a ciascun pozzetto e lasciata legarsi (passo 2). cMyBP-C (diamanti rossi), CK-MB (rettangolo verde) e cTnI (arancione ovale) si legano ai loro rispettivi anticorpi di cattura. Dopo aver lavato via le proteine non legate, vengono aggiunti gli anticorpi di rilevazione solfo-Tag-etichettati (fase 3). Essi si legano alla cMyBP-C, CK-MB, o proteine cTnI che sono vincolati alla loro anticorpo di cattura. Dopo aver lavato via la rilevazione di anticorpi non legato, viene aggiunto buffer di lettura e la piastra viene analizzato. Un segnale elettrico al fondo della piastra inizio a una reazione chimica locale della SULFO-TAG con il buffer di lettura, che porta alla produzione di luce (fase 4). La quantità di luce è direttamente proporzionale alla quantità di SULFO-TAG anticorpo marcato legato rilevamento. Il CCD ricorde la luce e possono distinguere i diversi punti all'interno di ogni bene e quindi il segnale proveniente da ciascun analita (fase 5).
Figura 2. Curva standard di cMyBP-C calibratore misurata in Uniplex o in 3-plex. La stessa serie standard è stata misurata in un saggio Uniplex, e sul piatto 3-plex. La serie standard iniziata a 2.000 ng / ml ed è stato diluito serialmente 5x con la concentrazione più bassa è 0,128 ng / ml. Inoltre, diluente è stato utilizzato un campione bianco. L'area di rilevazione del test viene visualizzato in grigio. La riga inferiore indica il limite inferiore di rilevamento (LLOD), che è definito come la concentrazione calcolata del segnale di vuoto + 3 volte la deviazione standard dei valori di bianco. Il limite superiore di rilevamento è definito come tegli concentrazione più alta della serie standard che può essere misurato attendibilmente. Entrambi Uniplex e 3-plex cMyBP-C curve standard sono comparabili. Limiti di rilevabilità sono illustrati nella tabella 2. au: unità arbitrarie.
Figura 3. Curve standard di CK-MB e cTnI. Le curve standard di CK-MB e cTnI, che sono state misurate simultaneamente con cMyBP-C sul piatto 3-plex. Entrambi i calibratori mostrano un'elevata sensibilità e una grande gamma dinamica. In grigio viene visualizzata l'area di rilevamento del test. La riga inferiore indica il limite inferiore di rilevamento (LLOD), che è definito come la concentrazione calcolata del segnale di vuoto + 3 volte la deviazione standard dei valori di bianco. Il limite superiore di rilevamento è definito come la più alta concentrazione dello standard SE Ries, che può essere valutato attendibilmente. Limiti di rilevabilità sono illustrati nella tabella 2. au: unità arbitrarie.
Figura 4. Cross-reattività di anticorpi di rilevamento 3-plex. Distinte curve standard di cMyBP-C, CK-MB e cTnI sono state preparate e incubate sul piatto 3-plex. Ciascuna curva standard era che sondato con anticorpi di rivelazione individuali, per valutare la quantità di cross-reattività tra anticorpi di rivelazione individuali (ad esempio cMyBP-C) e le altre calibratori (ad esempio CK-MB e cTnI). Cross-reattività era basso nel test 3-plex. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5 "fo: contenuti-width =" 3in "fo: src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50786/50786fig5.jpg "/>
Figura 5. Livelli dei biomarcatori nel siero di MI e soggetti di controllo misurati con dosaggio 3-plex. Livelli di cMyBP-C, CK-MB e cTnI sono stati misurati simultaneamente da saggio 3-plex in campioni di siero di 16 soggetti di controllo e 16 soggetti con infarto miocardico. I dati vengono visualizzati da Box e whisker (baffi rappresentano il 10 ° e il 90 ° percentile). Aumento dei livelli di tutti e tre i biomarcatori sono stati osservati nel siero di soggetti con MI rispetto al gruppo di controllo. Poiché i dati non mostrano una distribuzione normale (provato da D'Agostino Pearson Omnibus), il test statistico di Mann-Whitney non parametrico è stato utilizzato per verificare le differenze tra i gruppi di controllo e MI. # P <0.001
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Discussion
In questo studio, mostriamo l'applicabilità di un immunodosaggio multiplex per la rilevazione di più marcatori cardiaci nel siero di pazienti. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto tradizionale ELISA. Prima, nel kit ECL saggio è usato invece di rilevazione colorimetrica. In ECL, un segnale elettrico stimola la produzione locale di proprietà misurate (luce), quindi sganciare l'evento stimolazione dal segnale, che riduce sfondo 14. Questo permette di elevata sensibilità, come si può vedere nella tabella 2.
Multiplexing il saggio non comporti una perdita di sensibilità per la rilevazione di cMyBP-C, come si può vedere in Figura 2 e Tabella 2. cMyBP-C misurato in Uniplex ha mostrato una gamma di sensibilità e di rilevamento paragonabile a cMyBP-C misurato simultaneamente con CK-MB e cTnI 13. Misure simultanee di ridurre considerevolmente il livello di campione necessaria per measurements, che può essere un fattore critico quando si lavora con campioni biologici rari, oltre a ridurre il tempo speso l'esecuzione di più saggi Uniplex.
Come con qualsiasi immunologico, il saggio è altamente dipendente dalla qualità degli anticorpi utilizzati. L'affinità, specificità e avidità degli anticorpi di cattura e rilevazione è il determinante principale della sensibilità del saggio 15. Diverse coppie di anticorpi devono essere provati per vedere quale combinazione di anticorpi di cattura e la rilevazione dà la più alta sensibilità e la gamma dinamica. Quando si utilizzano tecniche di multiplazione, gli anticorpi di cattura devono essere rivestite macchia sul pozzo. Ciò significa che un basso volume, soluzione altamente concentrata viene depositata su parte del pozzo (vedi Figura 1) in contrasto con rivestimento soluzione usata nel saggio Uniplex o in ELISA convenzionale. Deve essere valutato se l'anticorpo di cattura effettua come pure con rivestimento macchia come fa con rivestimento in soluzione. Cross-reattività dianticorpi o calibratori con un altro paio di anticorpi possono anche dare origine a risultati falsi-positivi 2,15.
Per questo studio, una piastra multiplex su misura è stato progettato in collaborazione con MSD. Anche se una serie di piastre multiplex pre-rivestite sono disponibili in commercio, questa particolare innovazione necessari l'ottimizzazione del saggio perché un romanzo (cMyBP-C) obiettivo è stato multiplati con saggi di catalogo precedentemente ottimizzate (CK-MB e cTnI). Come tale, l'ovvio inconveniente di questo metodo è il requisito aggiunto per un lettore di piastre specializzato e piastre contenenti elettrodi per rilevare il segnale ECL. Sebbene l'esecuzione di un test multiplex contro molteplici saggi Uniplex consentirà di ridurre i costi complessivi, un lettore di piastra deve essere inizialmente acquistato 2.
Utilizzando la immunologico 3-plex i livelli di biomarcatore rilascio di cMyBP-C, CK-MB e cTnI è stata misurata in soggetti con infarto miocardico e confrontati con un gruppo di controllo. Il cambio piega aumento rispetto thgruppo di controllo e differiva tra i tre biomarker (vedere Figura 4), così come la variazione nel gruppo MI. Variazione nei livelli di biomarker è previsto in una raccolta di pazienti MI, come i tempi di prelievo di sangue, dimensioni dell'infarto, così come una serie di altri fattori che possono contribuire al rilascio di proteine cardiache e la loro successiva degradazione nella circolazione. Se il livello dei singoli biomarker correlano con parametri clinici, come la dimensione infartuale, richiede ulteriore studio.
Traducendo direttamente questi risultati per utilizzare al pronto soccorso per rilevare MI richiede una serie di sfide da superare. Primo fra tutti è il tempo il protocollo necessario per produrre risultati, che anche con piastre di pre-rivestite vogliono 3 ½ ora. Come per i test della troponina utilizzati oggi, il dosaggio dovrebbe essere ottimizzato per il rilevamento veloce, permettendo la diagnosi rapida.
In conclusione, abbiamo sviluppato un saggio di firma in cui due si conosconon biomarcatori cardiaci e un potenziale biomarker cardiaci, cMyBP-C, sono state dimostrate per rilevare simultaneamente la presenza di danno miocardico nei pazienti con infarto miocardico di quantificazione di proteine cardiache titoli sierici.
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Disclosures
Un'applicazione completa di brevetto è in corso (Applicazione di serie n ° 13/464, 466, Pub No. US 2012/0282618 A1 e Data:. 05/04/12) per determinare i fattori di rischio connessi con il degrado cMyBP-C e il rilascio nel liquido corpo umano e quantificare il livello di cMyBP-C in fluido corporeo umano.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan), e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Gli autori ringraziano l'assistenza del dottor Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, per la loro eccellente supporto tecnico e la letteratura nello sviluppo del test.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant | Meso Scale Discovery | R92TC-2 | |
| Tween-20 | Acros | 9005-64-5 | |
| MSD Blocker A | Meso Scale Discovery | R93BA-1 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher BioReagents | BP399-4 | Filter before use |
| Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free | Santa Cruz | SC-137180L | For coating, antibody has to be gelatin free |
| Plates and Equipment | |||
| Multi-Array 96-well standard plate | Meso Scale Discovery | L15XA-3 | |
| A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB | Meso Scale Discovery | N452A-1 | |
| ThermaSeal Sealing Film | Life Science Products Inc. | ST-3098 | |
| MSD SECTOR Imager 2400A | Meso Scale Discovery | ||
| MTS 2/4 digital microtiter shaker | IKA | 3208001 | |
References
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